Summary
हम एक साधारण बीजाणु-वितरण प्रणाली के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें ~ 50 μm जाल और एक पारदर्शी प्लास्टिक कक्ष के साथ एक टीकाकरण बॉक्स शामिल है। इसका उपयोग पाउडर फफूंदी बीजाणुओं के साथ पौधों को समान रूप से टीका लगाने के लिए किया जा सकता है, जिससे अध्ययन के तहत पौधों के रोग फेनोटाइप के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन को सक्षम किया जा सकता है।
Abstract
फंगल रोगों के कारण फसल के नुकसान को कम करने के लिए पौधों की प्रतिरक्षा और फंगल रोगजनन को नियंत्रित करने वाले तंत्र की बेहतर समझ की आवश्यकता होती है, जिसके बदले में किसी विशेष फंगल रोगज़नक़ के संक्रमण पर पौधों के रोग फेनोटाइप के सटीक निर्धारण की आवश्यकता होती है। हालांकि, पाउडर फफूंदी जैसे अविचलित बायोट्रोफिक फंगल रोगजनकों के साथ सटीक रोग फेनोटाइपिंग प्राप्त करना आसान नहीं है और यह एक शोध परियोजना का दर-सीमित कदम हो सकता है। यहां, हमने एक उदाहरण के रूप में एराबिडोप्सिस-पाउडर फफूंदी बातचीत का उपयोग करके एक सुरक्षित, कुशल और आसानी से संचालित रोग फेनोटाइपिंग प्रणाली विकसित की है। इस प्रणाली में मुख्य रूप से तीन घटक होते हैं: (i) फंगल बीजाणुओं वाले पौधों के एक फ्लैट को टीका लगाने के लिए ~ 50 μm के स्टेनलेस स्टील या नायलॉन छिद्रों के साथ एक हटाने योग्य ढक्कन से सुसज्जित लकड़ी का टीकाकरण बॉक्स, (ii) अंदर टीकाकरण करते समय बीजाणु पलायन को कम करने के लिए एक छोटे से सामने के उद्घाटन के साथ एक पारदर्शी प्लास्टिक कक्ष, और (iii) सम और प्रभावी टीकाकरण के लिए बीजाणु-विघटन और वितरण विधि। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कम लागत पर टीकाकरण बॉक्स और प्लास्टिक चैंबर बनाने के लिए चरण और पैरामीटर शामिल हैं, और पाउडर फफूंदी बीजाणुओं के साथ टीकाकरण को सक्षम करने के लिए सिस्टम का उपयोग कैसे किया जाए, जिससे रोग फेनोटाइपिंग की सटीकता और प्रजनन क्षमता में सुधार होता है।
Introduction
पाउडर फफूंदी कई खाद्य फसलों और सजावटीपौधों के सबसे आम और महत्वपूर्ण रोगों में से एक है। पाउडर फफूंदी रोगों का अध्ययन बहुत लोकप्रिय रहा है, जैसा कि 10,500 से अधिक प्रकाशनों द्वारा स्पष्ट है कि वेब ऑफ साइंस (नवंबर 2020 तक) में प्रमुख शब्द के रूप में "पाउडर फफूंदी" के साथ खोज परिणाम है। दरअसल, पाउडर फफूंदी (ब्लूमेरिया ग्रामिनिस द्वारा दर्शाया गया) को आणविक संयंत्र पैथोलॉजी2 की पत्रिका द्वारा शीर्ष 10 फंगल रोगजनकों में से एक माना जाता है। रोग संवेदनशीलता का परिमाणीकरण रोग प्रतिरोध या संवेदनशीलता में योगदान देने वाले पौधों के जीन के लक्षण वर्णन में एक आवश्यक कदम है, या पाउडर फफूंदी में उम्मीदवार प्रभावक जीन की कार्यात्मक पहचान। हालांकि, विश्वसनीय रोग फेनोटाइपिंग अधिकांश अन्य फंगल रोगजनकों की तुलना में पाउडर फफूंदी के साथ कहीं अधिक चुनौतीपूर्ण है, आंशिक रूप से क्योंकि, बाद के बीजाणुओं के विपरीत, पाउडर फफूंदी प्रजातियों के बीजाणु (जैसे कि हमारे प्रयोगशाला अनुभव के आधार पर गोलोविनोमिस सिकोरेसरम यूसीएससी 1) पानी-निलंबन प्रक्रिया से गुजरने के बाद कम व्यवहार्यता दिखाते हैं 3,4 . एक विशेष पाउडर फफूंदी रोगज़नक़ के साथ परीक्षण पौधों के अपर्याप्त और / या असमान टीकाकरण से गलत फेनोटाइपिंग परिणाम हो सकते हैं।
पाउडर फफूंदी अध्ययन के लिए कई टीकाकरण विधियों की सूचना दी गई थी। इनमें शामिल हैं (i) पौधों का परीक्षण करने के लिए संक्रमित पत्तियों से सीधे बीजाणुओं को ब्रश करना5, (ii) पौधों का परीक्षण करने के लिए बीजाणु निलंबन का छिड़काव करना6, (iii) टॉवर7 के तल पर पौधों के लिए वैक्यूम संचालित निपटान टॉवर का उपयोग करके बीजाणुओं को उड़ाना, और (iv) नायलॉन जाल झिल्ली और ध्वनि-आधारित कंपन के मिश्रित उपयोग द्वारा बीजाणु वितरण8 . बीजाणु-ब्रशिंग (या डस्टिंग) विधि प्रदर्शन करना आसान है लेकिन प्रकृति में असमान है, इस प्रकार यह मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए सटीक नहीं हो सकता है। बीजाणु-छिड़काव सुविधाजनक और यहां तक कि है, लेकिन जैसा कि ऊपर कहा गया है, इसके परिणामस्वरूप खराब बीजाणु अंकुरण हो सकताहै। बाद के दो (यानी, iii-iv) बहुत बेहतर तरीके हैं जो टीकाकरण को प्राप्त करने में सक्षम हैं; हालांकि, दोनों एक ही घटना में टीका लगाए जाने वाले पौधों की संख्या के संदर्भ में अपनी टीकाकरण क्षमता को समायोजित करने में लचीले नहीं हैं, जिससे या तो उपकरण तुच्छ नहीं है, और उनका संचालन प्रयोगशाला क्षेत्रों तक सीमित है जहां वैक्यूम और / या बिजली स्रोत है।
हमारी प्रयोगशाला 20 से अधिक वर्षों 9,10 के लिए प्लांट-पाउडर फफूंदी बातचीत के साथ काम कर रही है। पिछले एक दशक में, हमने कई टीकाकरण विधियों का परीक्षण किया और हाल ही में एक सरल और अभी तक प्रभावी पाउडर फफूंदी टीकाकरण विधि विकसित की। यह जाल-आधारित बीजाणु-ब्रशिंग विधि भी टीकाकरण सुनिश्चित कर सकती है, और सरल और स्केलेबल है, इस प्रकार पाउडर फफूंदी के साथ काम करने वाली किसी भी प्रयोगशाला द्वारा आसानी से अपनाया जाना चाहिए।
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Protocol
1. एक हटाने योग्य शीर्ष ढक्कन के साथ एक मानक टीकाकरण बॉक्स बनाना जो एक जाल के साथ लगाया गया है
- दुकानों से 50 μm नायलॉन झिल्ली जाल या 48 μm स्टेनलेस स्टील जाल (अनुशंसित) का रोल खरीदें। घिसे हुए जाल के प्रतिस्थापन के लिए x 26 में 14 के कई टुकड़ों में काटने के लिए पर्याप्त ऑर्डर करना सुनिश्चित करें।
- एक टीकाकरण बॉक्स बनाने के लिए x 2 फीट x 4 फीट मध्यम घनत्व फाइबरबोर्ड या प्लाईवुड में एक 1/4 खरीदें, और दो 24-1/2 x 10 में टुकड़ों में और दो 12 x 10 टुकड़ों में काटें। चार पक्षों का समर्थन करने के लिए 8 कॉर्नर क्लैंप का उपयोग करें।
नोट: यदि बाड़े के चौड़े पक्ष की ओर मुंह करके, बाईं ओर x 10 में बाईं ओर स्थायी रूप से जुड़ा होता है और दाईं ओर का 12 x 10 में एक हटाने योग्य दरवाजा होता है जिसे चार चुंबकीय कैचों द्वारा रखा जाता है (चित्र 1A, B)। - बाईं ओर के प्रत्येक अंदर के कोने में चार 2-इन कोने ब्रेसिज़ रखें, ऊपर से एक इंच और नीचे से एक इंच, एक छेद को चिह्नित करें और ड्रिल करें। बाईं छोटी तरफ को दो लंबे पक्षों (सामने और पीछे) में स्थायी रूप से संलग्न करने के लिए स्क्रू का उपयोग करें। दो लंबी भुजाओं के बीच आंतरिक दूरी 12 इंच होनी चाहिए न कि 11-1/2 इंच।
- कोने के क्लैंप अभी भी जगह पर हैं और सही दरवाजे के उचित संरेखण के साथ, दाएं डिटैचेबल दरवाजे को पकड़ने के लिए 4 चुंबकीय कैच के स्थान को चिह्नित और ड्रिल करें। दरवाजे पर एक बटन नॉब स्थापित करें। दरवाजे का शीर्ष शीर्ष ढक्कन के नीचे पकड़ता है (चित्रा 1 ए, बी)।
- एक जाल के साथ हटाने योग्य शीर्ष ढक्कन बनाने के लिए, लंबे लकड़ी के चौकोर डोवेल को 26 इंच और 12-3/4 इंच के 2 सेट में काटें। गोंद और चार टुकड़ों को इस तरह से नाखून दें कि यह बॉक्स के चारों ओर फिट हो जाएगा - फ्रेम के अंदर के आयाम बॉक्स के बाहरी आयामों की तुलना में थोड़ा बड़ा होगा, क्योंकि स्क्रीन जाल इस फ्रेम से जुड़ा होगा।
- स्क्रीन जाल को x 26 in में 14 से थोड़ा कम तक काटें। स्क्रीन को फ्रेम से बाहर निकलने की अनुमति न दें ताकि तेज किनारों को रोका जा सके। फ्रेम पर स्क्रीन को फैलाने के लिए सहायता लें। क्लैंप (चित्रा 1 सी) द्वारा फ्रेम के साथ जाल पकड़ें और स्क्रीन को फ्रेम तक सुरक्षित करने के लिए दाएं स्टेपल के साथ स्टेपलर गन का उपयोग करें।
- छोटे लकड़ी के चौकोर डोवल (21 इंच और 9 इंच) के दो सेट काटें, और लकड़ी के चौकोर डोवेल के 4 छोटे टुकड़ों का उपयोग करके फ्रेम के साथ जाल को कसकर सैंडविच करने के लिए स्क्रू का उपयोग करें (चित्रा 1 सी, डी)।
2. एक टीकाकरण कक्ष बनाना
- उपयुक्त स्टोर से स्पष्ट ऐक्रेलिक शीट और हार्डवेयर आइटम खरीदें। चित्र 2सी में दिखाए गए अनुसार बॉक्स की सामने की ओर ऐक्रेलिक शीट पर खोलने वाली विंडो में x 20 में 7 काटें।
- चित्र 2ए में दिखाए गए अनुसार 8 कोने के क्लैंप का उपयोग करके बाएं और दाएं पक्ष, सामने (खिड़की के साथ) और पीछे ऐक्रेलिक शीट को एक बॉक्स में इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि कक्ष के आंतरिक माप शीर्ष शीट के आयामों के बराबर हैं।
नोट: दाईं ओर समर्थन के लिए है और फ्रंट या रियर शीट से जुड़ा नहीं होगा। यह उद्देश्य पर अन्य शीटों की तुलना में 1/2 छोटा है। यह दाईं ओर एक "ड्रॉ डाउन" "फ्लैप" दरवाजा बन जाएगा, जो नीचे की ओर एक समकोण टिका है और शीर्ष पर दो चुंबकीय कैच होंगे जैसा कि चित्र 2 सी, डी में दिखाया गया है। - पैनलों को एक साथ सुरक्षित करने के लिए कॉर्नर ब्रेसिज़ का उपयोग करें (चित्रा 2 बी, सी)। ब्रेसिज़ को जगह पर रखें, एक शार्प मार्कर, सेंटर पंच से चिह्नित करें और फिर छेद को ड्रिल करें।
नोट: ड्रिलिंग ऐक्रेलिक किसी और चीज को ड्रिल करने से अलग है, बल न करें या ड्रिल के विपरीत छेद के किनारे दरार हो सकती है। रिवेट्स या स्क्रू का उपयोग करें। स्क्रू को अधिक मजबूत न करें या ऐक्रेलिक समय के साथ टूट सकता है। - बाड़े को पीछे की तरफ घुमाएं और 4 कोने के क्लैंप को हटा दें और शीर्ष शीट को जगह पर रखें। मार्क और ड्रिल।
- कोण ब्रेस में 3/4 से बना समकोण हिंज स्थापित करें। हिंज रॉड के रूप में नायलॉन रिटेनिंग लॉक नट का उपयोग करें। कसो मत, एक अंतर छोड़ दो ताकि दरवाजा इस टिका पर घूम जाए।
- # 6-32x3/4 "पैन हेड स्क्रू के साथ दो चुंबकीय दरवाजे मैग्नेट को चिह्नित, केंद्र पंच, ड्रिल और संलग्न करें। फिर # 6-32x3/8 "फ्लैट हेड स्क्रू के साथ कैच प्लेटों को संलग्न करें, चित्रा 2 सी, डी देखें।
3. फ्लैटों में संयंत्रों का टीकाकरण
- इनोकुला के रूप में ताजा पाउडर फफूंदी बीजाणु तैयार करें (उदाहरण के लिए, एराबिडोप्सिस पाउडर फफूंदी गोलोविनोमिस सिकोरेसरम यूसीएससी 1)। एक विकास कक्ष (22 डिग्री सेल्सियस, 6-8 सप्ताह के लिए 65% सापेक्ष आर्द्रता) में स्वच्छ एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा-समझौता पैड 4-1 उत्परिवर्ती पौधों को उगाएं, और पर्याप्त ताजा पाउडर फफूंदी बीजाणुओं का निर्माण करने के लिए पैड 4-1 पौधों के एक या आधे फ्लैट को टीका लगाएं (चित्रा 3 ए)।
- फ्लैटों में x 2.5 में x 2.5 में मानक 11 में संक्रमण फेनोटाइप निर्धारित करने के लिए पौधों को उगाएं।
नोट: एराबिडोप्सिस पौधे छह से आठ सप्ताह के लिए अल्पकालिक (8 घंटे प्रकाश, 16 घंटे अंधेरे; 22 डिग्री सेल्सियस) के तहत उगाए जाते हैं, पाउडर फफूंदी के साथ संक्रमण परीक्षण के लिए अच्छे होते हैं। - जब टीकाकरण के 8-10 दिनों के बाद संक्रमित पौधों से ताजा पाउडर फफूंदी बीजाणु उपलब्ध हों, तो संक्रमण परीक्षण के लिए पौधों के एक फ्लैट को टीकाकरण कक्ष के अंदर टीकाकरण बॉक्स में ले जाएं (चित्रा 1 बी, 2 सी)।
- एराबिडोप्सिस के 15-20 भारी संक्रमित पत्तों (या 4-6 संक्रमित रोसेट, पत्ती/रोसेट के आकार और टीकाकरण के स्तर के आधार पर) को काट लें, यदि गाढ़ा पानी हो तो पत्तियों को सूखने दें।
- एक हाथ का उपयोग करके लंबे बल की एक जोड़ी के साथ 1-2 पत्तियां या एक रोसेट लें और पत्तियों को उल्टा रखें। फिर, दोनों हाथों को कक्ष के उद्घाटन के माध्यम से रखें और धीरे-धीरे कैंची की एक जोड़ी के साथ बल की बांह पर प्रहार करें, जबकि धीरे-धीरे टीकाकरण बॉक्स पर लगे जाल के ऊपर पत्तियों / रोसेट को हिलाते हुए (चित्रा 3 बी)। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि सभी पत्तियों या रोसेट का उपयोग न किया जाए।
नोट: परिपक्व बीजाणु संक्रमित पत्तियों के कोनिडियोफोर से आसानी से हट जाएंगे। जाल पर बीजाणुओं को यथासंभव समान रूप से हटाने की कोशिश करें। - जाल के माध्यम से बीजाणुओं को धीरे से ब्रश करने के लिए एक या दो महीन फैन-ब्लेंडर ब्रश का उपयोग करें (चित्रा 3 सी)। टीकाकरण बॉक्स के तल में पौधों पर बीजाणुओं के वितरण को अधिकतम करने के लिए जाल की पूरी सतह को चार या अधिक बार अलग-अलग दिशाओं में ब्रश करना सुनिश्चित करें (चित्रा 3 डी)। जाल में फंसे बीजाणुओं को हिलाने के लिए ब्रश के साथ कुछ बार जाल को धीरे से थपथपाएं।
- बीजाणुओं को आधे मिनट के लिए शांत होने दें। फिर, टीकाकरण बॉक्स से टीका लगाए गए पौधों वाले फ्लैट को बाहर निकालें। फ्लैट को प्लास्टिक गुंबद के साथ कवर करें और इसे एक विकास कक्ष (22 डिग्री सेल्सियस, 65% सापेक्ष आर्द्रता) में रखें। रोग फेनोटाइपिंग 5, या 8 से 12 डीपीआई 12 पर किया जा सकता है।
4. पौधों को छोटे टीकाकरण बक्से के साथ टीका लगाएं
नोट: ऐसे मामलों में जहां कम पौधों को टीका लगाया जाना है, मानक टीकाकरण बॉक्स का उपयोग अभी भी किया जा सकता है। पौधों को बॉक्स के बीच में रखना सुनिश्चित करें। जाल के क्षेत्र में बीजाणुओं को हटाना और ब्रश करना जो पौधों को कवर करता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी पौधों को टीका लगाया जाता है, जबकि टीका को बचाया जाता है। वैकल्पिक रूप से, और अधिमानतः, छोटे टीकाकरण बक्से का उपयोग किया जा सकता है (जैसा कि नीचे वर्णित है)।
- कार्डबोर्ड बक्से को एक टीकाकरण बॉक्स में परिवर्तित करें। बस बॉक्स के शीर्ष और निचले किनारों को हटा दें, यदि आवश्यक हो तो इसे मजबूत करने के लिए कोने को टेप करें, और शीर्ष पर चिपकाकर या स्टैपलिंग करके उपयुक्त आकार के 50 μm जाल को माउंट करें (चित्रा 4 ए, बी)।
- टीकाकरण कक्ष के अंदर पौधों वाले फ्लैट को स्थानांतरित करें, पौधों को कवर करने के लिए फ्लैट के शीर्ष पर छोटे टीकाकरण बॉक्स रखें।
- ऊपर वर्णित के रूप में डिस्लोड और ब्रश बीजाणु।
5. पेट्री व्यंजनों में अलग पत्तियों को टीका लगाएं
नोट: ऐसे मामलों में जहां (i) ताजा पाउडर फफूंदी बीजाणु बहुत सीमित हैं और / या (ii) पौधों को साफ रखा जाना चाहिए, जबकि संक्रमित कोशिकाओं में रोग फेनोटाइप और / या प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण का आकलन करने की आवश्यकता है, एमएस-आगर प्लेटों में संक्रमण के लिए अलग पत्तियों का उपयोग किया जा सकता है।
- एक मिनी टीकाकरण बॉक्स बनाएं जो पेट्री डिश से थोड़ा बड़ा है।
- 1/2-शक्ति मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मध्यम आगर (1.5%) प्लेटें तैयार करें। यदि आवश्यक हो तो मोल्ड संदूषण को कम करने के लिए थियाबेन्डाज़ोल (40 मिलीग्राम / एल) जोड़ें। उपयोग होने तक प्लेटों को फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक पौधे के लिए पेटिओल के आधार से एक या दो पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों को काटें। अलग किए गए पत्तों के पेटीओल को ~ 30 ° के कोण पर आगर माध्यम में डालें।
नोट: प्रत्येक प्लेट में पत्तियों के आकार और उपयोग की जाने वाली प्लेट के आधार पर 20-40 पत्तियां हो सकती हैं (चित्रा 4 सी)। - ऊपर वर्णित के रूप में टीकाकरण कक्ष के अंदर पत्तियों को टीका लगाएं। ढक्कन के साथ प्लेट को एक विकास कक्ष में ले जाएं।
- एक पत्ती के एक छोटे से खंड को काटें और विशिष्ट समय-बिंदुओं पर प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की जांच करें।
- संक्रमण फेनोटाइप का आकलन करने के लिए, पत्तियों को 4 या 5 डीपीआई पर एक ताजा सड़न रोकनेवाला एमएस-आगर प्लेट में स्थानांतरित करें। पत्तियों को ताजा आगर माध्यम में डालने से पहले पेटीओल के आधार को काट लें। 8 या 9 डीपीआई पर रोग फेनोटाइप का आकलन करें।
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Representative Results
यहां, हम एक नई पाउडर फफूंदी बीजाणु टीकाकरण विधि प्रस्तुत करते हैं जो तैयार करना, संचालित करना और समायोजित करना आसान है। चित्र 1 मानक टीकाकरण बॉक्स की असेंबली को दर्शाता है जिसमें 50 μm झिल्ली जाल के साथ लगाए गए हटाने योग्य ढक्कन के निर्माण पर जोर दिया गया है। चित्र 2 टीकाकरण कक्ष की असेंबली को दर्शाता है। चित्रा 3 इस प्रणाली का उपयोग करके टीकाकरण प्रक्रिया के प्रमुख चरणों को दर्शाता है। चित्रा 4 अन्य टीकाकरण बक्से दिखाता है जिनका उपयोग पूरे सपाट या कम पौधों को टीका लगाने के लिए किया जा सकता है, या एमएस-आगर माध्यम पर अलग पत्तियां। अंत में, चित्रा 5 बीजाणु वितरण या पौधे संक्रमण फेनोटाइप द्वारा परिलक्षित टीकाकरण समानता को प्रदर्शित करने के लिए डेटा प्रदान करता है।
चित्र 1. एक टीकाकरण बॉक्स बनाना। (A-B) एराबिडोप्सिस पौधों (बी) के फ्लैट को डालने के लिए दरवाजा बंद (ए) या खुले बॉक्स के साथ बॉक्स दिखाने वाली तस्वीरें। नोट कैबिनेट दरवाजे चुंबकीय कैच की एक जोड़ी का उपयोग दरवाजा पकड़ने के लिए किया जाता है। (C) बॉक्स का ढक्कन बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में आयत फ्रेम पर जाल के चढ़ने को दिखाने वाली एक तस्वीर। नोट क्लैंप और कोने कोष्ठक का उपयोग जाल को पेंच किए गए नाखूनों द्वारा तय करने से पहले स्थिति के लिए किया जाता है। (डी-ई) एक नए स्टेनलेस-स्टील जाल (डी) या इकट्ठे बॉक्स (ई) के साथ बॉक्स के हटाने योग्य ढक्कन को दिखाने वाली तस्वीरें। ध्यान दें कि जाल को 3/4 इंच लकड़ी के वर्ग डोवेल के बीच तय किया गया है, जिसकी लंबाई D और E में इंगित की गई है। पीली रेखाएं बॉक्स के आकार माप को उजागर करती हैं। एक मानक फ्लैट फिट होने वाला एक टीकाकरण बॉक्स होने से फेनोटाइपिंग दक्षता में काफी वृद्धि हो सकती है, खासकर जब बहुत सारे पौधों को टीका लगाया जाना है (उदाहरण के लिए, आनुवंशिक स्क्रीन के दौरान)। एक जाल के साथ लगाया गया एक हटाने योग्य ढक्कन जाल की सफाई या प्रतिस्थापन को आसान बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2. एक टीकाकरण कक्ष बनाना। (ए) कोने क्लैंप का उपयोग करके चार ऐक्रेलिक शीट्स की प्रारंभिक असेंबली दिखाने वाली एक तस्वीर। (बी) प्लास्टिक कक्ष का ऊपर-नीचे दृश्य देने वाली एक तस्वीर। (सी-डी) पूरी तरह से इकट्ठे टीकाकरण प्रणाली (सी) को दिखाने वाली तस्वीरें, और दरवाजे (डी) के रूप में एक तरफ ऐक्रेलिक शीट पर स्थापित दो चुंबकीय कैच (ऊपरी) और दाएं कोण हिंज (नीचे) में से एक। ध्यान दें कि टीकाकरण विंडो उपयोगकर्ता द्वारा बीजाणुओं को हटाने और ब्रश करने के लिए है (डिश लाइनों द्वारा चित्रित)। पीली रेखाएं बॉक्स के आकार माप को उजागर करती हैं। एक टीकाकरण कक्ष होना एक प्लस है, लेकिन इसके बिना, टीकाकरण अभी भी एक छोटे से हवा-स्थिर कमरे या वातावरण में एक टीकाकरण बॉक्स के साथ किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3. टीकाकरण प्रक्रिया का चित्रण। (ए) संकेतित पौधों की पत्तियों पर ताजा पाउडर फफूंदी दिखाने वाले चित्र। (बी) एक तस्वीर जिसमें दिखाया गया है कि संक्रमित पत्तियों को पकड़ने वाले बल को धीरे से मारकर जाल पर बीजाणुओं को कैसे हिलाया जाए। (सी) जाल पर दो महीन फैन-ब्लेंडर ब्रश और बीजाणुओं के कोमल ब्रश को दिखाने वाले चित्र। (डी) जाल पर बीजाणु ब्रशिंग की दिशाओं को दिखाने वाला एक योजनाबद्ध ड्राइंग जो टीकाकरण बॉक्स के तल में पौधों पर बीजाणु वितरण में भी मदद कर सकता है। यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि टीकाकरण के लिए ताजा बीजाणुओं का उपयोग सफल संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव के आधार पर, 8 से 12 डीपीआई के बीच संक्रमित पत्तियों पर उत्पादित कोनिडिया ताजा होते हैं और झटकों से आसानी से हटाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4. संक्रमण परीक्षणों के लिए सरल, अनंतिम कार्डबोर्ड टीकाकरण बॉक्स। (ए) एक मानक फ्लैट में पौधों को टीका लगाने के लिए एक कार्डबोर्ड बॉक्स। (बी) कम पौधों को टीका लगाने के लिए मध्यम आकार के टीकाकरण बक्से। (सी) एमएस-एगर माध्यम युक्त चौकोर पेट्री डिश प्लेट में अलग-अलग पत्तियों को टीका लगाने के लिए एक छोटा टीकाकरण बॉक्स। पीली रेखाएं बॉक्स के आकार माप को उजागर करती हैं। अन्य आकारों के कारबोर्ड बक्से का उपयोग किया जा सकता है यदि वे परीक्षण किए जाने वाले पौधों वाले फ्लैटों को फिट करते हैं। प्लास्टिक के बक्से का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि बीजाणुओं को इसकी स्थैतिक बिजली के कारण प्लास्टिक की सतह पर आकर्षित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5. टीकाकरण समानता का आकलन। (ए) एक योजनाबद्ध ड्राइंग जो एक फ्लैट के तल पर छह सूक्ष्म स्लाइडों की स्थिति को दर्शाता है। दाईं ओर एक प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ भारी टीकाकरण के बाद स्लाइड पर बीजाणु वितरण भी दिखाता है। स्केल बार = 200 μm. (B) पैड4-1 पौधों की पूरी तरह से विस्तारित संक्रमित पत्तियों के साथ बीजाणुओं के साथ तीन नकली टीकाकरण के बाद (A) में दिखाए गए अनुसार छह स्थानों (1 से 6) में वितरित बीजाणुओं के घनत्व को दर्शाने वाला एक बार चार्ट। प्रत्येक स्लाइड के शीर्ष पर एक ग्रिडेड ग्लास कवर स्लिप (इबिडी यूएसए इंक या स्व-निर्मित) द्वारा सीमांकित 4 x0.25 सेमी 2 के क्षेत्र में बीजाणुओं की गणना की गई थी। दो टीकाकरण योजनाओं में से प्रत्येक में छह स्लाइडों के बीच बीजाणु घनत्व में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया (छात्र टी-टेस्ट; पी > 0.5)। (सी) एराबिडोप्सिस कोल-0 वाइल्ड-टाइप और पैड4-1 म्यूटेंट के प्रतिनिधि पौधे भारी टीकाकरण के 12 दिनों बाद जी. सिकोरेसरम यूसीएससी 1 से संक्रमित होते हैं। ध्यान दें कि सभी पैड 4-1 पौधों ने कोल -0 पौधों की तुलना में रोग संवेदनशीलता में वृद्धि दिखाई। कई कारक टीकाकरण समानता निर्धारित करते हैं। सामान्य तौर पर, टीकाकरण को भी प्राप्त करना अपेक्षाकृत आसान होता है जब > 50 बीजाणुओं / सेमी 2 के घनत्व तक पहुंचने के लिए पर्याप्त इनोकुला का उपयोग किया जाताहै। हिलाने से हटाए गए ताजा कोनिडिया को आसानी से अलग किया जा सकता है और जाल के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से ब्रश किया जा सकता है। पुराने या मृत कोनिडिया समुच्चय बनाते हैं, इस प्रकार उन्हें हटाना और फैलाना मुश्किल होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हमारी जाल-बॉक्स-आधारित टीकाकरण विधि में अन्य टीकाकरण विधियों की तुलना में कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह ठीक से संचालित होने पर बीजाणुओं के वितरण को भी प्राप्त कर सकता है, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। दूसरा, ~ 50 μm जाल का उपयोग, साथ ही संक्रमित पत्तियों के कोमल झटकों द्वारा बीजाणु-विघटन थ्रिप्स या अन्य पौधे-संक्रमित कीड़ों द्वारा पौधे के संक्रमण को कम कर सकता है जो स्रोत पौधों में मौजूद हैं। तीसरा, प्लास्टिक कक्ष के अंदर पौधों या अलग पत्तियों को टीका लगाने के लिए अलग-अलग आकार के टीकाकरण बक्से का उपयोग (दोनों को 75% इथेनॉल का छिड़काव करके आसानी से साफ किया जा सकता है) इनोकुलम का अधिक प्रभावी उपयोग कर सकता है और क्रॉस संदूषण को कम कर सकता है। हमने पाया कि पूरी टीकाकरण प्रक्रिया के दौरान टीकाकरण कक्षों से कोई या बहुत कम फंगल बीजाणु नहीं निकले।
यहां तक कि टीकाकरण सुनिश्चित करने के लिए एक अच्छी गुणवत्ता वाला टीकाकरण बॉक्स महत्वपूर्ण है। हमने पाया कि मानक टीकाकरण बॉक्स का उपयोग एराबिडोप्सिस (चित्रा 1), स्ट्रॉबेरी के पौधों, बुवाई थीस्ल और एन बेंथामियाना (नहीं दिखाया गया) के युवा और परिपक्व पौधों के टीकाकरण के लिए किया जा सकता है। बॉक्स की ऊंचाई और बढ़ सकती है यदि पौधे पांच इंच से अधिक लंबे हैं ताकि जाल से नीचे पौधों तक पर्याप्त दूरी (> 5 इंच) सुनिश्चित की जा सके ताकि बीजाणु वितरण की अनुमति मिल सके। प्लास्टिक कक्ष की ऊंचाई भी तदनुसार बढ़ सकती है ताकि टीकाकरण बॉक्स के शीर्ष पर बीजाणु को हटाने और ब्रश करने के लिए पर्याप्त जगह मिल सके।
यहां तक कि टीकाकरण बॉक्स के ढक्कन के लिए पसंद के ~ 50 μm जाल का कसकर चढ़ना महत्वपूर्ण है और अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता है। छिद्र का आकार पाउडर फफूंदी बीजाणुओं की तुलना में थोड़ा बड़ा होता है जो ज्यादातर व्यास में 30-40 μm होते हैं। ढक्कन को नल के पानी से धोकर या उपयोग के बाद 75% इथेनॉल के साथ स्प्रे करके साफ किया जा सकता है। हम 48 μm स्टेनलेस स्टील जाल के उपयोग की सलाह देते हैं, क्योंकि जाल अधिक टिकाऊ है और लंबे समय तक चलेगा।
टीकाकरण कक्ष एक हवा-स्थिर वातावरण बनाता है और बीजाणु-विघटन और / या ब्रशिंग के दौरान बीजाणु पलायन को कम करता है। कक्ष पारदर्शी प्लास्टिक ग्लास से बना है ताकि उपयोगकर्ता नग्न आंखों से देख सके कि क्या बीजाणु ब्रश करने से पहले जाल पर कम या ज्यादा समान रूप से वितरित किए जाते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि एक प्रकाश और यहां तक कि टीकाकरण की आवश्यकता होती है। अलग-अलग दिशाओं में धीरे-धीरे लेकिन जल्दी से ब्रश करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एकत्रित बीजाणुओं को फैला सकता है और उन्हें छिद्रों के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से धक्का दे सकता है, बीजाणुओं के गिरने के बाद भी वितरण प्राप्त कर सकता है और टीकाकरण बॉक्स के निचले हिस्से में बस सकता है। आसान हैंडलिंग के लिए, टीकाकरण कक्ष को उपयुक्त ऊंचाई के साथ एक मेज पर रखा जाना चाहिए ताकि कक्ष की खिड़की के माध्यम से हाथों से बीजाणु-विघटन और ब्रशिंग आसानी से की जा सके।
अलग-अलग आकार के टीकाकरण बक्से का उपयोग करके जाली-बॉक्स-आधारित टीकाकरण को बढ़ाया या घटाया जा सकता है। सरल, अनंतिम जाल-टीकाकरण बक्से बनाना आसान है और ठीक से उपयोग किए जाने पर संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर सकता है। बेशक, वैक्यूम संचालित निपटान टॉवर विधि7 के साथ टीकाकरण की तुलना में, इस विधि को बीजाणु-डिफ्लोजिंग और ब्रश करने में अधिक समय लग सकता है। इसके अलावा, बड़े और लंबे पौधों को टीका लगाने के लिए, यहां वर्णित मानक टीकाकरण बॉक्स बहुत छोटा हो सकता है, इस प्रकार एक बड़ा टीकाकरण बॉक्स और एक बड़े कक्ष का उपयोग टीकाकरण प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए। तंबाकू और ककड़ी जैसे कुछ पौधों की प्रजातियों के लिए, पूरे पौधे की रोग संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए इस विधि के साथ अलग किए गए पत्तों या कोटिलेडोन को टीका लगाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (आईओएस -1901566) द्वारा एस ज़ियाओ द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक पौधे की वृद्धि सुविधा के रखरखाव के लिए एफ कोकर और सी हुक्स को धन्यवाद देना चाहते हैं, और जॉर्ज ज़मोरा को टीकाकरण बॉक्स और कक्ष के निर्माण से जुड़ी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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