Summary
~ 50 μm ağ ve şeffaf bir plastik odaya sahip bir aşılama kutusundan oluşan basit bir spor dağıtım sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu, bitkileri külleme sporlarıyla eşit şekilde aşılamak için kullanılabilir, böylece incelenen bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Mantar hastalıklarına bağlı mahsul kayıplarının azaltılması, bitki bağışıklığını ve mantar patogenezini yöneten mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını gerektirir ve bu da belirli bir mantar patojeni ile enfeksiyon üzerine bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru bir şekilde belirlenmesini gerektirir. Bununla birlikte, külleme gibi kültürlenemeyen biyotrofik mantar patojenleri ile doğru hastalık fenotiplemesi elde etmek kolay değildir ve bir araştırma projesinin hız sınırlayıcı bir adımı olabilir. Burada, Arabidopsis-külleme etkileşimini örnek olarak kullanarak güvenli, verimli ve kullanımı kolay bir hastalık fenotipleme sistemi geliştirdik. Bu sistem temel olarak üç bileşenden oluşur: (i) mantar sporları olan bir bitki düzlüğünü aşılamak için ~ 50 μm gözenekli paslanmaz çelik veya naylon ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir kapakla donatılmış ahşap bir aşılama kutusu, (ii) içeride aşılama yaparken spor kaçışını en aza indirmek için küçük bir ön açıklığa sahip şeffaf bir plastik oda, ve (iii) eşit ve etkili aşılama için bir spor yerinden çıkarma ve dağıtım yöntemi. Burada açıklanan protokoller, aşılama kutusunu ve plastik odayı düşük bir maliyetle yapmak için adımları ve parametreleri ve külleme sporlarıyla aşılamayı sağlamak için sistemin nasıl kullanılacağına dair bir video gösterimini içerir, böylece hastalık fenotiplemesinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini arttırır.
Introduction
Külleme, çok sayıda gıda bitkisinin ve süs bitkisinin en yaygın ve önemli hastalıklarından biridir1. Külleme hastalıkları çalışmaları, Web of Science'da (Kasım 2020 itibariyle) anahtar kelime olarak "külleme" ile arama sonucu olarak 10.500'den fazla yayının kanıtladığı gibi çok popüler olmuştur. Gerçekten de, külleme (Blumeria graminis ile temsil edilir), Moleküler Bitki Patolojisi2 dergisi tarafından en iyi 10 mantar patojeninden biri olarak kabul edilir. Hastalık duyarlılığının ölçülmesi, hastalık direncine veya duyarlılığına katkıda bulunan bitki genlerinin karakterizasyonunda veya küllemede aday efektör genlerin fonksiyonel olarak tanımlanmasında gerekli bir adımdır. Bununla birlikte, güvenilir hastalık fenotiplemesi, diğer mantar patojenlerinin çoğuna kıyasla külleme ile çok daha zordur, çünkü kısmen, ikincisinin sporlarının aksine, külleme türlerinin sporları (laboratuvar deneyimimize dayanan Golovinomyces cichoracearum UCSC1 gibi) bir su süspansiyonu işleminden geçtikten sonra canlılığın azaldığını göstermektedir 3,4 . Test tesislerinin belirli bir külleme patojeni ile yetersiz ve / veya düzensiz aşılaması, yanlış fenotipleme sonuçlarına yol açabilir.
Külleme çalışmaları için bir dizi aşılama yöntemi bildirilmiştir. Bunlar arasında (i) sporların doğrudan enfekte olmuş yapraklardan test tesislerine fırçalanması5, (ii) test tesisleriiçin bir spor süspansiyonunun püskürtülmesi, (iii) vakumla çalışan bir çökeltme kulesi kullanarak sporların kulenin altındaki bitkilere üflenmesi7 ve (iv) naylon örgü membranın kombinatoryal kullanımı ve ses bazlı titreşim8 . Spor fırçalama (veya tozlama) yönteminin gerçekleştirilmesi kolaydır, ancak doğada eşit değildir, bu nedenle nicel değerlendirme için doğru olmayabilir. Spor püskürtme uygun ve düzgündür, ancak yukarıda belirtildiği gibi zayıf spor çimlenmesine neden olabilir4. Son ikisi (yani, iii-iv), aşılamayı bile sağlayabilen çok gelişmiş yöntemlerdir; Bununla birlikte, her ikisi de aşılama kapasitelerini tek bir olayda aşılanacak bitki sayısı açısından ayarlamada esnek değildir, bu da her iki aparatın da önemsiz olmamasını sağlar ve çalışmaları vakum ve / veya elektrik kaynağının bulunduğu laboratuvar alanlarıyla sınırlıdır.
Laboratuvarımız 20 yılı aşkın bir süredir bitki-külleme etkileşimi ile çalışmaktadır 9,10. Son on yılda, bir dizi aşılama yöntemini test ettik ve yakın zamanda basit ama etkili bir külleme aşılama yöntemi geliştirdik. Bu ağ bazlı spor fırçalama yöntemi, aşılamayı bile sağlayabilir ve basit ve ölçeklenebilirdir, bu nedenle külleme ile çalışan herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca benimsenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bir ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir üst kapaklı standart bir aşılama kutusu yapmak
- Mağazalardan 50 μm naylon membran örgü veya 48 μm paslanmaz çelik örgü (önerilen) rulosu satın alın. Aşınmış ağın değiştirilmesi için 14 inç x 26 inçlik birden fazla parçaya kesmek için yeterince sipariş verdiğinizden emin olun.
- Bir adet 1/4 in x 2 ft x 4 ft orta yoğunluklu sunta veya kontrplak satın alın ve bir aşılama kutusu yapmak için parçalar halinde iki adet 24-1/2 in x 10 ve parçalar halinde iki adet 12 in x 10 kesin. Dört tarafı desteklemek için 8 köşe kelepçesi kullanın.
NOT: Muhafazanın geniş tarafına bakıyorsanız, sol 12 inç x 10 yan yana kalıcı olarak tutturulur ve yandaki sağ 12 inç x 10, dört manyetik yakalama ile yerinde tutulan çıkarılabilir bir kapıdır (Şekil 1A, B). - Sol tarafın her bir iç köşesine, üstten bir inç ve alttan bir inç olmak üzere dört adet 2 inç köşe desteği yerleştirin, bir delik işaretleyin ve delin. Sol kısa tarafı iki uzun tarafa (ön ve arka) kalıcı olarak bağlamak için vidaları kullanın. İki uzun kenar arasındaki iç mesafe 11-1/2 inç değil, 12 inç olmalıdır.
- Köşe kelepçeleri hala yerinde ve sağ kapının uygun şekilde hizalanmasıyla birlikte, sağ çıkarılabilir kapıyı yerinde tutmak için 4 manyetik yakalamanın yerini işaretleyin ve delin. Kapıya bir düğme düğmesi takın. Kapının üst kısmı üst kapağın altında kalıyor (Şekil 1A,B).
- Bir ağ ile çıkarılabilir bir üst kapak yapmak için, uzun ahşap kare dübelini 26 inç ve 12-3/4 inçlik 2 set halinde kesin. Dört parçayı kutunun etrafına sığacak şekilde yapıştırın ve çivileyin - ekran ağı bu çerçeveye tutturulacağından, çerçevenin iç boyutları kutunun dış boyutlarından biraz daha büyüktür.
- Ekran ağını 14 inç x 26 inçten biraz daha az bir değere kesin. Keskin kenarları önlemek için ekranın çerçeveden dışarı çıkmasına izin vermeyin. Çerçevedeki ekranı germek için yardım alın. Ağı çerçeveyle kelepçelerle tutun (Şekil 1C) ve ekranı çerçeveye sabitlemek için sağ zımbalara sahip bir zımba tabancası kullanın.
- İki set daha kısa ahşap kare dübel (21 inç ve 9 inç) kesin ve 4 kısa ahşap kare dübel parçasını kullanarak ağı çerçeve boyunca sıkıca sandviç yapmak için vidalar kullanın (Şekil 1C, D).
2. Aşılama odası yapılması
- Uygun mağazalardan şeffaf akrilik levhalar ve donanım öğeleri satın alın. Şekil 2C'de gösterildiği gibi kutunun ön tarafındaki akrilik levhadaki açma penceresinde 7 inç x 20 kesin.
- Sol ve sağ tarafları, ön (pencereli) ve arka akrilik levhaları Şekil 2A'da gösterildiği gibi 8 köşe kelepçesi kullanarak bir kutuya monte edin. Odanın iç ölçümlerinin üst tabakanın boyutlarına eşit olduğundan emin olun.
NOT: Sağ taraf destek için oradadır ve ön veya arka sayfalara takılmayacaktır. Bilerek diğer sayfalardan 1/2 daha kısadır. Bu sağ taraf, Şekil 2C, D'de gösterildiği gibi altta dik açılı bir menteşe ve üstte iki manyetik yakalama ile yerinde tutulan bir "aşağı çekme" "kanat" kapısı haline gelecektir. - Panelleri birbirine sabitlemek için köşe destekleri kullanın (Şekil 2B, C). Diş tellerini yerinde tutun, keskin bir işaretleyici ile işaretleyin, ortayı delin ve ardından deliği delin.
NOT: Akrilik delmek başka bir şeyi delmekten farklıdır, zorlamayın veya matkabın karşısındaki deliğin tarafı çatlayabilir. Perçin veya vida kullanın. Vidaları aşırı sıkmayın, aksi takdirde akrilik zamanla çatlayabilir. - Muhafazayı arka tarafına çevirin ve 4 köşe kelepçesini çıkarın ve üst tabakayı yerine yerleştirin. İşaretleyin ve delin.
- 3/4 açılı bir braketten yapılmış dik açılı menteşeyi takın. Menteşe çubuğu olarak naylon bir tutma kilidi somunu kullanın. Sıkmayın, bir boşluk bırakın, böylece kapı bu menteşe üzerinde dönecektir.
- İki manyetik kapı mıknatısını #6-32x3/4" tava başlı vidalarla işaretleyin, ortalayın, delin ve takın. Ardından yakalama plakalarını #6-32x3/8" düz başlı vidalarla takın, bkz. Şekil 2C,D.
3. Dairelerdeki bitkilerin aşılanması
- Taze külleme sporlarını inokula olarak hazırlayın (örneğin, Arabidopsis külleme Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Bir büyüme odasında (22 ° C, 6-8 hafta boyunca% 65 bağıl nem) temiz Arabidopsis bağışıklık sistemi baskılı pad4-1 mutant bitki 11 yetiştirin ve yeterli taze külleme sporları oluşturmak için pad4-1 bitkilerinin bir veya yarım düzlüğünü aşılayın (Şekil 3A).
- Enfeksiyon fenotiplerini belirlemek için bitkileri standart 11 in x 21 in x 2.5 in flat olarak yetiştirin.
NOT: Altı ila sekiz hafta boyunca kısa gün (8 saat ışık, 16 saat karanlık; 22 ° C) altında yetiştirilen Arabidopsis bitkileri, külleme ile enfeksiyon testleri için iyidir. - Aşılamadan 8-10 gün sonra enfekte olmuş bitkilerden taze külleme sporları (dpi) mevcut olduğunda, enfeksiyon testi için bir düzlük bitkiyi aşılama odasının içindeki aşılama kutusuna taşıyın (Şekil 1B, 2C).
- Ağır enfekte olmuş 15-20 Arabidopsis yaprağını (veya yaprak / rozet boyutuna ve aşılama seviyesine bağlı olarak 4-6 enfekte rozet) kesin, yoğunlaştırılmış su varsa yaprakların kurumasını bekleyin.
- Bir elinizi kullanarak 1-2 yaprak veya bir çift uzun forseps içeren bir rozet alın ve yaprakları baş aşağı çevirin. Daha sonra, her iki elinizi de odanın açıklığından geçirin ve yaprakları / rozeti aşılama kutusuna monte edilmiş ağın üzerinde yavaşça hareket ettirirken forsepsin koluna bir çift makasla hafifçe vurun (Şekil 3B). Tüm yapraklar veya rozetler kullanılıncaya kadar bunu tekrarlayın.
NOT: Olgun sporlar, enfekte olmuş yaprakların konidioforlarından kolayca çıkacaktır. Ağ üzerindeki sporları mümkün olduğunca eşit bir şekilde yerinden çıkarmaya çalışın. - Sporları ağdan nazikçe fırçalamak için bir veya iki ince fan-blender fırçası kullanın (Şekil 3C). Aşılama kutusunun altındaki bitkilere sporların eşit dağılımını en üst düzeye çıkarmak için ağın tüm yüzeyini dört veya daha fazla kez farklı yönlerde fırçaladığınızdan emin olun (Şekil 3D). Ağa sıkışmış sporları sallamak için fırçalarla ağı birkaç kez hafifçe sıvazlayın.
- Sporların yarım dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Ardından, aşılanmış bitkileri içeren düzlüğü aşılama kutusundan çıkarın. Daireyi plastik bir kubbe ile örtün ve bir büyüme odasına yerleştirin (22 ° C,% 65 bağıl nem). Hastalık fenotiplemesi 5 veya 8 ila 12 dpi 12'de yapılabilir.
4. Bitkileri daha küçük aşılama kutuları ile aşılayın
NOT: Daha az bitkinin aşılanacağı durumlarda, standart aşılama kutusu hala kullanılabilir. Bitkileri kutunun ortasına yerleştirdiğinizden emin olun. İnokuladan tasarruf ederken tüm bitkilerin aşılanmasını sağlamak için bitkileri kaplayan ağ alanındaki sporları yerinden çıkarın ve fırçalayın. Alternatif olarak ve tercihen, daha küçük aşılama kutuları kullanılabilir (aşağıda açıklandığı gibi).
- Karton kutuları bir aşılama kutusuna dönüştürün. Kutunun üst ve alt taraflarını çıkarın, gerekirse sıkılaştırmak için köşeyi bantlayın ve yapıştırarak veya zımbalayarak üste uygun boyutta 50 μm'lik bir ağ takın (Şekil 4A, B).
- Bitkileri içeren düzlüğü aşılama odasının içinde hareket ettirin, bitkileri örtmek için daha küçük aşılama kutusunu dairenin üzerine yerleştirin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi sporları yerinden çıkarın ve fırçalayın.
5. Petri yemeklerinde müstakil yaprakları aşılayın
NOT: (i) taze külleme sporlarının çok sınırlı olduğu ve/veya (ii) enfekte hücrelerdeki hastalık fenotipleri ve/veya protein hücre altı lokalizasyonunun değerlendirilmesi gerekirken bitkilerin temiz tutulması gereken durumlarda, MS-agar plakalarında enfeksiyon için ayrılmış yapraklar kullanılabilir.
- Petri kabından sadece biraz daha büyük olan mini bir aşılama kutusu yapın.
- 1/2 mukavemetli Murashige ve Skoog (MS) orta boy agar (% 1.5) plakaları hazırlayın. Gerekirse küf kontaminasyonunu azaltmak için tiyabendazol (40 mg / L) ekleyin. Plakaları 4 °C'de kullanana kadar buzdolabında saklayın.
- Test edilecek her bir bitki için yaprak sapının tabanından bir veya iki tamamen genişlemiş yaprak kökü kesin. Ayrılan yaprakların sapını ~ 30 ° 'lik bir açıyla agar ortamına yerleştirin.
NOT: Her plaka, yaprakların büyüklüğüne ve kullanılan plakaya bağlı olarak 20-40 yaprak içerebilir (Şekil 4C). - Aşılama odasının içindeki yaprakları yukarıda açıklandığı gibi aşılayın. Plakayı kapakla birlikte bir büyüme odasına taşıyın.
- Bir yaprağın küçük bir bölümünü kesin ve proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirli zaman noktalarında kontrol edin.
- Enfeksiyon fenotiplerini değerlendirmek için, yaprakları 4 veya 5 dpi'de taze bir aseptik MS-agar plakasına aktarın. Yaprakları taze agar ortamına sokmadan önce yaprak sapının tabanını kesin. Hastalık fenotiplerini 8 veya 9 dpi'de değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, hazırlanması, çalıştırılması ve ayarlanması kolay yeni bir külleme sporu aşılama yöntemi sunuyoruz. Şekil 1 , standart aşılama kutusunun montajını, 50 μm'lik bir membran ağı ile monte edilmiş çıkarılabilir kapağın yapımına vurgu yaparak göstermektedir. Şekil 2 , aşılama odasının montajını göstermektedir. Şekil 3 , bu sistemi kullanarak aşılama sürecinin temel adımlarını göstermektedir. Şekil 4 , bütün bir düz veya daha az bitkiyi veya MS-agar ortamındaki müstakil yaprakları aşılamak için kullanılabilecek diğer aşılama kutularını göstermektedir. Son olarak, Şekil 5 , spor dağılımı veya bitki enfeksiyonu fenotipleri tarafından yansıtılan aşılama düzgünlüğünü göstermek için veri sağlar.
Şekil 1. Bir aşılama kutusu yapmak. (A-B) Arabidopsis bitkilerinin (B) bir düzlüğünü yerleştirmek için kapısı kapalı (A) veya açık olan kutuyu gösteren fotoğraflar. Kapıyı tutmak için bir çift dolap kapısı manyetik yakalama aletinin kullanıldığını unutmayın. (C) Kutunun kapağını yapmak için kritik bir adım olarak dikdörtgen çerçeveye bir ağın monte edilmesini gösteren bir fotoğraf. Not Kelepçeler ve köşe braketleri, vidalı çivilerle sabitlenmeden önce ağı konumlandırmak için kullanılır. (D-E) Kutunun çıkarılabilir kapağını, yeni bir paslanmaz çelik ağ monte edilmiş (D) veya monte edilmiş bir kutu (E) ile gösteren fotoğraflar. Ağın D ve E cinsinden belirtilen uzunluğa sahip 3/4 inç ahşap kare dübel arasında sabitlendiğine dikkat edin. Sarı çizgiler kutunun boyut ölçümünü vurgular. Standart bir düzlüğe uyan bir aşılama kutusuna sahip olmak, özellikle birçok bitkinin aşılanması gerektiğinde (örneğin, genetik bir tarama sırasında) fenotipleme verimliliğini büyük ölçüde artırabilir. Bir ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir kapak, ağın temizlenmesini veya değiştirilmesini kolaylaştırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Bir aşılama odası yapmak. (A) Dört akrilik levhanın köşe kelepçeleri kullanılarak ilk montajını gösteren bir fotoğraf. (B) Plastik haznenin yukarıdan aşağıya görünümünü veren bir fotoğraf. (C-D) Tamamen monte edilmiş aşılama sistemini (C) ve kapı (D) olarak bir yan akrilik levhaya monte edilmiş iki manyetik yakalamadan (üst) ve dik açılı menteşelerden (alt) birini gösteren fotoğraflar. Aşılama penceresinin, kullanıcı tarafından sporların yerinden sökülmesi ve fırçalanması için olduğunu unutmayın (çanaklı çizgilerle gösterilmiştir). Sarı çizgiler kutunun boyut ölçümünü vurgular. Bir aşılama odasına sahip olmak bir artıdır, ancak onsuz, aşılama hala küçük bir rüzgar odasında veya ortamında bir aşılama kutusu ile yapılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Aşılama sürecinin illüstrasyonu. (A) Belirtilen bitkilerin yapraklarında taze külleme gösteren resimler. (B) Enfekte olmuş yaprakları tutan forsepslere hafifçe vurarak ağ üzerindeki sporların nasıl sallanacağını gösteren bir resim. (C) İki ince fan-blender fırçasını ve ağ üzerindeki sporların nazikçe fırçalanmasını gösteren resimler. (D) Aşılama kutusunun altındaki bitkilerde eşit spor dağılımına neden olabilecek ağ üzerindeki spor fırçalama yönlerini gösteren şematik bir çizim. Aşılama için taze sporların kullanılmasının başarılı enfeksiyon için kritik öneme sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Deneyimlerimize dayanarak, 8 ila 12 dpi arasında enfekte yapraklarda üretilen konidia tazedir ve sallanarak kolayca yerinden çıkarılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Enfeksiyon testleri için basit, geçici karton aşılama kutuları. (A) Standart bir dairedeki bitkileri aşılamak için bir karton kutu. (B) Daha az bitki aşılamak için orta büyüklükte aşılama kutuları. (C) MS-agar ortamı içeren kare petri kabı plakasında müstakil yaprakları aşılamak için küçük bir aşılama kutusu. Sarı çizgiler kutunun boyut ölçümünü vurgular. Test edilecek bitkileri içeren dairelere uyuyorlarsa diğer boyutlardaki karton kutular kullanılabilir. Plastik kutular kullanılmamalıdır, çünkü statik elektriği nedeniyle sporlar plastik yüzeye çekilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Aşılama düzgünlüğünün değerlendirilmesi. (A) Bir dairenin dibindeki altı mikroskobik slaytın konumlarını gösteren şematik bir çizim. Sağdaki temsili bir mikrograf, ağır bir aşılamadan sonra slayttaki spor dağılımını bile gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Dört (hafif aşılama için) veya 15 (ağır aşılama için) tamamen genişlemiş enfekte olmuş pad4-1 bitkilerinin enfekte yapraklarından oluşan sporlarla yapılan üç sahte aşılamadan sonra (A) 'da gösterildiği gibi altı yerde (1 ila 6) dağılmış sporların yoğunluğunu gösteren bir çubuk grafik. Her slaytın üstünde ızgaralı cam kapak kayması (ibidi USA Inc.'den veya kendi kendine yapılmış) ile sınırlandırılmış 4 x0.25 cm2'lik bir alandaki sporlar sayılmıştır. İki aşılama şemasının her birinde altı slayt arasında spor yoğunluğunda anlamlı bir fark saptanmamıştır (Öğrenci t-testi; p > 0.5). Hata çubukları SD. (C) Arabidopsis Col-0 vahşi tipi ve pad4-1 mutantının temsili bitkileri, ağır bir aşılamadan 12 gün sonra G. cichoracearum UCSC1 ile enfekte olmuştur. Tüm pad4-1 bitkilerinin Col-0 bitkilerine kıyasla daha fazla hastalık duyarlılığı gösterdiğini unutmayın. Aşılama düzgünlüğünü birden fazla faktör belirler. Genel olarak, 50 spor /cm2'>lik bir yoğunluğa ulaşmak için yeterli miktarda inoküla kullanıldığında aşılamayı bile elde etmek nispeten daha kolaydır. Sallanarak yerinden çıkarılan taze konidia kolayca ayrıştırılabilir ve ağ boyunca ayrı ayrı fırçalanabilir. Eski veya ölü konidia agregalar oluşturma eğilimindedir, bu nedenle yerinden çıkması ve dağılması zordur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meshed-box tabanlı aşılama yöntemimizin diğer aşılama yöntemlerine göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, Şekil 5'te gösterildiği gibi, düzgün bir şekilde çalıştırılırsa sporların eşit dağılımını sağlayabilir. İkincisi, ~ 50 μm ağın kullanılması, artı enfekte olmuş yaprakların hafifçe sallanmasıyla sporun yerinden çıkarılması, kaynak bitkilerde bulunan thrips veya diğer bitki enfekte edici böcekler tarafından bitki enfeksiyonunu azaltabilir. Üçüncüsü, bitkileri aşılamak için farklı boyutlarda aşılama kutularının veya plastik haznenin içindeki ayrılmış yaprakların kullanılması (her ikisi de% 75 etanol püskürtülerek kolayca temizlenebilir), inokulumun daha etkili kullanılmasını sağlayabilir ve çapraz kontaminasyonu azaltabilir. Tüm aşılama işlemi boyunca aşılama odalarından hiç mantar sporunun kaçmadığını veya çok az olduğunu bulduk.
Kaliteli bir aşılama kutusu, eşit aşılamayı sağlamak için anahtardır. Standart aşılama kutusunun Arabidopsis'in genç ve olgun bitkilerini (Şekil 1), çilek fidelerini, ekmek devedikeni ve N. benthamiana'yı (gösterilmemiştir) aşılamak için kullanılabileceğini bulduk. Bitkilerin eşit spor dağılımına izin vermek için ağdan altındaki bitkilere yeterli mesafeyi (> 5 inç) sağlamak için beş inçten daha uzun olması durumunda kutunun yüksekliği daha da artabilir. Plastik haznenin yüksekliği, aşılama kutusunun üstünde spor yerinden oynama ve fırçalama manevrası için yeterli alana izin vermek için buna göre artabilir.
Aşılama kutusunun kapağına ~ 50 μm'lik bir ağın eşit ve sıkı bir şekilde monte edilmesi önemlidir ve ekstra özen gerektirir. Gözenek boyutu, çoğunlukla 30-40 μm çapında olan külleme sporlarından biraz daha büyüktür. Kapak, musluk suyuyla yıkanarak veya kullanımdan sonra% 75 etanol ile püskürtülerek temizlenebilir. 48 μm paslanmaz çelik bir ağın kullanılmasını öneririz, çünkü ağ daha dayanıklıdır ve daha uzun süre dayanır.
Aşılama odası, rüzgarla hareketsiz bir ortam yaratır ve sporun yerinden çıkması ve / veya fırçalanması sırasında spor kaçışını en aza indirir. Oda şeffaf plastik camdan yapılmıştır, böylece kullanıcı yerinden çıkan sporların fırçalamadan önce ağ üzerinde az ya da çok eşit olarak dağılıp dağılmadığını çıplak gözle görebilir. Bu özellikle bir ışık ve hatta aşılama gerektiğinde önemlidir. Farklı yönlerde nazikçe ama hızlı bir şekilde fırçalamak, agrega sporlarını dağıtabildiği ve gözeneklerden ayrı ayrı itebileceği, sporlar düştükten ve aşılama kutusunun dibine yerleştikten sonra eşit dağılım elde edebileceği için de önemlidir. Kolay kullanım için, aşılama odası, uygun yüksekliğe sahip bir masaya yerleştirilmelidir, böylece spor yerinden çıkma ve fırçalama, odanın penceresinden eller ile kolayca yapılabilir.
Meshed box tabanlı aşılama, farklı boyutlardaki aşılama kutuları kullanılarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Basit, geçici örgülü aşılama kutularının yapımı kolaydır ve doğru kullanıldığında tatmin edici sonuçlar elde edebilir. Kuşkusuz, vakumla çalışan çökeltme kulesi yöntem7 ile aşılamaya kıyasla, bu yöntem spor-yerinden çıkarma ve fırçalamada daha uzun zaman alabilir. Ayrıca, büyük ve uzun boylu bitkileri aşılamak için, burada açıklanan standart aşılama kutusu çok küçük olabilir, bu nedenle aşılamayı bile sağlamak için daha büyük bir aşılama kutusu ve daha büyük bir oda kullanılmalıdır. Tütün ve salatalık gibi bazı bitki türleri için, tüm bitkinin hastalık duyarlılığını değerlendirmek için müstakil yapraklar veya kotiledonlar bu yöntemle aşılanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-1901566) tarafından S. Xiao'ya desteklendi. Yazarlar, bitki yetiştirme tesisinin bakımı için F. Coker ve C. Hooks'a ve aşılama kutusunun ve odasının imalatıyla ilgili teknik yardım için Jorge Zamora'ya teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
