Summary

Une méthode d’inoculation simple et flexible pour évaluer avec précision les phénotypes d’oïdium d’Arabidopsis et d’autres plantes

Published: March 09, 2021
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Summary

Nous présentons un protocole pour la construction d’un système simple de distribution de spores composé d’une boîte d’inoculation avec un maillage de ~50 μm et une chambre en plastique transparente. Cela peut être utilisé pour inoculer uniformément les plantes avec des spores d’oïdium, permettant ainsi une évaluation précise et reproductible des phénotypes de maladies des plantes à l’étude.

Abstract

Pour réduire les pertes de récoltes dues aux maladies fongiques, il faut mieux comprendre les mécanismes régissant l’immunité des plantes et la pathogenèse fongique, ce qui nécessite une détermination précise des phénotypes de maladies des plantes lors de l’infection par un pathogène fongique particulier. Cependant, le phénotypage précis de la maladie avec des pathogènes fongiques biotrophes non cultivables tels que l’oïdium n’est pas facile à réaliser et peut être une étape limitant le taux d’un projet de recherche. Ici, nous avons développé un système de phénotypage de maladies sûr, efficace et facile à utiliser en utilisant l’interaction Arabidopsis-oïdium comme exemple. Ce système se compose principalement de trois composants: (i) une boîte d’inoculation en bois munie d’un couvercle amovible monté avec un treillis en acier inoxydable ou en nylon de ~50 μm pores pour inoculer un plat de plantes avec des spores fongiques, (ii) une chambre en plastique transparent avec une petite ouverture frontale pour minimiser la fuite de spores tout en effectuant l’inoculation à l’intérieur, et iii) une méthode de délogement et de distribution des spores pour une inoculation uniforme et efficace. Les protocoles décrits ici comprennent les étapes et les paramètres pour fabriquer la boîte d’inoculation et la chambre en plastique à faible coût, ainsi qu’une démonstration vidéo de la façon d’utiliser le système pour permettre une inoculation uniforme avec des spores d’oïdium, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité du phénotypage de la maladie.

Introduction

L’oïdium est l’une des maladies les plus courantes et les plus importantes de nombreuses cultures vivrières et plantes ornementales1. Les études sur les maladies de l’oïdium ont été très populaires, comme en témoignent plus de 10 500 publications comme résultat de recherche avec « oïdium » comme mot clé sur le Web of Science (en novembre 2020). En effet, l’oïdium (représenté par Blumeria graminis) est considéré comme l’un des 10 principaux pathogènes fongiques par le journal of Molecular Plant Pathology2. La quantification de la sensibilité aux maladies est une étape nécessaire dans la caractérisation des gènes végétaux contribuant à la résistance ou à la sensibilité aux maladies, ou dans l’identification fonctionnelle des gènes effecteurs candidats dans l’oïdium. Cependant, le phénotypage fiable des maladies est beaucoup plus difficile avec l’oïdium que pour la plupart des autres pathogènes fongiques, en partie parce que, contrairement aux spores de ces derniers, les spores d’espèces d’oïdium (telles que Golovinomyces cichoracearum UCSC1 d’après notre expérience de laboratoire) présentent une viabilité réduite après avoir subi un processus de suspensionaqueuse 3,4 . Une inoculation inadéquate et/ou inégale d’un agent pathogène particulier de l’oïdium dans les plantes d’essai peut entraîner des résultats phénotypiques inexacts.

Un certain nombre de méthodes d’inoculation ont été signalées pour les études sur l’oïdium. Il s’agit notamment (i) du brossage des spores directement des feuilles infectées pour testerles plantes 5, (ii) de la pulvérisation d’une suspension de spores pour tester les plantes6, (iii) du soufflage des spores à l’aide d’une tour de décantation sous vide aux plantes situées au bas de la tour7, et (iv) de l’administration de spores par l’utilisation combinatoire d’une membrane à mailles de nylon et de vibrations basées sur le son8 . La méthode de brossage des spores (ou dépoussiérage) est facile à réaliser, mais de nature inégale, elle peut donc ne pas être précise pour l’évaluation quantitative. La pulvérisation de spores est pratique et uniforme, mais comme indiqué ci-dessus, elle peut entraîner une mauvaise germination des spores4. Les deux dernières (c.-à-d. iii-iv) sont des méthodes très améliorées capables d’obtenir une inoculation uniforme; Cependant, les deux ne sont pas flexibles dans l’ajustement de leur capacité d’inoculation en termes de nombre de plantes à inoculer en un seul événement, ce qui rend l’un ou l’autre appareil n’est pas trivial, et leur fonctionnement est limité aux zones de laboratoire où il y a un vide et / ou une source d’électricité.

Notre laboratoire travaille sur l’interaction plantes-oïdium depuis plus de 20 ans 9,10. Au cours de la dernière décennie, nous avons testé un certain nombre de méthodes d’inoculation et avons récemment mis au point une méthode simple et efficace d’inoculation de l’oïdium. Cette méthode de brossage à mailles peut assurer une inoculation uniforme, et est simple et évolutive, devrait donc être facilement adoptée par tout laboratoire travaillant avec l’oïdium.

Protocol

1. Fabrication d’une boîte d’inoculation standard avec un couvercle supérieur amovible monté avec un filet Achetez un rouleau de treillis de membrane en nylon de 50 μm ou de treillis en acier inoxydable de 48 μm (recommandé) dans les magasins. Assurez-vous d’en commander suffisamment pour couper en plusieurs morceaux de 14 po x 26 po pour remplacer les mailles usées. Achetez un panneau de fibres ou de contreplaqué de densité moyenne de 1/4 po x 2 pi x 4 pi et coupez deux pièces de 24-1…

Representative Results

Ici, nous présentons une nouvelle méthode d’inoculation des spores de l’oïdium qui est facile à préparer, à utiliser et à ajuster. La figure 1 montre l’assemblage de la boîte d’inoculation standard en mettant l’accent sur la marque du couvercle amovible monté avec un treillis à membrane de 50 μm. La figure 2 montre l’assemblage de la chambre d’inoculation. La figure 3 illustre les principales étapes du proc…

Discussion

Notre méthode d’inoculation à base de boîte à mailles présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes d’inoculation. Tout d’abord, il peut atteindre une distribution uniforme des spores s’il est utilisé correctement, comme le montre la figure 5. Deuxièmement, l’utilisation d’un maillage de ~50 μm, ainsi que le délogement des spores par agitation douce des feuilles infectées peuvent réduire l’infection des plantes par les thrips ou d’autres insectes in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOS-1901566) à S. Xiao. Les auteurs tiennent à remercier F. Coker et C. Hooks pour l’entretien de l’installation de croissance des plantes, et Jorge Zamora pour l’aide technique associée à la fabrication de la boîte et de la chambre d’inoculation.

Materials

 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48"  Amazon NA For making the lid of an inoculation box
#6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) Home Depot NA For making an inoculation chamber
#6-32×3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts  Home Depot NA For securing  magnet door catch plates
#8-32×1/2" machine screws, flat washers and nuts Home Depot NA For securing corner braces and door hinge
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet;  Size: 17 ½" X 20" Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20"   Professional Plastics  SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30"  Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " Professional Plastics SACR.250CEF For making an inoculation chamber
1-5/8" cabinet door magnetic catch white Home Depot Model #P110-W For making an inoculation chamber
2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack)  Home Depot  Model #13611  For making an inoculation box & chamber
3" Corner Clamp Harbor Freight Tools SKU 63653, 1852, 60589 For making inoculation chamber
3/4"  steel zinc plated corner brace (4-Pack) Home Depot Model #13542 For making an inoculation box & chamber
4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles Home Depot Model #15184 For making an inoculation box
Fine fan-blender brushes Michaels Store M10472846  For inoculation
Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel  Home Depot NA For making the lid of an inoculation box
Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4');  Home Depot Model# 1508104 For making an inoculation box
Round glass coverslips with a 500 µm grid ibidi USA Inc. 10816 For determining  spore density

References

  1. Huckelhoven, R., Panstruga, R. Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).
  2. Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Sakurai, H., Hirata, K. Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue. Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).
  4. Shomari, S. H., Kennedy, R. Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania. Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).
  5. Sitterly, W. R., Spencer, D. M. . Powdery Mildews. , 369 (1978).
  6. Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates. Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).
  7. Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi. Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).
  8. Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments. Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).
  9. Xiao, S., et al. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science. 291 (5501), 118-120 (2001).
  10. Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases. The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).
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  12. Xiao, S., et al. The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis. The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).

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Cite This Article
Wu, Y., Diaz, D., Yin, J., Bloodgood, D., Sexton, W., Wei, C., Xiao, S. An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants. J. Vis. Exp. (169), e62287, doi:10.3791/62287 (2021).

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