Summary
Nous présentons un protocole pour la construction d’un système simple de distribution de spores composé d’une boîte d’inoculation avec un maillage de ~50 μm et une chambre en plastique transparente. Cela peut être utilisé pour inoculer uniformément les plantes avec des spores d’oïdium, permettant ainsi une évaluation précise et reproductible des phénotypes de maladies des plantes à l’étude.
Abstract
Pour réduire les pertes de récoltes dues aux maladies fongiques, il faut mieux comprendre les mécanismes régissant l’immunité des plantes et la pathogenèse fongique, ce qui nécessite une détermination précise des phénotypes de maladies des plantes lors de l’infection par un pathogène fongique particulier. Cependant, le phénotypage précis de la maladie avec des pathogènes fongiques biotrophes non cultivables tels que l’oïdium n’est pas facile à réaliser et peut être une étape limitant le taux d’un projet de recherche. Ici, nous avons développé un système de phénotypage de maladies sûr, efficace et facile à utiliser en utilisant l’interaction Arabidopsis-oïdium comme exemple. Ce système se compose principalement de trois composants: (i) une boîte d’inoculation en bois munie d’un couvercle amovible monté avec un treillis en acier inoxydable ou en nylon de ~50 μm pores pour inoculer un plat de plantes avec des spores fongiques, (ii) une chambre en plastique transparent avec une petite ouverture frontale pour minimiser la fuite de spores tout en effectuant l’inoculation à l’intérieur, et iii) une méthode de délogement et de distribution des spores pour une inoculation uniforme et efficace. Les protocoles décrits ici comprennent les étapes et les paramètres pour fabriquer la boîte d’inoculation et la chambre en plastique à faible coût, ainsi qu’une démonstration vidéo de la façon d’utiliser le système pour permettre une inoculation uniforme avec des spores d’oïdium, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité du phénotypage de la maladie.
Introduction
L’oïdium est l’une des maladies les plus courantes et les plus importantes de nombreuses cultures vivrières et plantes ornementales1. Les études sur les maladies de l’oïdium ont été très populaires, comme en témoignent plus de 10 500 publications comme résultat de recherche avec « oïdium » comme mot clé sur le Web of Science (en novembre 2020). En effet, l’oïdium (représenté par Blumeria graminis) est considéré comme l’un des 10 principaux pathogènes fongiques par le journal of Molecular Plant Pathology2. La quantification de la sensibilité aux maladies est une étape nécessaire dans la caractérisation des gènes végétaux contribuant à la résistance ou à la sensibilité aux maladies, ou dans l’identification fonctionnelle des gènes effecteurs candidats dans l’oïdium. Cependant, le phénotypage fiable des maladies est beaucoup plus difficile avec l’oïdium que pour la plupart des autres pathogènes fongiques, en partie parce que, contrairement aux spores de ces derniers, les spores d’espèces d’oïdium (telles que Golovinomyces cichoracearum UCSC1 d’après notre expérience de laboratoire) présentent une viabilité réduite après avoir subi un processus de suspensionaqueuse 3,4 . Une inoculation inadéquate et/ou inégale d’un agent pathogène particulier de l’oïdium dans les plantes d’essai peut entraîner des résultats phénotypiques inexacts.
Un certain nombre de méthodes d’inoculation ont été signalées pour les études sur l’oïdium. Il s’agit notamment (i) du brossage des spores directement des feuilles infectées pour testerles plantes 5, (ii) de la pulvérisation d’une suspension de spores pour tester les plantes6, (iii) du soufflage des spores à l’aide d’une tour de décantation sous vide aux plantes situées au bas de la tour7, et (iv) de l’administration de spores par l’utilisation combinatoire d’une membrane à mailles de nylon et de vibrations basées sur le son8 . La méthode de brossage des spores (ou dépoussiérage) est facile à réaliser, mais de nature inégale, elle peut donc ne pas être précise pour l’évaluation quantitative. La pulvérisation de spores est pratique et uniforme, mais comme indiqué ci-dessus, elle peut entraîner une mauvaise germination des spores4. Les deux dernières (c.-à-d. iii-iv) sont des méthodes très améliorées capables d’obtenir une inoculation uniforme; Cependant, les deux ne sont pas flexibles dans l’ajustement de leur capacité d’inoculation en termes de nombre de plantes à inoculer en un seul événement, ce qui rend l’un ou l’autre appareil n’est pas trivial, et leur fonctionnement est limité aux zones de laboratoire où il y a un vide et / ou une source d’électricité.
Notre laboratoire travaille sur l’interaction plantes-oïdium depuis plus de 20 ans 9,10. Au cours de la dernière décennie, nous avons testé un certain nombre de méthodes d’inoculation et avons récemment mis au point une méthode simple et efficace d’inoculation de l’oïdium. Cette méthode de brossage à mailles peut assurer une inoculation uniforme, et est simple et évolutive, devrait donc être facilement adoptée par tout laboratoire travaillant avec l’oïdium.
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Protocol
1. Fabrication d’une boîte d’inoculation standard avec un couvercle supérieur amovible monté avec un filet
- Achetez un rouleau de treillis de membrane en nylon de 50 μm ou de treillis en acier inoxydable de 48 μm (recommandé) dans les magasins. Assurez-vous d’en commander suffisamment pour couper en plusieurs morceaux de 14 po x 26 po pour remplacer les mailles usées.
- Achetez un panneau de fibres ou de contreplaqué de densité moyenne de 1/4 po x 2 pi x 4 pi et coupez deux pièces de 24-1/2 po x 10 po et deux pièces de 12 po x 10 po pour fabriquer une boîte d’inoculation. Utilisez 8 pinces d’angle pour soutenir les quatre côtés.
NOTA : Si elle fait face au côté large de l’enceinte, le côté gauche de 12 po x 10 po est fixé en permanence et le côté droit de 12 po x 10 po est une porte amovible maintenue en place par quatre prises magnétiques (figure 1A, B). - Placez quatre entretoises de coin de 2 pouces deux dans chaque coin intérieur du côté gauche, un pouce du haut et un pouce du bas, marquez et percez un trou. Utilisez des vis pour fixer de façon permanente le côté court gauche à deux côtés longs (avant et arrière). La distance intérieure entre les deux côtés longs doit être de 12 po et non de 11-1/2 po.
- Avec les pinces d’angle toujours en place et le bon alignement de la porte droite, marquez et percez l’emplacement des 4 prises magnétiques pour maintenir la porte amovible droite en place. Installez un bouton de bouton à la porte. Le haut de la porte s’accroche sous le couvercle supérieur (Figure 1A,B).
- Pour faire un couvercle supérieur amovible avec un treillis, coupez le long goujon carré en bois en 2 ensembles de 26 po et 12-3/4 po. Collez et clouez les quatre pièces de manière à ce qu’elles s’adaptent autour de la boîte - les dimensions intérieures du cadre étant un peu plus grandes que les dimensions extérieures de la boîte, car le maillage de l’écran sera attaché à ce cadre.
- Coupez le maillage de l’écran à un peu moins de 14 po x 26 po. Ne laissez pas l’écran dépasser le cadre afin d’éviter les arêtes vives. Avoir de l’aide pour étirer l’écran sur le cadre. Tenez le treillis avec le cadre à l’aide de pinces (Figure 1C) et utilisez une agrafeuse munie des agrafes appropriées pour fixer l’écran au cadre.
- Coupez deux ensembles de chevilles carrées en bois plus courtes (21 po et 9 po) et utilisez des vis pour prendre en sandwich le maillage le long du cadre à l’aide des 4 morceaux plus courts de cheville carrée en bois (figure 1C, D).
2. Fabrication d’une chambre d’inoculation
- Achetez des feuilles d’acrylique transparentes et des articles de quincaillerie dans les magasins appropriés. Découpez une fenêtre ouvrante de 7 po x 20 po sur la feuille d’acrylique de la face avant de la boîte, comme illustré à la figure 2C.
- Assemblez les côtés gauche et droit, les feuilles d’acrylique avant (avec fenêtre) et arrière dans une boîte à l’aide de 8 pinces d’angle, comme illustré à la figure 2A. Assurez-vous que les mesures intérieures de la chambre sont égales aux dimensions de la feuille supérieure.
REMARQUE: Le côté droit est là pour le support et ne sera pas fixé aux feuilles avant ou arrière. Il est 1/2 en plus court que les autres feuilles exprès. Ce côté droit deviendra une porte à « volet » « rabattable » maintenue en place par une charnière à angle droit en bas et deux prises magnétiques en haut, comme le montre la figure 2C,D. - Utilisez des entretoises d’angle pour fixer les panneaux ensemble (figure 2B,C). Tenez les accolades en place, marquez avec un marqueur sharpie, centrez le poinçon, puis percez le trou.
REMARQUE: Le forage acrylique est différent du perçage de quoi que ce soit d’autre, ne forcez pas ou le côté du trou opposé à la perceuse peut se fissurer. Utilisez des rivets ou des vis. Ne serrez pas trop les vis ou l’acrylique pourrait se fissurer avec le temps. - Tournez le boîtier sur sa face arrière et retirez les 4 pinces d’angle et positionnez la feuille supérieure en place. Marquez et percez.
- Installez la charnière à angle droit, faite d’une attelle d’angle 3/4. Utilisez un écrou de verrouillage de retenue en nylon comme tige de charnière. Ne serrez pas, laissez un espace pour que la porte tourne sur cette charnière.
- Marquez, centrez le poinçon, percez et fixez les deux aimants de porte magnétiques avec des vis à tête panoramique #6-32x3/4 ». Ensuite, fixez les barres de retenue avec des vis à tête plate #6-32x3/8 », voir Figure 2C,D.
3. Inoculer des plantes dans des appartements
- Préparer des spores fraîches d’oïdium sous forme d’inocula (p. ex. oïdium d’Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultiver des plantes mutantes Arabidopsis immunodéprimées pad4-1 11 dans une chambre de croissance (22 °C, 65 % d’humidité relative pendant 6 à 8 semaines) et inoculer un plat ou demi de plantes pad4-1 pour accumuler suffisamment de spores fraîches d’oïdium (Figure 3A).
- Cultivez les plantes pour déterminer les phénotypes d’infection dans des appartements standard de 11 po x 21 po x 2,5 po.
NOTE: Les plantes d’Arabidopsis cultivées sous des journées courtes (8 h de lumière, 16 h d’obscurité; 22 °C) pendant six à huit semaines sont bonnes pour les tests d’infection par l’oïdium. - Lorsque des spores fraîches d’oïdium provenant de plantes infectées sont disponibles 8 à 10 jours après l’inoculation (dpi), déplacer un plat de plantes pour le test d’infection dans la boîte d’inoculation à l’intérieur de la chambre d’inoculation (figure 1B, 2C).
- Coupez 15 à 20 feuilles d’Arabidopsis fortement infectées (ou 4 à 6 rosettes infectées, selon la taille de la feuille / rosette et le niveau d’inoculation), laissez sécher les feuilles s’il y a de l’eau condensée.
- Prenez 1-2 feuilles ou une rosette avec une paire de longues pinces en utilisant une main et faites face aux feuilles à l’envers. Ensuite, passez les deux mains à travers l’ouverture de la chambre et frappez doucement le bras de la pince avec une paire de ciseaux tout en déplaçant lentement les feuilles/rosette au-dessus de la maille montée sur la boîte d’inoculation (Figure 3B). Répétez cette opération jusqu’à ce que toutes les feuilles ou rosettes soient utilisées.
REMARQUE: Les spores matures se délogent facilement des conidiophores des feuilles infectées. Essayez de déloger les spores sur le maillage aussi uniformément que possible. - Utilisez une ou deux brosses fines pour brosser délicatement les spores à travers le filet (figure 3C). Assurez-vous de brosser toute la surface du maillage dans différentes directions pendant quatre fois ou plus afin de maximiser la répartition uniforme des spores sur les plantes au fond de la boîte d’inoculation (figure 3D). Tapotez doucement le filet plusieurs fois avec les brosses pour secouer les spores qui sont coincées dans le maillage.
- Laissez les spores se déposer pendant une demi-minute. Ensuite, sortez l’appartement contenant les plantes inoculées de la boîte d’inoculation. Couvrir l’appartement avec un dôme en plastique et le placer dans une chambre de croissance (22 °C, 65% d’humidité relative). Le phénotypage de la maladie peut être effectué à 5, ou 8 à 12 dpi 12.
4. Inoculer les plantes avec des boîtes d’inoculation plus petites
NOTE: Dans les cas où moins de plantes doivent être inoculées, la boîte d’inoculation standard peut toujours être utilisée. Assurez-vous de placer les plantes au milieu de la boîte. Délogez et brossez les spores dans la zone du maillage qui recouvre les plantes pour vous assurer que toutes les plantes sont inoculées tout en économisant l’inocula. Alternativement, et de préférence, des boîtes d’inoculation plus petites peuvent être utilisées (comme décrit ci-dessous).
- Convertissez les boîtes en carton en boîte d’inoculation. Il suffit de retirer les côtés supérieur et inférieur de la boîte, de coller le coin pour le raffermir si nécessaire et de monter un maillage de 50 μm de taille appropriée sur le dessus en le collant ou en l’agrafant (figure 4A,B).
- Déplacez l’appartement contenant les plantes à l’intérieur de la chambre d’inoculation, placez la plus petite boîte d’inoculation sur le dessus de l’appartement pour couvrir les plantes.
- Déloger et brosser les spores comme décrit ci-dessus.
5. Inoculer les feuilles détachées dans les boîtes de Petri
REMARQUE : Dans les cas où (i) les spores fraîches de l’oïdium sont très limitées et/ou (ii) les plantes doivent être maintenues propres pendant que les phénotypes de la maladie et/ou la localisation sous-cellulaire des protéines dans les cellules infectées doivent être évalués, les feuilles détachées peuvent être utilisées pour l’infection dans les plaques de MS-agar.
- Faites une mini boîte d’inoculation qui n’est que légèrement plus grande qu’une boîte de Pétri.
- Préparer des assiettes de gélose moyenne Murashige et Skoog (MS) de 1/2 concentration (1,5%). Ajouter du thiabendazole (40 mg/L) pour réduire la contamination par les moisissures si nécessaire. Conservez les assiettes à 4 °C au réfrigérateur jusqu’à utilisation.
- Coupez une ou deux feuilles complètement expansées à partir de la base du pétiole pour chaque plante à tester. Insérez le pétiole des feuilles détachées dans un milieu gélosé à un angle de ~30°.
REMARQUE : Chaque plaque peut contenir de 20 à 40 feuilles selon la taille des feuilles et la plaque utilisée (figure 4C). - Inoculer les feuilles à l’intérieur de la chambre d’inoculation comme décrit ci-dessus. Déplacez la plaque avec le couvercle vers une chambre de croissance.
- Coupez une petite section d’une feuille et vérifiez la localisation subcellulaire des protéines à des moments précis.
- Pour évaluer les phénotypes d’infection, transférer les feuilles dans une plaque fraîche aseptique de MS-agar à 4 ou 5 dpi. Couper la base du pétiole avant d’insérer les feuilles dans le milieu gélosé frais. Évaluer les phénotypes de la maladie à 8 ou 9 dpi.
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Representative Results
Ici, nous présentons une nouvelle méthode d’inoculation des spores de l’oïdium qui est facile à préparer, à utiliser et à ajuster. La figure 1 montre l’assemblage de la boîte d’inoculation standard en mettant l’accent sur la marque du couvercle amovible monté avec un treillis à membrane de 50 μm. La figure 2 montre l’assemblage de la chambre d’inoculation. La figure 3 illustre les principales étapes du processus d’inoculation à l’aide de ce système. La figure 4 montre d’autres boîtes d’inoculation qui peuvent être utilisées pour inoculer une plante entière plate ou moins, ou des feuilles détachées sur milieu MS-agar. Enfin, la figure 5 fournit des données pour démontrer l’uniformité de l’inoculation telle que reflétée par la distribution des spores ou les phénotypes d’infection des plantes.
Graphique 1. Fabrication d’une boîte d’inoculation. (A-B) Photos montrant la boîte avec la porte fermée (A) ou ouverte pour insérer un plat de plantes d’Arabidopsis (B). Notez qu’une paire de prises magnétiques de porte d’armoire est utilisée pour maintenir la porte. (C) Une photo montrant le montage d’un maillage sur le cadre rectangulaire comme étape critique pour la fabrication du couvercle de la boîte. Notez que des pinces et des supports d’angle sont utilisés pour positionner le treillis avant qu’il ne soit fixé par des clous vissés. (D-E) Photos montrant le couvercle amovible de la boîte avec un nouveau treillis en acier inoxydable monté (D) ou une boîte assemblée (E). Notez que le maillage est fixé entre 3/4 po de cheville carrée en bois avec la longueur indiquée en D et E. Les lignes jaunes mettent en évidence la mesure de la taille de la boîte. Avoir une boîte d’inoculation qui s’adapte à un plat standard peut grandement améliorer l’efficacité du phénotypage, en particulier lorsque beaucoup de plantes doivent être inoculées (par exemple, lors d’un dépistage génétique). Un couvercle amovible monté avec un treillis facilite le nettoyage ou le remplacement du treillis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Faire une chambre d’inoculation. (A) Une photo montrant l’assemblage initial des quatre feuilles d’acrylique à l’aide de pinces d’angle. (B) Une photo donnant une vue de haut en bas de la chambre en plastique. (C-D) Photos montrant le système d’inoculation entièrement assemblé (C), et l’une des deux charnières magnétiques (supérieures) et à angle droit (en bas) installées sur une feuille d’acrylique latérale comme porte (D). Notez que la fenêtre d’inoculation sert à déloger et à brosser les spores par l’utilisateur (représenté par des lignes pointillées). Les lignes jaunes mettent en évidence la mesure de la taille de la boîte. Avoir une chambre d’inoculation est un plus, mais sans elle, l’inoculation peut toujours être effectuée avec une boîte d’inoculation dans une petite pièce ou un environnement immobile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Illustration du processus d’inoculation. (A) Images montrant de l’oïdium frais sur les feuilles des plantes indiquées. (B) Une image montrant comment secouer les spores sur le maillage en frappant doucement les forceps en saisissant les feuilles infectées. (C) Photos montrant deux pinceaux fins de ventilo-mélangeur et un brossage doux des spores sur le maillage. (D) Un dessin schématique montrant les directions du brossage des spores sur le maillage qui peut aider à obtenir une répartition uniforme des spores sur les plantes au fond de la boîte d’inoculation. Il est important de souligner que l’utilisation de spores fraîches pour l’inoculation est essentielle au succès de l’infection. D’après notre expérience, les conidies produites sur des feuilles infectées entre 8 et 12 dpi sont fraîches et peuvent être facilement délogées par agitation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Boîtes d’inoculation en carton simples et provisoires pour les tests d’infection. (A) Une boîte en carton pour inoculer les plantes dans un appartement standard. (B) Boîtes d’inoculation de taille moyenne pour inoculer moins de plantes. (C) Une petite boîte d’inoculation pour inoculer les feuilles détachées dans une assiette à boîte de Pétri carrée contenant un milieu MS-agar. Les lignes jaunes mettent en évidence la mesure de la taille de la boîte. Des boîtes en carton d’autres tailles peuvent être utilisées si elles s’adaptent aux appartements contenant des plantes à tester. Les boîtes en plastique ne doivent pas être utilisées car les spores peuvent être attirées par la surface en plastique en raison de son électricité statique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Évaluation de l’uniformité de l’inoculation. (A) Un dessin schématique montrant la position de six lames microscopiques sur le fond d’un appartement. Une micrographie représentative à droite montre une distribution uniforme des spores sur la lame après une inoculation lourde. Barre d’échelle = 200 μm. ( B ) Un diagramme à barres montrant la densité des spores réparties à six endroits (1 à 6) comme indiqué en (A) après trois inoculations simulées avec des spores de quatre (pour l’inoculation légère) ou 15 (pour l’inoculation lourde) feuilles infectées complètement expansées de plantes pad4-1 . Les spores d’une zone de 4 x 0,25 cm2 délimitée par un couvercle en verre quadrillé (d’ibidi USA Inc. ou fabriqué par vous-même) au-dessus de chaque diapositive ont été comptées. Aucune différence significative n’a été détectée dans la densité des spores entre six lames dans chacun des deux schémas d’inoculation (test t de Student ; p > 0,5). Les barres d’erreur indiquent SD. (C) Plantes représentatives du mutant de type sauvage Arabidopsis Col-0 et pad4-1 infectés par G. cichoracearum UCSC1 12 jours après une inoculation lourde. Il est à noter que toutes les plantes de pad4-1 présentaient une plus grande sensibilité aux maladies par rapport aux plantes de Col-0. Plusieurs facteurs déterminent l’uniformité de l’inoculation. En général, il est relativement plus facile d’obtenir une inoculation uniforme lorsque suffisamment d’inocula sont utilisés pour atteindre une densité de > 50 spores/cm2. Les conidies fraîches délogées par agitation peuvent être facilement désagrégées et brossées individuellement à travers le maillage. Les conidies âgées ou mortes ont tendance à former des agrégats, elles sont donc difficiles à déloger et à disperser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Notre méthode d’inoculation à base de boîte à mailles présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes d’inoculation. Tout d’abord, il peut atteindre une distribution uniforme des spores s’il est utilisé correctement, comme le montre la figure 5. Deuxièmement, l’utilisation d’un maillage de ~50 μm, ainsi que le délogement des spores par agitation douce des feuilles infectées peuvent réduire l’infection des plantes par les thrips ou d’autres insectes infectant les plantes présents dans les plantes sources. Troisièmement, l’utilisation de boîtes d’inoculation de différentes tailles pour inoculer des plantes ou des feuilles détachées à l’intérieur de la chambre en plastique (qui peuvent toutes deux être nettoyées facilement en pulvérisant de l’éthanol à 75%) peut utiliser plus efficacement l’inoculum et réduire la contamination croisée. Nous avons constaté qu’aucune ou très peu de spores fongiques ne s’échappaient des chambres d’inoculation pendant tout le processus d’inoculation.
Une boîte d’inoculation de bonne qualité est essentielle pour assurer une inoculation uniforme. Nous avons constaté que la boîte d’inoculation standard peut être utilisée pour inoculer des plantes jeunes et matures d’Arabidopsis (Figure 1), des semis de fraise, de chardon des truies et de N. benthamiana (non représenté). La hauteur de la boîte peut encore augmenter si les plantes mesurent plus de cinq pouces pour assurer une distance suffisante (> 5 po) entre le maillage et les plantes situées en dessous pour permettre une distribution uniforme des spores. La hauteur de la chambre en plastique peut également augmenter en conséquence pour laisser suffisamment d’espace pour manœuvrer le délogement des spores et le brossage sur le dessus de la boîte d’inoculation.
Un montage uniforme et serré d’un maillage de ~50 μm de choix sur le couvercle de la boîte d’inoculation est important et nécessite des soins supplémentaires. La taille des pores est légèrement plus grande que celle des spores de l’oïdium qui ont pour la plupart un diamètre de 30 à 40 μm. Le couvercle peut être nettoyé en le lavant à l’eau du robinet ou en pulvérisant avec de l’éthanol à 75% après utilisation. Nous recommandons l’utilisation d’un treillis en acier inoxydable de 48 μm, car le treillis est plus durable et durera plus longtemps.
La chambre d’inoculation crée un environnement propice au vent et minimise la fuite de spores lors du délogement et/ou du brossage des spores. La chambre est en verre plastique transparent afin que l’utilisateur puisse voir à l’œil nu si les spores délogées sont plus ou moins uniformément réparties sur le treillis avant le brossage. Ceci est particulièrement important si une lumière et une inoculation uniforme sont nécessaires. Le brossage doux mais rapide dans différentes directions est également important car il peut disperser les spores agrégées et les pousser à travers les pores individuellement, obtenant une distribution uniforme après la chute des spores et leur dépôt au fond de la boîte d’inoculation. Pour faciliter la manipulation, la chambre d’inoculation doit être placée sur une table d’une hauteur appropriée de sorte que le délogement des spores et le brossage puissent être facilement effectués avec les mains à travers la fenêtre de la chambre.
L’inoculation basée sur une boîte à mailles peut être mise à l’échelle vers le haut ou vers le bas en utilisant des boîtes d’inoculation de différentes tailles. Des boîtes d’inoculation à mailles simples et provisoires sont faciles à fabriquer et pourraient donner des résultats satisfaisants si elles sont utilisées correctement. Certes, par rapport à l’inoculation avec la méthode7 de la tour de décantation sous vide, cette méthode peut prendre plus de temps pour déloger les spores et les brosser. En outre, pour inoculer des plantes grandes et hautes, la boîte d’inoculation standard décrite ici peut être trop petite, donc une boîte d’inoculation plus grande et une chambre plus grande doivent être utilisées pour obtenir une inoculation uniforme. Pour certaines espèces végétales telles que le tabac et le concombre, des feuilles détachées ou des cotylédons peuvent être inoculés avec cette méthode pour évaluer la sensibilité à la maladie de la plante entière.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOS-1901566) à S. Xiao. Les auteurs tiennent à remercier F. Coker et C. Hooks pour l’entretien de l’installation de croissance des plantes, et Jorge Zamora pour l’aide technique associée à la fabrication de la boîte et de la chambre d’inoculation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
- Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
- Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
- Sitterly, W. R. Powdery Mildews. Spencer, D. M. , Academic Press. 369 (1978).
- Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
- Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
- Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
- Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
- Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
- Reuber, T. L., et al. Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants. The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).
- Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).
