Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת הפצת נבגים פשוטה המורכבת מקופסת חיסון עם רשת ~ 50 מיקרומטר ותא פלסטיק שקוף. ניתן להשתמש בו כדי לחסן צמחים באופן שווה בנבגי טחב אבקתיים, ובכך לאפשר הערכה מדויקת וניתנת לשחזור של פנוטיפים של מחלות של צמחים נחקרים.
Abstract
צמצום אובדן יבולים כתוצאה ממחלות פטרייתיות דורש הבנה משופרת של המנגנונים השולטים בחסינות הצמחים ובפתוגנזה פטרייתית, אשר בתורם דורשים קביעה מדויקת של פנוטיפים של מחלות של צמחים בעת הדבקה בפתוגן פטרייתי מסוים. עם זאת, פנוטיפ מדויק של מחלות עם פתוגנים פטרייתיים ביוטרופיים בלתי ניתנים לזיהוי כגון טחב אבקתי אינו קל להשגה ויכול להיות שלב מגביל קצב בפרויקט מחקר. כאן, פיתחנו מערכת פנוטיפית מחלות בטוחה, יעילה וקלה לתפעול תוך שימוש באינטראקציה של טחב אבקתי-ערבידופסיס כדוגמה. מערכת זו מורכבת בעיקר משלושה מרכיבים: (i) קופסת חיסון מעץ המצוידת במכסה נשלף המורכב על רשת נירוסטה או ניילון של ~ 50 מיקרומטר נקבוביות לחיסון שטוח של צמחים עם נבגי פטריות, (ii) תא פלסטיק שקוף עם פתח קדמי קטן למזעור בריחת נבגים תוך ביצוע חיסון בפנים, ו-(3) שיטת פירוק והפצה של נבגים לחיסון אחיד ויעיל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים את השלבים והפרמטרים להכנת קופסת החיסון ותא הפלסטיק בעלות נמוכה, והדגמת וידאו כיצד להשתמש במערכת כדי לאפשר חיסון אחיד בנבגי טחב אבקתיים, ובכך לשפר את הדיוק ואת יכולת השחזור של פנוטיפ המחלה.
Introduction
טחב אבקתי הוא אחת המחלות הנפוצות והחשובות ביותר של גידולי מזון רבים וצמחי נוי1. מחקרים על מחלות טחב אבקתי היו פופולריים מאוד, כפי שמעידים למעלה מ-10,500 פרסומים כתוצאת החיפוש עם "טחב אבקתי" כמילת מפתח ב-Web of Science (נכון לנובמבר 2020). ואכן, טחב אבקתי (המיוצג על ידי Blumeria graminis) נחשב לאחד מעשרת הפתוגנים הפטרייתיים המובילים על ידי כתב העת של פתולוגיה מולקולרית של צמחים2. כימות הרגישות למחלות הוא צעד הכרחי באפיון גנים צמחיים התורמים לעמידות למחלות או לרגישות, או זיהוי תפקודי של גנים משפיעים מועמדים בטחב אבקתי. עם זאת, פנוטיפ אמין של מחלות מאתגר הרבה יותר עם טחב אבקתי בהשוואה לזה של רוב הפתוגנים הפטרייתיים האחרים, בין היתר משום שבניגוד לנבגים של האחרונים, נבגים של מיני טחב אבקתי (כגון Golovinomyces cichoracearum UCSC1 בהתבסס על ניסיון המעבדה שלנו) מראים כדאיות מופחתת לאחר שעברו תהליך השעיית מים 3,4 . חיסון לא מספק ו/או לא אחיד של צמחי בדיקה עם פתוגן טחב אבקתי מסוים עלול להוביל לתוצאות פנוטיפ לא מדויקות.
מספר שיטות חיסון דווחו למחקרי טחב אבקתי. אלה כוללים (i) הברשה של נבגים ישירות מעלים נגועים כדי לבדוק צמחים5, (ii) התזת תרחיף נבגים כדי לבדוק צמחים6, (iii) ניפוח נבגים באמצעות מגדל התיישבות המופעל בוואקום לצמחים בתחתית המגדל7, ו-(iv) העברת נבגים על ידי שימוש קומבינטורי של קרום רשת ניילון ורטט מבוסס קול8 . שיטת צחצוח הנבגים (או האבק) קלה לביצוע אך לא אחידה באופיה, ולכן ייתכן שהיא אינה מדויקת להערכה כמותית. ריסוס נבגים נוח ואחיד, אך כאמור לעיל עלול לגרום לנביטת נבגים לקויה4. שתי האחרונות (כלומר, iii-iv) הן שיטות משופרות בהרבה המסוגלות להשיג אפילו חיסון; עם זאת, שניהם אינם גמישים בהתאמת יכולת החיסון שלהם מבחינת מספר הצמחים שיש לחסן באירוע אחד, מה שהופך את אחד המנגנונים אינו טריוויאלי, והפעלתם מוגבלת לאזורי מעבדה שבהם יש ואקום ו/או מקור חשמל.
המעבדה שלנו עובדת עם אינטראקציה בין טחב אבקתי לצמחים כבר למעלה מ-20 שנה 9,10. בעשור האחרון בדקנו מספר שיטות חיסון ולאחרונה פיתחנו שיטה פשוטה אך יעילה לחיסון טחב אבקתי. שיטת הברשה זו המבוססת על רשת יכולה להבטיח חיסון אחיד, והיא פשוטה ומדרגית, ולכן כל מעבדה העובדת עם טחב אבקתי צריכה לאמץ אותה בקלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביצוע קופסת חיסון סטנדרטית עם מכסה עליון נשלף המורכב עם רשת
- רכשו גליל של רשת ממברנת ניילון 50 מיקרומטר או רשת נירוסטה 48 מיקרומטר (מומלץ) מחנויות. הקפידו להזמין מספיק לחיתוך למספר חתיכות של 14 אינץ' על 26 אינץ' להחלפת רשת שחוקה.
- רכשו סיבית או דיקט אחד בגודל 1/4 אינץ' x 2 רגל x 4 רגל בצפיפות בינונית, וחתכו שניים 24-1/2 אינץ' x 10 לחתיכות ושניים 12 אינץ' x 10 בחתיכות להכנת קופסת חיסון. השתמשו ב-8 מלחציים פינתיים לתמיכה בארבעת הצדדים.
הערה: אם פונים לצד הרחב של המארז, הצד השמאלי 12 אינץ' x 10 מחובר באופן קבוע והצד הימני 12 אינץ' x 10 הוא דלת נשלפת המוחזקת במקומה על ידי ארבעה מלכודים מגנטיים (איור 1A,B). - מניחים ארבעה פלטות פינתיות בגודל 2 אינץ' שתיים בכל פינה פנימית של צד שמאל, סנטימטר מלמעלה וסנטימטר מלמטה, מסמנים וקודחים חור. השתמש בברגים כדי לחבר לצמיתות את הצד הקצר השמאלי לשני צדדים ארוכים (מלפנים ומאחור). המרחק הפנימי בין שני הצדדים הארוכים צריך להיות 12 אינץ' ולא 11-1/2 אינץ'.
- כאשר המהדקים הפינתיים עדיין במקומם ויישור נכון של הדלת הימנית, סמנו וקדחו את מיקומם של 4 המלכודים המגנטיים כדי להחזיק את הדלת הימנית הניתנת להסרה במקומה. התקינו כפתור כפתור לדלת. החלק העליון של הדלת תופס מתחת למכסה העליון (איור 1A,B).
- כדי ליצור מכסה עליון נשלף עם רשת, חתכו את הדיבל המרובע הארוך מעץ ל-2 סטים של 26 אינץ' ו-12-3/4 אינץ'. הדביקו ומסמרו את ארבעת החלקים באופן כזה שיתאים לקופסה - הממדים הפנימיים של המסגרת יהיו קצת יותר גדולים מהממדים החיצוניים של הקופסה, שכן רשת המסך תהיה מחוברת למסגרת זו.
- גזור את רשת הרשת של המסך לקצת פחות מ- 14 אינץ' x 26 אינץ'. אל תאפשר למסך לבלוט מעבר למסגרת כדי למנוע קצוות חדים. יש סיוע כדי למתוח את המסך על המסגרת. החזיקו את הרשת עם המסגרת באמצעות מלחציים (איור 1C) והשתמשו באקדח מהדק עם הסיכות הנכונות כדי לאבטח את המסך למסגרת.
- חתכו שני סטים של דיבל מרובע קצר יותר מעץ (21 אינץ' ו-9 אינץ'), והשתמשו בברגים כדי לכרוך בחוזקה את הרשת לאורך המסגרת באמצעות 4 חתיכות קצרות יותר של דיבל מרובע מעץ (איור 1C, D).
2. ביצוע תא חיסון
- רכשו יריעות אקריליק שקופות ופריטי חומרה מחנויות מתאימות. חתכו חלון פתיחה בגודל 7 אינץ' על יריעת האקריל הקדמית של הקופסה, כפי שמוצג באיור 2C.
- הרכיבו את הצדדים השמאלי והימני, הקדמי (עם החלון) והאחוריים של יריעות אקריליק לתוך קופסה באמצעות 8 מלחציים פינתיים כפי שמוצג באיור 2A. ודא שהמידות הפנימיות של התא שוות למידות היריעה העליונה.
הערה: הצד הימני נמצא שם לתמיכה ולא יחובר ליריעות הקדמיות או האחוריות. זה 1/2 קצר יותר מאשר גיליונות אחרים בכוונה. צד ימין זה יהפוך לדלת "דש" "משיכה כלפי מטה" המוחזקת במקומה על ידי ציר בזווית ישרה בתחתית ושני תופסים מגנטיים בחלק העליון כפי שמוצג באיור 2C,D. - השתמשו בסוגריים מסולסלים פינתיים כדי לאבטח את החלוניות יחד (איור 2B,C). החזק את הפלטה במקומה, סמן עם סמן חד, אגרוף במרכז ולאחר מכן קדח את החור.
הערה: קידוח אקריליק שונה מקידוח כל דבר אחר, אין לכפות או שצד החור שממול למקדחה עלול להיסדק. השתמש מסמרות או ברגים. אין להדק יתר על המידה את הברגים, אחרת האקריליק עלול להיסדק עם הזמן. - סובב את המארז בצדו האחורי והסר את 4 המהדקים הפינתיים ומקם את היריעה העליונה במקומה. לסמן ולקדוח.
- התקן את ציר הזווית הישרה, העשוי מסד זוויתי של 3/4 אינץ'. השתמשו באום נעילה תומך ניילון כמוט ציר. אין להדק, להשאיר מרווח כך שהדלת תסתובב על ציר זה.
- מסמן, אגרוף מרכזי, מקדח וחבר את שני המגנטים של הדלת המגנטית עם ברגי ראש פאן #6-32x3/4 אינץ '. לאחר מכן חברו את לוחות התפיסה עם ברגי ראש שטוחים בגודל #6-32x3/8", ראו איור 2C,D.
3. חיסון צמחים בדירות
- הכינו נבגי טחב אבקתיים טריים כאינוקולה (למשל, טחב אבקתי ערבידופסיס Golovinomyces cichoracearum UCSC1). לגדל צמחים מוטנטיים נקיים של אראבידופסיס עם פגיעה במערכת החיסון4-1 11 בתא גידול (22 מעלות צלזיוס, 65% לחות יחסית למשך 6-8 שבועות), ולחסן אחד או חצי שטוחים של צמחי פד4-1 כדי לבנות מספיק נבגי טחב אבקתיים טריים (איור 3A).
- לגדל את הצמחים לקביעת פנוטיפים של זיהום בתקן 11 ב x 21 ב x 2.5 בדירות.
הערה: צמחי Arabidopsis הגדלים תחת יום קצר (8 שעות בהירות, 16 שעות חשוכות; 22 מעלות צלזיוס) במשך שישה עד שמונה שבועות טובים לבדיקות זיהום עם טחב אבקתי. - כאשר נבגי טחב אבקתיים טריים מצמחים נגועים זמינים 8-10 ימים לאחר החיסון (dpi), העבירו משטח של צמחים לבדיקת זיהום לתוך תיבת החיסון בתוך תא החיסון (איור 1B,2C).
- חותכים 15-20 עלי ערבידופסיס נגועים בכבדות (או 4-6 רוזטות נגועות, תלוי בגודל העלה/רוזטה וברמת החיסון), נותנים לעלים להתייבש אם יש מים מרוכזים.
- קחו 1-2 עלים או רוזטה עם זוג מלקחיים ארוכים ביד אחת ופנו אל העלים במהופך. לאחר מכן, הכניסו את שתי הידיים דרך פתח החדר ופגעו בעדינות בזרוע המלקחיים עם זוג מספריים תוך כדי הזזה איטית של העלים/רוזטה מעל הרשת המותקנת על תיבת החיסון (איור 3B). חוזרים על הפעולה עד לקבלת תערובת של עלים או רוזטות.
הערה: נבגים בוגרים יתנתקו בקלות מהקונידיופורים של העלים הנגועים. נסו לנתק נבגים על הרשת באופן שווה ככל האפשר. - השתמשו במברשת מאוורר-בלנדר עדינה אחת או שתיים כדי להבריש בעדינות את הנבגים דרך הרשת (איור 3C). הקפידו לצחצח את כל פני הרשת בכיוונים שונים במשך ארבע פעמים או יותר כדי למקסם את הפיזור השווה של הנבגים על הצמחים בתחתית תיבת החיסון (איור 3D). טפחו בעדינות על הרשת כמה פעמים עם המברשות כדי לנער את הנבגים שנתקעו ברשת.
- תנו לנבגים לשקוע במשך חצי דקה. לאחר מכן, הוציאו את הדירה המכילה את הצמחים המחוסנים מתיבת החיסון. מכסים את הדירה בכיפת פלסטיק ומניחים אותה בתא גידול (22 מעלות צלזיוס, 65% לחות יחסית). פנוטיפ המחלה יכול להתבצע ב 5, או 8 עד 12 dpi 12.
4. לחסן צמחים עם קופסאות חיסון קטנות יותר
הערה: במקרים בהם יש לחסן פחות צמחים, עדיין ניתן להשתמש בקופסת החיסון הסטנדרטית. הקפידו למקם את הצמחים במרכז הקופסה. יש לפרוק ולהבריש את הנבגים באזור הרשת המכסה את הצמחים כדי להבטיח שכל הצמחים מחוסנים תוך חיסכון באינוקולה. לחלופין, ורצוי, ניתן להשתמש בקופסאות חיסון קטנות יותר (כמתואר להלן).
- המרת קופסאות קרטון לקופסת חיסון. פשוט הסירו את הצדדים העליונים והתחתונים של הקופסה, הדביקו את הפינה כדי לחזק אותה במידת הצורך, והרכיבו רשת בגודל מתאים של 50 מיקרומטר בחלק העליון על ידי הדבקה או הידוק (איור 4A,B).
- הזיזו את השטוח המכיל את הצמחים בתוך תא החיסונים, הניחו את קופסת החיסונים הקטנה יותר על גבי הדירה כדי לכסות את הצמחים.
- יש לנתק ולצחצח את הנבגים כמתואר לעיל.
5. לחסן עלים מנותקים בצלחות פטרי
הערה: במקרים שבהם (i) נבגי טחב אבקתיים טריים מוגבלים מאוד ו/או (ii) יש לשמור על ניקיון הצמחים בעוד שיש צורך להעריך פנוטיפים של מחלות ו/או לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים בתאים נגועים, עלים מנותקים יכולים לשמש לזיהום בצלחות MS-agar.
- הכינו קופסת חיסון קטנה שגדולה רק במעט מצלחת פטרי.
- הכינו צלחות אגאר בינוניות (1.5%) בעוצמה של 1/2 ו-Skoog (MS). הוסיפו תיאבנדזול (40 מ"ג/ליטר) כדי להפחית את זיהום העובש במידת הצורך. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש.
- חותכים עלה אחד או שניים מורחבים במלואם מבסיס הפטיולה כדי שכל צמח בנפרד ייבדק. הכנס את הפטיולה של העלים המנותקים למדיום אגר בזווית של ~30°.
הערה: כל צלחת יכולה להכיל 20-40 עלים, בהתאם לגודל העלים ולצלחת שבה נעשה שימוש (איור 4C). - לחסן את העלים בתוך תא החיסון כמתואר לעיל. הזיזו את הצלחת עם המכסה לתא גידול.
- חותכים חתך קטן של עלה ובודקים את הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים בנקודות זמן ספציפיות.
- להערכת פנוטיפים של זיהום, מעבירים את העלים לצלחת MS-agar אספטית טרייה במינון 4 או 5 dpi. חותכים את בסיס הפטיולה לפני הכנסת העלים למדיום האגר הטרי. להעריך את פנוטיפים המחלה ב 8 או 9 dpi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מציגים שיטה חדשה לחיסון נבגי טחב אבקתיים שקל להכין, להפעיל ולהתאים. איור 1 מראה את ההרכבה של תיבת החיסון הסטנדרטית עם דגש על ייצור המכסה הנשלף המורכב עם רשת קרום של 50 מיקרומטר. איור 2 מראה את הרכבת תא החיסונים. איור 3 ממחיש את השלבים המרכזיים בתהליך החיסון באמצעות מערכת זו. איור 4 מראה קופסאות חיסון אחרות שניתן להשתמש בהן כדי לחסן צמחים שטוחים שלמים או פחות, או עלים מנותקים על מדיום MS-agar. לבסוף, איור 5 מספק נתונים המדגימים את אחידות החיסון כפי שהיא משתקפת על ידי התפלגות הנבגים או הפנוטיפים של זיהום צמחים.
איור 1. ביצוע קופסת חיסון. (א-ב) תמונות המציגות את הקופסה כשהדלת סגורה (A) או פתוחה להכנסת דירה של צמחי ערבידופסיס (B). שימו לב שזוג מלכודות מגנטיות של דלת ארון משמשות להחזקת הדלת. (C) תמונה המציגה הרכבה של רשת למסגרת המלבן כשלב קריטי להכנת מכסה הקופסה. מהדקי פתקים וסוגריים פינתיים משמשים למיקום הרשת לפני שהיא קבועה על ידי מסמרים מוברגים. (ד-ה) תמונות המציגות את המכסה הנשלף של הקופסה עם רשת נירוסטה חדשה המותקנת (D) או תיבה מורכבת (E). שימו לב שהרשת קבועה בין 3/4 אינץ' לדיבל מרובע מעץ עם אורך מצוין ב-D וב-E. קווים צהובים מדגישים את מידות הגודל של התיבה. קופסת חיסון שמתאימה לדירה סטנדרטית יכולה לשפר מאוד את יעילות הפנוטיפ, במיוחד כאשר יש לחסן הרבה צמחים (למשל, במהלך בדיקה גנטית). מכסה נשלף המורכב עם רשת הופך את הניקוי או ההחלפה של הרשת לקלים יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. ביצוע תא חיסון. (A) תמונה המציגה את ההרכבה הראשונית של ארבעת יריעות האקריל באמצעות מלחציים פינתיים. (B) תמונה הנותנת מבט מלמעלה למטה על תא הפלסטיק. (ג-ד) תמונות המציגות את מערכת החיסונים המורכבת במלואה (C), ואחד משני הצירים המגנטיים (העליונים) והזווית הישרה (למטה) המותקנים על יריעה אקרילית בצד אחד כדלת (D). שימו לב שחלון החיסון מיועד לפירוק וצחצוח נבגים על ידי המשתמש (מתואר על ידי קווים מפוספסים). הקווים הצהובים מדגישים את מידות הגודל של הקופסה. בעל תא חיסון הוא יתרון, אבל בלי זה, חיסון עדיין יכול להתבצע עם תיבת חיסון בחדר קטן עדיין רוח או סביבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. המחשה של תהליך החיסון. (A) תמונות המציגות טחב אבקתי טרי על עלים של צמחים מסומנים. (B) תמונה המראה כיצד לנער נבגים על הרשת על ידי פגיעה עדינה במלקחיים התופסים את העלים הנגועים. (C) תמונות המציגות שתי מברשות מאוורר-בלנדר עדינות והברשה עדינה של נבגים על הרשת. (D) שרטוט סכמטי המראה את כיווני הברשה של הנבגים על הרשת שיכולים לסייע בפיזור שווה של הנבגים בצמחים בתחתית קופסת החיסונים. חשוב לציין כי שימוש בנבגים טריים לחיסון הוא קריטי להדבקה מוצלחת. בהתבסס על הניסיון שלנו, קונידיה המיוצרת על עלים נגועים בין 8 ל -12 dpi הם טריים וניתן לעקור אותם בקלות על ידי ניעור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 4. קופסאות חיסון קרטון פשוטות וזמניות לבדיקות זיהום. (א) קופסת קרטון לחיסון צמחים בדירה סטנדרטית. (B) קופסאות חיסון בינוניות לחיסון פחות צמחים. (C) קופסת חיסון קטנה לחיסון עלים מנותקים בצלחת צלחת פטרי מרובעת המכילה מדיום MS-agar. קווים צהובים מדגישים את מידות הגודל של התיבה. ניתן להשתמש בקופסאות קרטון בגדלים אחרים אם הן מתאימות לדירות המכילות צמחים לבדיקה. אין להשתמש בקופסאות פלסטיק מכיוון שנבגים יכולים להימשך למשטח פלסטיק בשל החשמל הסטטי שלו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5. הערכת אחידות החיסון. (A) שרטוט סכמטי המציג את מיקומן של שש שקופיות מיקרוסקופיות בתחתית דירה. מיקרוגרף מייצג מימין מראה התפלגות נבגים אחידה בשקופית לאחר חיסון כבד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) תרשים עמודות המציג את צפיפות הנבגים המפוזרים בשישה מקומות (1 עד 6) כפי שמוצג ב-(A) לאחר שלושה חיסונים מדומים עם נבגים מארבעה (לחיסון קל) או 15 (לחיסון כבד ) מורחבים לחלוטין עלים נגועים של צמחי pad4-1 . נבגים בשטח של 4 x 0.25 ס"מ2 מופרדים על ידי כיסוי זכוכית מרושת (מ- ibidi USA Inc. או מתוצרת עצמית) על גבי כל שקופית נספרו. לא התגלו הבדלים משמעותיים בצפיפות הנבגים בין שש שקופיות בכל אחת משתי תוכניות החיסון (מבחן t-סטודנט ; עמ' > 0.5). קווי שגיאה מציינים SD. (C) צמחים מייצגים של המוטציה מסוג Arabidopsis Col-0 מסוג בר ו- pad4-1 נגועים ב- G. cichoracearum UCSC1 ב- 12 יום לאחר חיסון כבד. שימו לב שכל צמחי ה-pad4-1 הראו רגישות מוגברת למחלות בהשוואה לצמחי Col-0. גורמים רבים קובעים את אחידות החיסון. באופן כללי, קל יחסית להשיג חיסון אחיד כאשר משתמשים במספיק אינוקולה כדי להגיע לצפיפות של > 50 נבגים לס"מ2. קונידיה טרייה שהתפרקה על ידי ניעור ניתנת לפירוק בקלות ולהברשה בנפרד דרך הרשת. קונידיה ישנה או מתה נוטה ליצור אגרגטים, ולכן קשה לעקור ולפזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לשיטת החיסון מבוססת קופסת הרשת שלנו יש מספר יתרונות על פני שיטות חיסון אחרות. ראשית, הוא יכול להשיג התפלגות שווה של נבגים אם הוא מופעל כראוי, כפי שמודגם באיור 5. שנית, השימוש ברשת של ~50 מיקרומטר, בתוספת ניתוק נבגים על ידי ניעור עדין של עלים נגועים יכול להפחית את זיהום הצמחים על ידי תריפסים או חרקים אחרים המדביקים צמחים הנמצאים בצמחי המקור. שלישית, שימוש בקופסאות חיסון בגדלים שונים לחיסון צמחים או עלים מנותקים בתוך תא הפלסטיק (את שניהם ניתן לנקות בקלות על ידי ריסוס 75% אתנול) יכול לעשות שימוש יעיל יותר באינוקולום ולהפחית זיהום צולב. מצאנו שאף נבג פטרייתי או מעט מאוד לא ברח מתאי החיסון במהלך כל תהליך החיסון.
קופסת חיסון באיכות טובה היא המפתח להבטחת חיסון אחיד. מצאנו שקופסת החיסון הסטנדרטית יכולה לשמש לחיסון צמחים צעירים ובוגרים של ערבידופסיס (איור 1), שתילים של תות שדה, גדילן זורע ו-N. benthamiana (לא מוצג). גובה הקופסה יכול לגדול עוד יותר אם הצמחים גבוהים מחמישה סנטימטרים כדי להבטיח מרחק מספיק (> 5 אינץ') מהרשת לצמחים שמתחתיה כדי לאפשר פיזור נבגים שווה. גובה תא הפלסטיק עשוי גם הוא לגדול בהתאם כדי לאפשר מרחב מספיק לתמרון פריקת נבגים וצחצוח בחלק העליון של קופסת החיסונים.
הרכבה אחידה והדוקה של רשת ~ 50 מיקרומטר לבחירה למכסה קופסת החיסון חשובה ודורשת זהירות יתרה. גודל הנקבוביות מעט גדול יותר מנבגי הטחב האבקתי שקוטרם בעיקר 30-40 מיקרומטר. ניתן לנקות את המכסה על ידי שטיפה במי ברז או בתרסיס עם 75% אתנול לאחר השימוש. אנו ממליצים על שימוש ברשת נירוסטה 48 מיקרומטר, מכיוון שהרשת עמידה יותר ותחזיק מעמד זמן רב יותר.
תא החיסונים יוצר סביבה דוממת ברוח וממזער את בריחת הנבגים במהלך ניתוק הנבגים ו/או הצחצוח. התא עשוי זכוכית פלסטיק שקופה, כך שהמשתמש יכול לראות בעין בלתי אם הנבגים שפורקו מפוזרים פחות או יותר באופן שווה על הרשת לפני הצחצוח. זה חשוב במיוחד אם נדרש חיסון קל ואחיד. צחצוח עדין אך מהיר בכיוונים שונים חשוב גם הוא מכיוון שהוא יכול לפזר נבגים מצטברים ולדחוף אותם דרך הנקבוביות בנפרד, ולהשיג פיזור שווה לאחר שהנבגים נופלים ומתיישבים לתחתית קופסת החיסון. לטיפול קל, תא החיסון צריך להיות ממוקם על שולחן עם גובה מתאים, כך נבגים ניתוק וצחצוח יכול להיעשות בקלות עם הידיים דרך החלון של החדר.
ניתן להגדיל או להקטין את ההתחסנות המבוססת על תיבת רשת על ידי שימוש בתיבות חיסון בגדלים שונים. קל להכין קופסאות חיסון פשוטות וזמניות לחיסון רשת ויכולות להשיג תוצאות משביעות רצון אם משתמשים בהן כראוי. אמנם, בהשוואה לחיסון בשיטת מגדל ההתיישבות7 המופעלת בוואקום, שיטה זו עשויה להימשך זמן רב יותר בעקירת נבגים וצחצוח. כמו כן, לחיסון צמחים גדולים וגבוהים, תיבת החיסון הסטנדרטית המתוארת כאן עשויה להיות קטנה מדי ולכן יש להשתמש בתיבת חיסון גדולה יותר ובתא גדול יותר כדי להשיג חיסון שווה. עבור כמה מיני צמחים כגון טבק ומלפפון, עלים מנותקים או cotyledons ניתן לחסן בשיטה זו כדי להעריך את רגישות המחלה של הצמח כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-1901566) ל- S. Xiao. המחברים רוצים להודות ל- F. Coker ו- C. Hooks על תחזוקת מתקן הגידול של המפעל, ולחורחה זמורה על העזרה הטכנית הקשורה לייצור תיבת החיסון והתאים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
