Summary

Arabidopsis ve diğer bitkilerin külleme enfeksiyonu fenotiplerini doğru bir şekilde değerlendirmek için kolay ve esnek bir aşılama yöntemi

Published: March 09, 2021
doi:

Summary

~ 50 μm ağ ve şeffaf bir plastik odaya sahip bir aşılama kutusundan oluşan basit bir spor dağıtım sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu, bitkileri külleme sporlarıyla eşit şekilde aşılamak için kullanılabilir, böylece incelenen bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Abstract

Mantar hastalıklarına bağlı mahsul kayıplarının azaltılması, bitki bağışıklığını ve mantar patogenezini yöneten mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını gerektirir ve bu da belirli bir mantar patojeni ile enfeksiyon üzerine bitkilerin hastalık fenotiplerinin doğru bir şekilde belirlenmesini gerektirir. Bununla birlikte, külleme gibi kültürlenemeyen biyotrofik mantar patojenleri ile doğru hastalık fenotiplemesi elde etmek kolay değildir ve bir araştırma projesinin hız sınırlayıcı bir adımı olabilir. Burada, Arabidopsis-külleme etkileşimini örnek olarak kullanarak güvenli, verimli ve kullanımı kolay bir hastalık fenotipleme sistemi geliştirdik. Bu sistem temel olarak üç bileşenden oluşur: (i) mantar sporları olan bir bitki düzlüğünü aşılamak için ~ 50 μm gözenekli paslanmaz çelik veya naylon ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir kapakla donatılmış ahşap bir aşılama kutusu, (ii) içeride aşılama yaparken spor kaçışını en aza indirmek için küçük bir ön açıklığa sahip şeffaf bir plastik oda, ve (iii) eşit ve etkili aşılama için bir spor yerinden çıkarma ve dağıtım yöntemi. Burada açıklanan protokoller, aşılama kutusunu ve plastik odayı düşük bir maliyetle yapmak için adımları ve parametreleri ve külleme sporlarıyla aşılamayı sağlamak için sistemin nasıl kullanılacağına dair bir video gösterimini içerir, böylece hastalık fenotiplemesinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini arttırır.

Introduction

Külleme, çok sayıda gıda bitkisinin ve süs bitkisinin en yaygın ve önemli hastalıklarından biridir1. Külleme hastalıkları çalışmaları, Web of Science’da (Kasım 2020 itibariyle) anahtar kelime olarak “külleme” ile arama sonucu olarak 10.500’den fazla yayının kanıtladığı gibi çok popüler olmuştur. Gerçekten de, külleme (Blumeria graminis ile temsil edilir), Moleküler Bitki Patolojisi2 dergisi tarafından en iyi 10 mantar patojeninden biri olarak kabul edilir. Hastalık duyarlılığının ölçülmesi, hastalık direncine veya duyarlılığına katkıda bulunan bitki genlerinin karakterizasyonunda veya küllemede aday efektör genlerin fonksiyonel olarak tanımlanmasında gerekli bir adımdır. Bununla birlikte, güvenilir hastalık fenotiplemesi, diğer mantar patojenlerinin çoğuna kıyasla külleme ile çok daha zordur, çünkü kısmen, ikincisinin sporlarının aksine, külleme türlerinin sporları (laboratuvar deneyimimize dayanan Golovinomyces cichoracearum UCSC1 gibi) bir su süspansiyonu işleminden geçtikten sonra canlılığın azaldığını göstermektedir 3,4 . Test tesislerinin belirli bir külleme patojeni ile yetersiz ve / veya düzensiz aşılaması, yanlış fenotipleme sonuçlarına yol açabilir.

Külleme çalışmaları için bir dizi aşılama yöntemi bildirilmiştir. Bunlar arasında (i) sporların doğrudan enfekte olmuş yapraklardan test tesislerine fırçalanması5, (ii) test tesisleriiçin bir spor süspansiyonunun püskürtülmesi, (iii) vakumla çalışan bir çökeltme kulesi kullanarak sporların kulenin altındaki bitkilere üflenmesi7 ve (iv) naylon örgü membranın kombinatoryal kullanımı ve ses bazlı titreşim8 . Spor fırçalama (veya tozlama) yönteminin gerçekleştirilmesi kolaydır, ancak doğada eşit değildir, bu nedenle nicel değerlendirme için doğru olmayabilir. Spor püskürtme uygun ve düzgündür, ancak yukarıda belirtildiği gibi zayıf spor çimlenmesine neden olabilir4. Son ikisi (yani, iii-iv), aşılamayı bile sağlayabilen çok gelişmiş yöntemlerdir; Bununla birlikte, her ikisi de aşılama kapasitelerini tek bir olayda aşılanacak bitki sayısı açısından ayarlamada esnek değildir, bu da her iki aparatın da önemsiz olmamasını sağlar ve çalışmaları vakum ve / veya elektrik kaynağının bulunduğu laboratuvar alanlarıyla sınırlıdır.

Laboratuvarımız 20 yılı aşkın bir süredir bitki-külleme etkileşimi ile çalışmaktadır 9,10. Son on yılda, bir dizi aşılama yöntemini test ettik ve yakın zamanda basit ama etkili bir külleme aşılama yöntemi geliştirdik. Bu ağ bazlı spor fırçalama yöntemi, aşılamayı bile sağlayabilir ve basit ve ölçeklenebilirdir, bu nedenle külleme ile çalışan herhangi bir laboratuvar tarafından kolayca benimsenmelidir.

Protocol

1. Bir ağ ile monte edilmiş çıkarılabilir bir üst kapaklı standart bir aşılama kutusu yapmak Mağazalardan 50 μm naylon membran örgü veya 48 μm paslanmaz çelik örgü (önerilen) rulosu satın alın. Aşınmış ağın değiştirilmesi için 14 inç x 26 inçlik birden fazla parçaya kesmek için yeterince sipariş verdiğinizden emin olun. Bir adet 1/4 in x 2 ft x 4 ft orta yoğunluklu sunta veya kontrplak satın alın ve bir aşılama kutusu yapmak için parçalar halinde iki adet 24-1…

Representative Results

Burada, hazırlanması, çalıştırılması ve ayarlanması kolay yeni bir külleme sporu aşılama yöntemi sunuyoruz. Şekil 1 , standart aşılama kutusunun montajını, 50 μm’lik bir membran ağı ile monte edilmiş çıkarılabilir kapağın yapımına vurgu yaparak göstermektedir. Şekil 2 , aşılama odasının montajını göstermektedir. Şekil 3 , bu sistemi kullanarak aşılama sürecinin temel adımlarını göstermek…

Discussion

Meshed-box tabanlı aşılama yöntemimizin diğer aşılama yöntemlerine göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, Şekil 5’te gösterildiği gibi, düzgün bir şekilde çalıştırılırsa sporların eşit dağılımını sağlayabilir. İkincisi, ~ 50 μm ağın kullanılması, artı enfekte olmuş yaprakların hafifçe sallanmasıyla sporun yerinden çıkarılması, kaynak bitkilerde bulunan thrips veya diğer bitki enfekte edici böcekler tarafından bitki enfeksiyonunu azaltabili…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-1901566) tarafından S. Xiao’ya desteklendi. Yazarlar, bitki yetiştirme tesisinin bakımı için F. Coker ve C. Hooks’a ve aşılama kutusunun ve odasının imalatıyla ilgili teknik yardım için Jorge Zamora’ya teşekkür eder.

Materials

 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"  Amazon NA For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For securing  magnet door catch plates
#8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts Home Depot NA For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20" Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"   Professional Plastics  SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"  Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white Home Depot Model #P110-W For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)  Home Depot  Model #13611  For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp Harbor Freight Tools SKU 63653, 1852, 60589 For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack) Home Depot Model #13542 For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles Home Depot Model #15184 For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes Michaels Store M10472846  For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel  Home Depot NA For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');  Home Depot Model# 1508104 For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid ibidi USA Inc. 10816 For determining  spore density

References

  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
  11. Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

Play Video

Cite This Article
Wu, Y., Diaz, D., Yin, J., Bloodgood, D., Sexton, W., Wei, C., Xiao, S. An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants. J. Vis. Exp. (169), e62287, doi:10.3791/62287 (2021).

View Video