Summary
Presentiamo un protocollo per la costruzione di un semplice sistema di distribuzione delle spore costituito da una scatola di inoculazione con una maglia di ~ 50 μm e una camera di plastica trasparente. Questo può essere utilizzato per inoculare uniformemente le piante con spore di oidio, consentendo così una valutazione accurata e riproducibile dei fenotipi di malattia delle piante in studio.
Abstract
Ridurre le perdite di raccolto dovute a malattie fungine richiede una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'immunità delle piante e la patogenesi fungina, che a sua volta richiede una determinazione accurata dei fenotipi di malattia delle piante in seguito all'infezione con un particolare agente patogeno fungino. Tuttavia, un'accurata fenotipizzazione della malattia con patogeni fungini biotrofici non coltivabili come l'oidio non è facile da raggiungere e può essere un passo limitante di un progetto di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un sistema di fenotipizzazione della malattia sicuro, efficiente e facile da usare utilizzando l'interazione Arabidopsis-oidio come esempio. Questo sistema consiste principalmente di tre componenti: (i) una scatola di inoculazione in legno dotata di un coperchio rimovibile montato con una rete in acciaio inossidabile o nylon di ~ 50 μm pori per inoculare un piatto di piante con spore fungine, (ii) una camera di plastica trasparente con una piccola apertura frontale per ridurre al minimo la fuoriuscita di spore durante l'inoculazione all'interno, e iii) un metodo di rimozione e distribuzione delle spore per un'inoculazione uniforme ed efficace. I protocolli qui descritti includono i passaggi e i parametri per realizzare la scatola di inoculazione e la camera di plastica a basso costo e una dimostrazione video di come utilizzare il sistema per consentire l'inoculazione uniforme con spore di oidio, migliorando così l'accuratezza e la riproducibilità della fenotipizzazione della malattia.
Introduction
L'oidio è una delle malattie più comuni e importanti di numerose colture alimentari e piante ornamentali1. Gli studi sulle malattie dell'oidio sono stati molto popolari, come evidenziato da oltre 10.500 pubblicazioni come risultato della ricerca con "oidio" come parola chiave sul Web of Science (a partire da novembre 2020). Infatti, l'oidio (rappresentato da Blumeria graminis) è considerato uno dei primi 10 patogeni fungini dalla rivista Molecular Plant Pathology2. La quantificazione della suscettibilità alla malattia è un passo necessario nella caratterizzazione dei geni vegetali che contribuiscono alla resistenza o alla suscettibilità alle malattie, o nell'identificazione funzionale di geni effettori candidati nell'oidio. Tuttavia, la fenotipizzazione affidabile della malattia è molto più difficile con l'oidio rispetto a quella con la maggior parte degli altri patogeni fungini, in parte perché, a differenza delle spore di questi ultimi, le spore di specie di oidio (come Golovinomyces cichoracearum UCSC1 sulla base della nostra esperienza di laboratorio) mostrano una ridotta vitalità dopo aver attraversato un processo di sospensione dell'acqua 3,4 . L'inoculazione inadeguata e/o irregolare delle piante di prova con un particolare patogeno dell'oidio può portare a risultati di fenotipizzazione imprecisi.
Sono stati riportati diversi metodi di inoculazione per studi sull'oidio. Questi includono (i) spazzolare le spore direttamente dalle foglie infette alle piante di prova5, (ii) spruzzare una sospensione di spore per testare le piante6, (iii) soffiare spore usando una torre di decantazione azionata a vuoto alle piante sul fondo della torre7 e (iv) consegna di spore mediante l'uso combinatorio di una membrana a rete di nylon e vibrazioni basate sul suono8 . Il metodo di spazzolatura delle spore (o spolveratura) è facile da eseguire ma di natura irregolare, quindi potrebbe non essere accurato per la valutazione quantitativa. La spruzzatura di spore è conveniente e uniforme, ma come detto sopra può causare una scarsa germinazione delle spore4. Gli ultimi due (cioè iii-iv) sono metodi molto migliorati in grado di raggiungere anche l'inoculazione; Tuttavia, entrambi non sono flessibili nel regolare la loro capacità di inoculazione in termini di numero di piante da inoculare in un singolo evento, rendendo entrambi gli apparecchi non banali, e il loro funzionamento è limitato alle aree di laboratorio dove c'è un vuoto e / o una fonte di elettricità.
Il nostro laboratorio lavora con l'interazione pianta-oidio da oltre 20 anni 9,10. Negli ultimi dieci anni, abbiamo testato una serie di metodi di inoculazione e recentemente abbiamo sviluppato un metodo di inoculazione dell'oidio semplice ma efficace. Questo metodo di spazzolatura delle spore a rete può garantire un'inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile, quindi dovrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio che lavora con l'oidio.
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Protocol
1. Realizzazione di una scatola di inoculazione standard con un coperchio superiore rimovibile montato con una rete
- Acquista un rotolo di rete a membrana di nylon da 50 μm o rete in acciaio inossidabile da 48 μm (consigliato) dai negozi. Assicurati di ordinare abbastanza per tagliare in più pezzi da 14 in x 26 pollici per la sostituzione della rete usurata.
- Acquista un pannello di fibra o compensato a media densità da 1/4 in x 2 ft x 4 ft e taglia due 24-1/2 in x 10 in pezzi e due 12 in x 10 in pezzi per fare una scatola di inoculazione. Utilizzare 8 morsetti angolari per sostenere i quattro lati.
NOTA: se rivolto verso il lato largo del contenitore, il lato sinistro 12 in x 10 in è fissato in modo permanente e il lato destro 12 in x 10 in è una porta rimovibile tenuta in posizione da quattro chiusure magnetiche (Figura 1A, B). - Posizionare quattro parentesi graffe angolari da 2 pollici due in ciascun angolo interno del lato sinistro, un pollice dall'alto e un pollice dal basso, segnare e praticare un foro. Utilizzare le viti per fissare in modo permanente il lato corto sinistro a due lati lunghi (anteriore e posteriore). La distanza interna tra i due lati lunghi dovrebbe essere 12 in e non 11-1/2 in.
- Con i morsetti angolari ancora in posizione e il corretto allineamento della porta destra, contrassegnare e forare la posizione dei 4 fermi magnetici per mantenere la porta staccabile destra in posizione. Installare una manopola a pulsante sulla porta. La parte superiore della porta si blocca sotto il coperchio superiore (Figura 1A,B).
- Per realizzare un coperchio superiore rimovibile con una rete, tagliare il lungo tassello quadrato di legno in 2 set da 26 pollici e 12-3/4 pollici. Incolla e inchioda i quattro pezzi in modo tale che si adattino alla scatola - le dimensioni interne del telaio sono un po 'più grandi delle dimensioni esterne della scatola, poiché la rete dello schermo sarà attaccata a questa cornice.
- Taglia la mesh dello schermo a poco meno di 14 pollici x 26 pollici. Non lasciare che lo schermo sporga oltre la cornice in modo da evitare spigoli vivi. Avere assistenza per allungare lo schermo sul telaio. Tenere la rete con il telaio tramite morsetti (Figura 1C) e utilizzare una pistola cucitrice con le graffette giuste per fissare lo schermo al telaio.
- Tagliare due serie di tasselli quadrati di legno più corti (21 pollici e 9 pollici) e utilizzare viti per inserire saldamente la rete lungo il telaio usando i 4 pezzi più corti di tassello quadrato di legno (Figura 1C, D).
2. Fare una camera di inoculazione
- Acquista fogli acrilici trasparenti e articoli hardware da negozi appropriati. Tagliare un 7 in x 20 nella finestra di apertura sul foglio acrilico sul lato anteriore della scatola come mostrato nella Figura 2C.
- Assemblare i lati sinistro e destro, anteriore (con finestra) e posteriore in una scatola utilizzando 8 morsetti angolari come mostrato nella Figura 2A. Assicurarsi che le misure interne della camera siano uguali alle dimensioni del foglio superiore.
NOTA: il lato destro è lì per il supporto e non sarà attaccato ai fogli anteriore o posteriore. È 1/2 in più corto rispetto agli altri fogli di proposito. Questo lato destro diventerà una porta "a ribalta" tenuta in posizione da una cerniera ad angolo retto nella parte inferiore e da due chiusure magnetiche nella parte superiore, come mostrato nella figura 2C,D. - Utilizzare parentesi graffe angolari per fissare insieme i pannelli (Figura 2B,C). Tenere le parentesi graffe in posizione, contrassegnare con un pennarello, centrare il pugno e quindi praticare il foro.
NOTA: la perforazione dell'acrilico è diversa dalla perforazione di qualsiasi altra cosa, non forzare o il lato del foro opposto al trapano potrebbe rompersi. Utilizzare rivetti o viti. Non stringere eccessivamente le viti o l'acrilico potrebbe rompersi con il tempo. - Ruotare la custodia sul lato posteriore e rimuovere i 4 morsetti angolari e posizionare il foglio superiore in posizione. Segna e trapano.
- Installare la cerniera ad angolo retto, realizzata con un tutore angolare da 3/4. Utilizzare un dado di bloccaggio in nylon come asta di cerniera. Non stringere, lasciare uno spazio vuoto in modo che la porta ruoti su questa cerniera.
- Segnare, centrare, forare e fissare i due magneti magnetici per porte con viti a testa pentola #6-32x3/4". Quindi fissare le piastre di fissaggio con viti a testa piatta #6-32x3/8", vedere Figura 2C, D.
3. Inoculare piante in appartamento
- Preparare spore fresche di oidio come inoculi (ad esempio, Arabidopsis oidio Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Coltivare piante mutanti pad4-1 pulite immuno-compromesse di Arabidopsis 11 in una camera di crescita (22 °C, 65% di umidità relativa per 6-8 settimane) e inoculare una o mezza piatta di piante pad4-1 per accumulare spore di oidio fresco sufficienti (Figura 3A).
- Coltiva le piante per determinare i fenotipi di infezione in standard 11 in x 21 in x 2,5 in appartamenti.
NOTA: Le piante di Arabidopsis coltivate a breve giorno (8 ore di luce, 16 ore di buio; 22 ° C) per sei-otto settimane sono buone per i test di infezione con oidio. - Quando sono disponibili spore fresche di oidio da piante infette a 8-10 giorni dopo l'inoculazione (dpi), spostare un piatto di piante per il test di infezione nella scatola di inoculazione all'interno della camera di inoculazione (Figura 1B,2C).
- Tagliare 15-20 foglie di Arabidopsis fortemente infette (o 4-6 rosette infette, a seconda delle dimensioni della foglia/rosetta e del livello di inoculazione), lasciare asciugare le foglie se c'è acqua condensata.
- Prendi 1-2 foglie o una rosetta con un paio di pinze lunghe usando una mano e affronta le foglie capovolte. Quindi, mettere entrambe le mani attraverso l'apertura della camera e colpire delicatamente il braccio della pinza con un paio di forbici mentre si spostano lentamente le foglie / rosetta sopra la rete montata sulla scatola di inoculazione (Figura 3B). Ripeti questa operazione fino a quando non vengono utilizzate tutte le foglie o le rosette.
NOTA: Le spore mature si sloggiano facilmente dai conidiofori delle foglie infette. Cerca di rimuovere le spore sulla rete nel modo più uniforme possibile. - Utilizzare una o due spazzole sottili per frullatore a ventaglio per spazzolare delicatamente le spore attraverso la rete (Figura 3C). Assicurarsi di spazzolare l'intera superficie della rete in direzioni diverse per quattro o più volte per massimizzare la distribuzione uniforme delle spore sulle piante sul fondo della scatola di inoculazione (Figura 3D). Picchiettare delicatamente la rete per alcune volte con i pennelli per scrollarsi di dosso le spore che sono bloccate nella rete.
- Lascia che le spore si depositino per mezzo minuto. Quindi, spostare fuori l'appartamento contenente le piante inoculate dalla scatola di inoculazione. Coprire l'appartamento con una cupola di plastica e posizionarlo in una camera di crescita (22 °C, 65% di umidità relativa). La fenotipizzazione della malattia può essere eseguita a 5, o da 8 a 12 dpi 12.
4. Inoculare le piante con scatole di inoculazione più piccole
NOTA: Nei casi in cui devono essere inoculate meno piante, è ancora possibile utilizzare la scatola di inoculazione standard. Assicurati di posizionare le piante al centro della scatola. Rimuovere e spazzolare le spore nell'area della rete che copre le piante per garantire che tutte le piante siano inoculate risparmiando inoculi. In alternativa, e preferibilmente, possono essere utilizzate scatole di inoculazione più piccole (come descritto di seguito).
- Converti le scatole di cartone in una scatola di inoculazione. Basta rimuovere i lati superiore e inferiore della scatola, fissare l'angolo per rassodarlo se necessario e montare una maglia da 50 μm opportunamente dimensionata sulla parte superiore mediante incollaggio o pinzatura (Figura 4A,B).
- Spostare l'appartamento contenente le piante all'interno della camera di inoculazione, posizionare la scatola di inoculazione più piccola sopra l'appartamento per coprire le piante.
- Rimuovere e spazzolare le spore come descritto sopra.
5. Inoculare le foglie staccate nelle piastre di Petri
NOTA: Nei casi in cui (i) le spore fresche di oidio sono molto limitate e/o (ii) le piante devono essere mantenute pulite mentre devono essere valutati i fenotipi della malattia e/o la localizzazione subcellulare delle proteine nelle cellule infette, le foglie staccate possono essere utilizzate per l'infezione nelle piastre di MS-agar.
- Crea una mini scatola di inoculazione che sia solo leggermente più grande di una capsula di Petri.
- Preparare 1/2 forza Murashige e Skoog (MS) piastre di agar medio (1,5%). Aggiungere tiabendazolo (40 mg / L) per ridurre la contaminazione della muffa, se necessario. Conservare le piastre a 4 °C in frigorifero fino all'uso.
- Tagliare una o due foglie completamente espanse dalla base del picciolo per ogni singola pianta da testare. Inserire il picciolo delle foglie staccate in agar medium con un angolo di ~30°.
NOTA: Ogni piastra può contenere 20-40 foglie a seconda della dimensione delle foglie e della piastra utilizzata (Figura 4C). - Inoculare le foglie all'interno della camera di inoculazione come descritto sopra. Spostare il piatto con il coperchio in una camera di crescita.
- Tagliare una piccola sezione di una foglia e controllare la localizzazione subcellulare delle proteine in specifici punti temporali.
- Per valutare i fenotipi dell'infezione, trasferire le foglie in una piastra di agar MS asettica fresca a 4 o 5 dpi. Tagliare la base del picciolo prima di inserire le foglie nel mezzo di agar fresco. Valutare i fenotipi della malattia a 8 o 9 dpi.
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Representative Results
Qui presentiamo un nuovo metodo di inoculazione delle spore di oidio che è facile da preparare, utilizzare e regolare. La figura 1 mostra l'assemblaggio della scatola di inoculazione standard con enfasi sulla marca del coperchio rimovibile montato con una maglia a membrana da 50 μm. La figura 2 mostra l'assemblaggio della camera di inoculazione. La figura 3 illustra le fasi chiave del processo di inoculazione utilizzando questo sistema. La figura 4 mostra altre scatole di inoculazione che possono essere utilizzate per inoculare un intero piatto o meno piante, o foglie staccate su terreno MS-agar. Infine, la Figura 5 fornisce dati per dimostrare l'uniformità dell'inoculazione riflessa dalla distribuzione delle spore o dai fenotipi di infezione delle piante.
Figura 1. Fare una scatola di inoculazione. (A-B) Foto che mostrano la scatola con la porta chiusa (A) o aperta per l'inserimento di un appartamento di piante di Arabidopsis (B). Si noti che un paio di chiusure magnetiche della porta dell'armadio vengono utilizzate per tenere la porta. (C) Una foto che mostri il montaggio di una rete al telaio rettangolare come passaggio critico per realizzare il coperchio della scatola. I morsetti e le staffe angolari vengono utilizzati per posizionare la rete prima che venga fissata da chiodi avvitati. (D-E) Foto che mostrano il coperchio rimovibile della scatola con una nuova rete in acciaio inossidabile montata (D) o una scatola assemblata (E). Si noti che la maglia è fissata tra tasselli quadrati di legno da 3/4 di pollice con lunghezza indicata in D ed E. Le linee gialle evidenziano la misura delle dimensioni della scatola. Avere una scatola di inoculazione che si adatta a un appartamento standard può migliorare notevolmente l'efficienza della fenotipizzazione, specialmente quando molte piante devono essere inoculate (ad esempio, durante uno screening genetico). Un coperchio rimovibile montato con una rete facilita la pulizia o la sostituzione della rete. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Fare una camera di inoculazione. (A) Una foto che mostra l'assemblaggio iniziale delle quattro lastre acriliche utilizzando morsetti angolari. (B) Una foto che dia una vista dall'alto verso il basso della camera di plastica. (C-D) Foto che mostrano il sistema di inoculazione completamente assemblato (C) e una delle due cerniere magnetiche (superiore) e ad angolo retto (in basso) installate su un foglio acrilico laterale come porta (D). Si noti che la finestra di inoculazione serve per rimuovere e spazzolare le spore da parte dell'utente (raffigurate da linee bombate). Le linee gialle evidenziano la misura delle dimensioni della scatola. Avere una camera di inoculazione è un vantaggio, ma senza di essa, l'inoculazione può ancora essere eseguita con una scatola di inoculazione in una piccola stanza o ambiente di avvolgimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Illustrazione del processo di inoculazione. (A) Immagini che mostrano l'oidio fresco sulle foglie delle piante indicate. (B) Un'immagine che mostra come scrollarsi di dosso le spore sulla rete colpendo delicatamente la pinza afferrando le foglie infette. (C) Immagini che mostrano due spazzole sottili del frullatore a ventaglio e una delicata spazzolatura delle spore sulla rete. (D) Un disegno schematico che mostra le direzioni di spazzolatura delle spore sulla rete che può aiutare a ottenere una distribuzione uniforme delle spore sulle piante nella parte inferiore della scatola di inoculazione. È importante sottolineare che l'uso di spore fresche per l'inoculazione è fondamentale per il successo dell'infezione. Sulla base della nostra esperienza, i conidi prodotti su foglie infette tra 8 e 12 dpi sono freschi e possono essere facilmente rimossi agitandoli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Scatole di inoculazione di cartone semplici e provvisorie per test di infezione. (A) Una scatola di cartone per inoculare le piante in un appartamento standard. B) Scatole di inoculazione di medie dimensioni per inoculare un minor numero di piante. (C) Una piccola scatola di inoculazione per inoculare foglie staccate in piastra quadrata contenente terreno MS-agar. Le linee gialle evidenziano la misura delle dimensioni della scatola. Le scatole di cartone di altre dimensioni possono essere utilizzate se si adattano agli appartamenti contenenti piante da testare. Le scatole di plastica non devono essere utilizzate perché le spore possono essere attratte dalla superficie di plastica a causa della sua elettricità statica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Valutazione dell'uniformità dell'inoculazione. (A) Un disegno schematico che mostra le posizioni di sei vetrini microscopici sul fondo di un appartamento. Una micrografia rappresentativa sulla destra mostra anche la distribuzione delle spore sul vetrino dopo un'inoculazione pesante. Barra di scala = 200 μm. (B) Un grafico a barre che mostra la densità delle spore distribuite in sei posizioni (da 1 a 6) come mostrato in (A) dopo tre finte inoculazioni con spore da quattro (per inoculazione leggera) o 15 (per inoculazione pesante ) foglie infette completamente espanse di piante pad4-1 . Sono state contate le spore in un'area di 4 x 0,25 cm2 delimitate da una copertina di vetro a griglia (da ibidi USA Inc. o autocostruita) sulla parte superiore di ogni vetrino. Non sono state rilevate differenze significative nella densità delle spore tra sei vetrini in ciascuno dei due schemi di inoculazione (Student t-test; p > 0,5). Le barre di errore indicano SD. (C) Piante rappresentative del mutante wild-type Arabidopsis Col-0 e pad4-1 infettate da G. cichoracearum UCSC1 a 12 giorni dopo una pesante inoculazione. Si noti che tutte le piante pad4-1 hanno mostrato una maggiore suscettibilità alla malattia rispetto alle piante Col-0. Molteplici fattori determinano l'uniformità dell'inoculazione. In generale, è relativamente più facile ottenere un'inoculazione uniforme quando si utilizza abbastanza inoculi per raggiungere una densità di > 50 spore / cm2. I conidi freschi spostati mediante agitazione possono essere facilmente disaggregati e spazzolati singolarmente attraverso la rete. I conidi vecchi o morti tendono a formare aggregati, quindi sono difficili da rimuovere e disperdere. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il nostro metodo di inoculazione basato su mesh-box presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di inoculazione. In primo luogo, può raggiungere una distribuzione uniforme delle spore se utilizzato correttamente, come dimostrato nella Figura 5. In secondo luogo, l'uso di ~ 50 μm di mesh, oltre allo spostamento delle spore mediante un leggero scuotimento delle foglie infette, può ridurre l'infezione delle piante da tripidi o altri insetti che infettano le piante presenti nelle piante di origine. In terzo luogo, l'uso di scatole di inoculazione di dimensioni diverse per inoculare piante o foglie staccate all'interno della camera di plastica (entrambe possono essere pulite facilmente spruzzando etanolo al 75%) può rendere più efficace l'uso dell'inoculo e ridurre la contaminazione incrociata. Abbiamo scoperto che nessuna o pochissime spore fungine sono fuoriuscite dalle camere di inoculazione durante l'intero processo di inoculazione.
Una scatola di inoculazione di buona qualità è fondamentale per garantire un'inoculazione uniforme. Abbiamo scoperto che la scatola di inoculazione standard può essere utilizzata per inoculare piante giovani e mature di Arabidopsis (Figura 1), piantine di fragola, cardo di scrofa e N. benthamiana (non mostrato). L'altezza della scatola può aumentare ulteriormente se le piante sono più alte di cinque pollici per garantire una distanza sufficiente (> 5 pollici) dalla rete alle piante sottostanti per consentire una distribuzione uniforme delle spore. L'altezza della camera di plastica può anche aumentare di conseguenza per consentire uno spazio adeguato per manovrare lo spostamento delle spore e spazzolare sulla parte superiore della scatola di inoculazione.
Il montaggio uniforme e stretto di una maglia di ~ 50 μm di scelta sul coperchio della scatola di inoculazione è importante e richiede particolare attenzione. La dimensione dei pori è leggermente più grande delle spore di oidio che hanno per lo più un diametro di 30-40 μm. Il coperchio può essere pulito lavando con acqua di rubinetto o spruzzando con etanolo al 75% dopo l'uso. Si consiglia l'uso di una rete in acciaio inossidabile da 48 μm, perché la rete è più resistente e durerà più a lungo.
La camera di inoculazione crea un ambiente fermo al vento e riduce al minimo la fuoriuscita di spore durante lo spostamento delle spore e/o la spazzolatura. La camera è realizzata in vetro di plastica trasparente in modo che l'utente possa vedere ad occhio nudo se le spore spostate sono distribuite più o meno uniformemente sulla rete prima della spazzolatura. Ciò è particolarmente importante se è necessaria un'inoculazione leggera e uniforme. Spazzolare delicatamente ma rapidamente in direzioni diverse è anche importante in quanto può disperdere le spore aggregate e spingerle attraverso i pori individualmente, ottenendo una distribuzione uniforme dopo che le spore cadono e si depositano sul fondo della scatola di inoculazione. Per una facile manipolazione, la camera di inoculazione deve essere posizionata su un tavolo con un'altezza adeguata in modo tale che lo spostamento delle spore e la spazzolatura possano essere facilmente eseguiti con le mani attraverso la finestra della camera.
L'inoculazione basata su mesh-box può essere scalata verso l'alto o verso il basso utilizzando scatole di inoculazione di dimensioni diverse. Le scatole di inoculazione a maglie semplici e provvisorie sono facili da realizzare e potrebbero ottenere risultati soddisfacenti se utilizzate correttamente. Certo, rispetto all'inoculazione con il metodo7 della torre di decantazione a vuoto, questo metodo può richiedere più tempo nello spostamento delle spore e nella spazzolatura. Inoltre, per l'inoculazione di piante grandi e alte, la scatola di inoculazione standard qui descritta potrebbe essere troppo piccola, quindi è necessario utilizzare una scatola di inoculazione più grande e una camera più grande per ottenere un'inoculazione uniforme. Per alcune specie vegetali come tabacco e cetriolo, foglie staccate o cotiledoni possono essere inoculate con questo metodo per valutare la suscettibilità alla malattia dell'intera pianta.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (IOS-1901566) a S. Xiao. Gli autori desiderano ringraziare F. Coker e C. Hooks per la manutenzione dell'impianto di crescita delle piante e Jorge Zamora per l'aiuto tecnico associato alla fabbricazione della scatola e della camera di inoculazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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