Summary
我们提出了一种用于构建简单孢子分布系统的协议，该系统由具有~50μm网格的接种盒和透明塑料室组成。这可用于用白粉病孢子均匀地接种植物，从而能够准确和可重复地评估所研究植物的疾病表型。
Abstract
减少真菌病害造成的作物损失需要更好地了解控制植物免疫和真菌发病机制的机制，这反过来又需要准确确定植物在感染特定真菌病原体时的疾病表型。然而，使用不可培养的生物营养真菌病原体（如白粉病）进行准确的疾病表型并不容易实现，并且可能是研究项目的限速步骤。在这里，我们以拟南芥-白粉病相互作用为例，开发了一种安全、高效且易于操作的疾病表型系统。该系统主要由三个部分组成：（i）一个木制接种盒，配有一个可拆卸的盖子，该盖子装有~50μm孔的不锈钢或尼龙网，用于用真菌孢子接种植物，（ii）带有小前开口的透明塑料室，用于在内部进行接种时最大限度地减少孢子逃逸， 以及（iii）孢子移位和分配方法，以实现均匀有效的接种。 此处描述的方案包括以低成本制作接种盒和塑料室的步骤和参数，以及如何使用该系统均匀接种白粉病孢子的视频演示，从而提高疾病表型的准确性和可重复性。
Introduction
白粉病是众多粮食作物和观赏植物中最常见和最重要的疾病之一1。对白粉病的研究非常受欢迎，Web of Science 的搜索结果中有超过 10，500 篇出版物以“白粉病”为关键词（截至 2020 年 11 月）。事实上，白粉病（以灰褐色白粉病为代表）被《分子植物病理学杂志》杂志2认为是十大真菌病原体之一。疾病易感性的定量是表征有助于抗病性或易感性的植物基因或功能鉴定白粉病候选效应基因的必要步骤。然而，与大多数其他真菌病原体相比，白粉病的可靠疾病表型更具挑战性，部分原因是，与后者的孢子不同，白粉病物种的孢子（例如基于我们的实验室经验的Golovinomyces cichoracearum UCSC1）在经历水悬浮过程后显示出生存能力降低3，4.用特定的白粉病病原体接种试验植物的不足和/或不均匀可能导致表型结果不准确。
报告了许多用于白粉病研究的接种方法。这些包括（i）直接从受感染的叶子中刷孢子以测试植物5，（ii）喷洒孢子悬浮液以测试植物6，（iii）使用真空操作的沉降塔将孢子吹到塔7底部的植物，以及（iv）通过组合使用尼龙网膜和基于声音的振动8来输送孢子.孢子刷（或除尘）方法易于执行，但本质上不均匀，因此可能无法准确进行定量评估。孢子喷洒方便均匀，但如上所述可能导致孢子萌发不良4.后两种（即iii-iv）是能够实现均匀接种的改进方法;然而，两者都不能灵活地根据单个事件中要接种的植物数量来调整其接种能力，这使得任何一种设备都不是微不足道的，并且它们的操作仅限于有真空和/或电源的实验室区域。
我们的实验室从事植物-白粉病相互作用已有20多年的历史9，10。在过去的十年中，我们测试了许多接种方法，最近开发了一种简单而有效的白粉病接种方法。这种基于网眼的孢子刷法可以确保均匀接种，并且简单且可扩展，因此任何处理白粉病的实验室都应该很容易采用。
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Protocol
1. 制作标准接种盒，带有可拆卸的顶盖，并安装有网眼
- 从商店购买一卷50 μm尼龙膜网或48 μm不锈钢网（推荐）。确保订购足够的量，以切割成多块 14 英寸 x 26 英寸的网眼，以更换磨损的网眼。
- 购买一块 1/4 英寸 x 2 英尺 x 4 英尺的中密度纤维板或胶合板，并切下两个 24-1/2 英寸 x 10 英寸的碎片和两个 12 英寸 x 10 英寸的碎片，用于制作接种盒。使用 8 个角夹支撑四个侧面。
注：如果面向盘柜的宽边，则左侧 12 英寸 x 10 英寸的侧面永久连接，右侧 12 英寸 x 10 英寸的侧面是由四个磁性锁扣固定到位的可拆卸门（图 1A、B）。 - 在左侧的内角各放置四个 2 英寸的角支架，距顶部一英寸，距底部一英寸，标记并钻一个孔。使用螺钉将左短边永久连接到两个长边（正面和背面）。两个长边之间的内距离应为 12 英寸，而不是 11-1/2 英寸。
- 在角夹仍然就位并且右侧门正确对齐的情况下，标记并钻孔 4 个磁性锁扣的位置，以将右侧可拆卸门固定到位。将按钮旋钮安装到门上。门的顶部卡在顶盖下方（图1A，B）。
- 要制作带有网眼的可拆卸顶盖，请将长木方形销钉切成 2 组 26 英寸和 12-3/4 英寸。将这四块东西粘合并钉在盒子周围 - 框架的内部尺寸比盒子的外部尺寸大一点，因为屏幕网格将连接到这个框架上。
- 将筛网切割成略小于 14 英寸 x 26 英寸。不要让屏幕突出到框架之外，以防止锋利的边缘。帮助拉伸框架上的屏幕。用夹子将网格与框架固定（图1C），并使用带有正确订书钉的订书枪将屏幕固定在框架上。
- 切割两组较短的木制方形销钉（21 英寸和 9 英寸），并使用螺钉使用 4 块较短的木制方形销钉将网格紧紧地夹在框架上（图 1C、D）。
2. 制作接种室
- 从适当的商店购买透明亚克力板和五金件。在盒子的正面亚克力板上切一个 7 英寸 x 20 英寸的开窗，如图 2C 所示。
- 使用8个角夹将左右两侧，前（带窗口）和后亚克力板组装到一个盒子中，如图 2A所示。确保腔室的内部尺寸等于顶板的尺寸。
注：右侧用于支撑，不会连接到前板或后板。它故意比其他床单短 1/2 英寸。该右侧将成为“向下拉”的“翻板”门，由底部的直角铰链和顶部的两个磁性锁扣固定到位，如图 2C，D所示。 - 使用角撑将面板固定在一起（图 2B，C）。将牙套固定到位，用锋利的记号笔做标记，打中心，然后钻孔。
注意：钻亚克力不同于钻其他任何东西，不要用力否则钻头对面的孔的侧面可能会开裂。使用铆钉或螺钉。不要过度拧紧螺钉，否则丙烯酸可能会随着时间的推移而破裂。 - 将外壳背面转动，卸下 4 个角夹并将顶板定位到位。标记和钻孔。
- 安装由 3/4 英寸角支架制成的直角铰链。使用尼龙固定锁紧螺母作为铰链杆。不要拧紧，留下间隙，以便门在此铰链上旋转。
- 标记、中心冲孔、钻孔并使用 #6-32x3/4“ 盘头螺钉连接两个磁性门磁铁。然后用#6-32x3/8“平头螺钉连接锁板，见 图2C，D。
3. 在公寓内接种植物
- 准备新鲜的白粉病孢子作为接种物（例如，拟南芥白粉病戈洛维诺菌 UCSC1）。在生长室（22°C，65%相对湿度6-8周）中生长干净的拟南芥免疫受损的pad4-1突变植物11，并接种一个或半平的pad4-1植物以建立足够的新鲜白粉病孢子（图3A）。
- 种植用于确定感染表型的植物，标准 11 英寸 x 21 英寸 x 2.5 英寸。
注意： 拟南芥 植物在短日照（8小时光照，16小时黑暗;22°C）下生长六至八周，适用于白粉病感染试验。 - 当接种后8-10天（dpi）有来自受感染植物的新鲜白粉病孢子可用时，将一株植物移动到接种室内的接种箱中进行感染测试（图1B，2C）。
- 切下15-20片严重感染的 拟南芥 叶（或4-6片受感染的莲座结，取决于叶子/莲座结的大小和接种水平），如果有冷凝水，让叶子干燥。
- 用一只手用一对长镊子抓住 1-2 片叶子或玫瑰花结，将叶子倒置。然后，将双手穿过腔室的开口，用一把剪刀轻轻地敲击镊子的手臂，同时缓慢地将叶子/玫瑰花结移动到安装在接种盒上的网格上方（图3B）。重复此操作，直到使用完所有叶子或玫瑰花结。
注意：成熟的孢子很容易从受感染叶子的分生孢子中脱落。尝试尽可能均匀地去除网状物上的孢子。 - 使用一个或两个细风扇搅拌刷轻轻地将孢子刷过网状物（图3C）。确保将网格的整个表面沿不同方向刷四次或更多次，以最大限度地提高孢子均匀分布到接种箱底部的植物上（图3D）。用刷子轻轻拍打网眼几次，以甩掉卡在网眼中的孢子。
- 让孢子沉淀半分钟。然后，从接种箱中移出包含接种植物的平板。用塑料圆顶覆盖平板并将其放置在生长室（22°C，65%相对湿度）中。疾病表型可以在 5 或 8 至 12 dpi 12 进行。
4. 用较小的接种箱接种植物
注意：在接种植物较少的情况下，仍然可以使用标准接种盒。确保将植物放在盒子的中间。在覆盖植物的网状物区域移开并刷刷孢子，以确保所有植物都接种，同时保存接种物。或者，优选地，可以使用较小的接种盒（如下所述）。
- 将纸板箱转换为接种箱。只需取下盒子的顶部和底部，必要时用胶带粘住角落以使其牢固，并通过胶合或装订在顶部安装适当尺寸的 50 μm 网格（图 4A，B）。
- 将包含植物的平板移至接种室内，将较小的接种盒放在平板顶部以覆盖植物。
- 如上所述去除并刷去孢子。
5. 在培养皿中接种分离的叶子
注意：在（i）新鲜白粉病孢子非常有限和/或（ii）植物必须保持清洁的情况下，同时需要评估感染细胞中的疾病表型和/或蛋白质亚细胞定位，分离的叶子可用于MS琼脂平板中的感染。
- 制作一个仅比培养皿略大的迷你接种盒。
- 准备 1/2 强度的 Murashige 和 Skoog （MS） 培养基琼脂 （1.5%） 平板。如果需要，添加噻苯达唑（40毫克/升）以减少霉菌污染。将盘子在4°C下储存在冰箱中直至使用。
- 从叶柄的基部切下一片或两片完全展开的叶子，用于每株要测试的植物。将分离叶的叶柄以~30°的角度插入琼脂培养基中。
注意：每个板可以包含20-40个叶子，具体取决于叶子的大小和使用的板（图4C）。 - 如上所述，在接种室内接种叶子。将带盖的板移动到生长室。
- 切下叶子的一小部分，并检查蛋白质在特定时间点的亚细胞定位。
- 为了评估感染表型，将叶子转移到4或5 dpi的新鲜无菌MS琼脂平板上。切下叶柄的基部，然后将叶子插入新鲜琼脂培养基中。以 8 或 9 dpi 评估疾病表型。
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Representative Results
在这里，我们提出了一种新的白粉病孢子接种方法，该方法易于制备，操作和调整。 图1 显示了标准接种盒的组装，重点是用50μm膜网安装的可拆卸盖子的制造。 图2 显示了接种室的组装。 图3 说明了使用该系统进行接种过程的关键步骤。 图4 显示了可用于接种整个扁平或更少的植物，或在MS琼脂培养基上接种分离的叶子的其他接种盒。最后， 图5 提供了数据来证明由孢子分布或植物感染表型反映的接种均匀性。
图1.制作接种盒。（A-B） 照片显示盒子关闭门（A）或打开以插入 拟南芥 植物（B）。请注意，一对柜门磁性锁扣用于固定门。 （C） 一张照片，显示将网格安装到矩形框架上，这是制作盒子盖的关键步骤。注意夹子和角托用于在用螺丝钉固定网格之前定位网格。 （D-E） 照片显示了装有新不锈钢网（D）或组装盒（E）的盒子的可拆卸盖子。请注意，网格固定在 3/4 英寸的木质方形销钉之间，指示长度为 D 和 E。黄线突出显示了盒子的尺寸测量值。拥有适合标准平板的接种盒可以大大提高表型效率，特别是当要接种大量植物时（例如，在遗传筛选期间）。安装有网眼的可拆卸盖子使网眼的清洁或更换更加容易。 请点击此处查看此图的大图。
图2.制作接种室。 （A） 使用角夹初步组装四块亚克力板的照片。 （B） 一张自上而下查看塑料室的照片。 （中四） 照片显示了完全组装的接种系统（C），以及安装在一侧丙烯酸板作为门的两个磁性锁扣（上）和直角铰链（底部）之一（D）。请注意，接种窗口用于用户移位和刷拭孢子（用散线表示）。黄线突出显示了盒子的尺寸测量值。有一个接种室是一个加号，但没有它，仍然可以在小的风静止室或环境中使用接种盒进行接种。 请点击此处查看此图的大图。
图3.接种过程图示。（A） 显示指定植物叶片上的新鲜白粉病的图片。 （B） 一张图片，显示如何通过轻轻敲击抓住受感染叶子的镊子来甩掉网状物上的孢子。 （C） 图片显示两个精细的风扇搅拌刷和在网眼上轻轻刷拭孢子。 （D） 示意图，显示孢子在网状物上刷的方向，有助于使接种箱底部的植物上的孢子均匀分布。重要的是要指出，使用新鲜孢子进行接种对于成功感染至关重要。根据我们的经验，在8至12 dpi之间的受感染叶子上产生的分生孢子是新鲜的，可以通过摇晃轻松脱落。 请点击此处查看此图的大图。
图4.用于感染测试的简单临时纸板接种盒。（A） 用于在标准公寓中接种植物的纸板箱。 （B） 中型接种箱，用于接种较少的植物。（C） 一个小接种盒，用于在含有MS-琼脂培养基的方形培养皿中接种分离的叶子。黄线突出显示了盒子的尺寸测量值。如果其他尺寸的纸板箱适合包含待测试植物的平板，则可以使用它们。不应使用塑料盒，因为孢子会因其静电而被吸引到塑料表面。 请点击此处查看此图的大图。
图5.评估接种均匀度。（A） 示意图，显示平面底部六个显微载玻片的位置。右侧的代表性显微照片显示了大量接种后载玻片上的均匀孢子分布。比例尺 = 200 μm。 （ B ）条形图显示分布在六个位置（1至6）的孢子密度，如（A）所示，在用来自4个（用于轻度接种）或15个（用于重接种）的孢子进行三次模拟接种后，完全扩增的 Pad4-1 植物的感染叶。计算每个载玻片顶部由网格玻璃盖玻片（来自ibidi USA Inc.或自制）分隔的4 x 0.25 cm2 区域内的孢子。在两种接种方案中，六张载玻片之间的孢子密度没有显着差异（学生 t检验; p > 0.5）。误差线表示SD。 （C） 拟 南芥 Col-0野生型和 pad4-1 突变体的代表植物在重度接种后12天感染了 G. cichoracearum UCSC1。请注意，与Col-0植物相比，所有 pad4-1 植物都显示出更强的疾病易感性。多种因素决定了接种均匀度。一般来说，当使用足够的接种物达到>50个孢子/cm2的密度时，相对容易实现均匀接种。通过摇晃脱落的新鲜分生孢子可以很容易地分解并单独刷过网格。老分生孢子或死分生孢子容易形成聚集体，因此难以移开和分散。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
与其他接种方法相比，我们基于网状盒的接种方法具有几个优点。首先，如果操作得当，可以实现孢子的均匀分布，如图 5所示。其次，使用~50μm网眼，加上通过轻轻摇动受感染的叶片来去除孢子，可以减少源植物中存在的蓟马或其他植物感染昆虫的植物感染。第三，使用不同大小的接种盒在塑料室内接种植物或分离的叶子（两者都可以通过喷洒75%乙醇轻松清洁）可以更有效地利用接种物并减少交叉污染。我们发现在整个接种过程中，没有或很少有真菌孢子从接种室中逸出。
高质量的接种盒是确保均匀接种的关键。我们发现标准接种盒可用于接种拟南芥的幼苗和成熟植物（图1），草莓幼苗，母猪蓟和 本氏猪笼草 （未显示）。如果植物高于五英寸，盒子的高度可以进一步增加，以确保从网眼到下面的植物有足够的距离（> 5英寸），以实现均匀的孢子分布。塑料室的高度也可以相应增加，以允许足够的空间在接种盒顶部操纵孢子移位和刷洗。
将~50 μm选择的网孔均匀而紧密地安装到接种盒的盖子上很重要，需要格外小心。孔径略大于直径为30-40μm的白粉病孢子。盖子可以在使用后用自来水清洗或喷洒75%乙醇来清洁。我们建议使用48μm不锈钢网，因为网更耐用，使用寿命更长。
接种室创造了一个静止的风环境，并最大限度地减少孢子移位和/或刷牙过程中的孢子逃逸。腔室由透明塑料玻璃制成，因此用户在刷牙前可以用肉眼看到脱落的孢子是否或多或少均匀地分布在网眼上。如果需要光照甚至接种，这一点尤其重要。在不同方向上轻柔而快速地刷洗也很重要，因为它可以分散聚集的孢子并将它们单独推过孔隙，在孢子落下并沉淀到接种盒底部后实现均匀分布。 为了便于处理，接种室应放置在具有适当高度的桌子上，以便可以通过室的窗户用手轻松完成孢子移位和刷洗。
基于网状盒的接种可以通过使用不同尺寸的接种盒来扩大或缩小。简单的临时网状接种盒易于制作，如果使用得当，可以达到令人满意的结果。诚然，与真空操作的沉降塔方法7接种相比，该方法在孢子移位和刷洗方面可能需要更长的时间。 此外，对于接种大而高的植物，这里描述的标准接种箱可能太小，因此必须使用更大的接种箱和更大的腔室来实现均匀接种。 对于某些植物物种，如烟草和黄瓜，可以用这种方法接种分离的叶子或子叶，以评估整个植物的疾病易感性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会（IOS-1901566）对S. Xiao的支持。作者要感谢F. Coker和C. Hooks维护植物生长设施，并感谢Jorge Zamora在制造接种盒和接种室方面提供的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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