Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zum Aufbau eines einfachen Sporenverteilungssystems, bestehend aus einer Impfbox mit einem ~50 μm Netz und einer transparenten Kunststoffkammer. Damit lassen sich Pflanzen gleichmäßig mit Mehltausporen impfen und so eine genaue und reproduzierbare Beurteilung der Krankheitsphänotypen der untersuchten Pflanzen ermöglichen.
Abstract
Die Verringerung von Ernteverlusten aufgrund von Pilzkrankheiten erfordert ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die Pflanzenimmunität und die Pilzpathogenese steuern, was wiederum eine genaue Bestimmung der Krankheitsphänotypen von Pflanzen bei Infektion mit einem bestimmten Pilzpathogen erfordert. Eine genaue Krankheitsphänotypisierung mit nicht kultivierbaren biotrophen Pilzpathogenen wie Mehltau ist jedoch nicht einfach zu erreichen und kann ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt eines Forschungsprojekts sein. Hier haben wir ein sicheres, effizientes und einfach zu bedienendes Krankheitsphänotypisierungssystem am Beispiel der Arabidopsis-Mehltau-Interaktion entwickelt. Dieses System besteht hauptsächlich aus drei Komponenten: (i) einer hölzernen Impfbox mit einem abnehmbaren Deckel, der mit einem Edelstahl- oder Nylongeflecht aus ~50 μm Poren zur Beimpfung einer Pflanzenschicht mit Pilzsporen befestigt ist, (ii) einer transparenten Kunststoffkammer mit einer kleinen vorderen Öffnung zur Minimierung des Sporenaustritts bei der Impfung im Inneren, und (iii) eine Sporenentfernungs- und Verteilungsmethode für eine gleichmäßige und wirksame Impfung. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Schritte und Parameter für die kostengünstige Herstellung der Impfbox und der Kunststoffkammer sowie eine Videodemonstration, wie das System verwendet werden kann, um eine gleichmäßige Impfung mit Mehltausporen zu ermöglichen und dadurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Krankheitsphänotypisierung zu verbessern.
Introduction
Der Echte Mehltau ist eine der häufigsten und wichtigsten Erkrankungen zahlreicher Nahrungs- und Zierpflanzen1. Studien zu Mehltauerkrankungen erfreuen sich großer Beliebtheit, wie über 10.500 Publikationen als Suchergebnis mit dem Stichwort "Echter Mehltau" im Web of Science belegen (Stand November 2020). Tatsächlich wird Echter Mehltau (vertreten durch Blumeria graminis) vom Journal of Molecular Plant Pathology2 als einer der Top 10 Pilzpathogene angesehen. Die Quantifizierung der Krankheitsanfälligkeit ist ein notwendiger Schritt bei der Charakterisierung von Pflanzengenen, die zur Krankheitsresistenz oder -anfälligkeit beitragen, oder bei der funktionellen Identifizierung von Effektor-Kandidatengenen im Echten Mehltau. Die zuverlässige Phänotypisierung von Krankheiten ist jedoch beim Echten Mehltau weitaus schwieriger als bei den meisten anderen pilzlichen Krankheitserregern, zum Teil, weil Sporen von Mehltauarten (wie Golovinomyces cichoracearum UCSC1 basierend auf unseren Laborerfahrungen) im Gegensatz zu Sporen der letzteren nach einem Wassersuspensionsprozess eine verminderte Lebensfähigkeit aufweisen 3,4 . Eine unzureichende und/oder ungleichmäßige Beimpfung von Testpflanzen mit einem bestimmten Mehltau-Erreger kann zu ungenauen Phänotypisierungsergebnissen führen.
Eine Reihe von Impfmethoden wurde für Mehltaustudien berichtet. Dazu gehören (i) das Bürsten von Sporen direkt von infizierten Blättern zu Testpflanzen5, (ii) das Sprühen einer Sporensuspension auf Testpflanzen6, (iii) das Blasen von Sporen mit einem vakuumbetriebenen Absetzturm auf Pflanzen am Boden des Turms7 und (iv) die Sporenabgabe durch kombinatorische Verwendung einer Nylonnetzmembran und schallbasierte Vibration8 . Die Sporenbürsten- (oder Staub-) Methode ist einfach durchzuführen, aber ungleichmäßig in der Natur, so dass sie für die quantitative Bewertung möglicherweise nicht genau ist. Das Sprühen von Sporen ist bequem und gleichmäßig, kann aber, wie oben erwähnt, zu einer schlechten Sporenkeimung führen4. Die beiden letzteren (d.h. iii-iv) sind stark verbesserte Methoden, die eine gleichmäßige Impfung erreichen können; Beide sind jedoch nicht flexibel bei der Anpassung ihrer Impfkapazität in Bezug auf die Anzahl der zu beimpfenden Pflanzen in einem einzigen Ereignis, so dass beide Geräte nicht trivial sind und ihr Betrieb auf Laborbereiche beschränkt ist, in denen eine Vakuum- und / oder Stromquelle vorhanden ist.
Unser Labor beschäftigt sich seit über 20 Jahren mit der Interaktion zwischen Pflanzenund Mehltau 9,10. In den letzten zehn Jahren haben wir eine Reihe von Impfmethoden getestet und kürzlich eine einfache und dennoch effektive Mehltau-Impfmethode entwickelt. Diese netzbasierte Sporenbürstenmethode kann eine gleichmäßige Impfung gewährleisten, ist einfach und skalierbar und sollte daher von jedem Labor, das mit Mehltau arbeitet, leicht übernommen werden.
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Protocol
1. Herstellung einer Standard-Impfbox mit einem abnehmbaren oberen Deckel, der mit einem Netz montiert ist
- Kaufen Sie eine Rolle 50 μm Nylonmembrangewebe oder 48 μm Edelstahlgewebe (empfohlen) in Geschäften. Stellen Sie sicher, dass Sie genug bestellen, um in mehrere Teile von 14 in x 26 Zoll zu schneiden, um das abgenutzte Netz zu ersetzen.
- Kaufen Sie eine 1/4 in x 2 ft x 4 ft mitteldichte Faserplatte oder Sperrholz, und schneiden Sie zwei 24-1/2 in x 10 in Stücken und zwei 12 in x 10 in Stücken, um eine Impfbox herzustellen. Verwenden Sie 8 Eckklemmen zur Unterstützung der vier Seiten.
HINWEIS: Wenn Sie der breiten Seite des Gehäuses zugewandt sind, ist die linke 12 Zoll x 10 Zoll Seite dauerhaft befestigt und die rechte 12 Zoll x 10 Zoll Seite ist eine abnehmbare Tür, die durch vier Magnetverschlüsse gehalten wird (Abbildung 1A,B). - Platzieren Sie vier 2-Zoll-Eckstreben zwei in jeder Innenecke der linken Seite, einen Zoll von oben und einen Zoll von unten, markieren und bohren Sie ein Loch. Verwenden Sie Schrauben, um die linke kurze Seite dauerhaft an zwei langen Seiten (vorne und hinten) zu befestigen. Der Innenabstand zwischen den beiden Längsseiten sollte 12 Zoll und nicht 11-1/2 Zoll betragen.
- Wenn die Eckklemmen noch an Ort und Stelle sind und die richtige Ausrichtung der rechten Tür erfolgt, markieren und bohren Sie die Position der 4 Magnetverschlüsse, um die richtige abnehmbare Tür an Ort und Stelle zu halten. Installieren Sie einen Knopfknopf an der Tür. Die Oberseite der Tür bleibt unter dem oberen Deckel hängen (Abbildung 1A,B).
- Um einen abnehmbaren oberen Deckel mit einem Netz herzustellen, schneiden Sie den langen hölzernen quadratischen Dübel in 2 Sätze von 26 Zoll und 12-3/4 Zoll. Kleben und nageln Sie die vier Teile so, dass sie um die Box passen - die Innenmaße des Rahmens sind etwas größer als die Außenmaße der Box, da das Siebnetz an diesem Rahmen befestigt wird.
- Schneiden Sie das Bildschirmgitter auf etwas weniger als 14 Zoll x 26 Zoll. Lassen Sie den Bildschirm nicht über den Rahmen hinausragen, um scharfe Kanten zu vermeiden. Haben Sie Hilfe, um den Bildschirm auf dem Rahmen zu dehnen. Halten Sie das Netz mit dem Rahmen durch Klemmen fest (Abbildung 1C), und verwenden Sie eine Heftpistole mit den richtigen Klammern, um den Bildschirm am Rahmen zu befestigen.
- Schneiden Sie zwei Sätze kürzerer quadratischer Holzdübel (21 Zoll und 9 Zoll) und verwenden Sie Schrauben, um das Netz mit den 4 kürzeren Stücken des hölzernen Vierkantdübels fest entlang des Rahmens zu schleifen (Abbildung 1C, D).
2. Herstellung einer Impfkammer
- Kaufen Sie durchsichtige Acrylplatten und Hardwareartikel in den entsprechenden Geschäften. Schneiden Sie ein 7 Zoll x 20 in öffnendes Fenster auf der Vorderseite der Box aus, wie in Abbildung 2C gezeigt.
- Montieren Sie die linke und rechte Seite, vordere (mit Fenster) und hintere Acrylplatten mit 8 Eckklemmen zu einem Karton, wie in Abbildung 2A dargestellt. Stellen Sie sicher, dass die Innenmaße der Kammer den Abmessungen des Deckblechs entsprechen.
HINWEIS: Die rechte Seite dient zur Unterstützung und wird nicht an den vorderen oder hinteren Laken befestigt. Es ist absichtlich 1/2 Zoll kürzer als die anderen Blätter. Diese rechte Seite wird zu einer "herunterziehbaren" "Klapptür", die von einem rechtwinkligen Scharnier an der Unterseite und zwei magnetischen Verschlüssen oben gehalten wird, wie in Abbildung 2C, D gezeigt. - Verwenden Sie Eckstreben, um die Paneele miteinander zu befestigen (Abbildung 2B,C). Halten Sie die Klammern an Ort und Stelle, markieren Sie sie mit einem Sharpie-Marker, zentrieren Sie den Stempel und bohren Sie dann das Loch.
HINWEIS: Das Bohren von Acryl unterscheidet sich vom Bohren von etwas anderem, zwingt nicht, sonst kann die Seite des Lochs gegenüber dem Bohrer reißen. Verwenden Sie Nieten oder Schrauben. Ziehen Sie die Schrauben nicht zu fest an, da sonst das Acryl mit der Zeit reißen kann. - Drehen Sie das Gehäuse auf der Rückseite, entfernen Sie die 4 Eckklemmen und positionieren Sie die obere Folie an ihrem Platz. Markieren und bohren.
- Installieren Sie das rechtwinklige Scharnier aus einer 3/4 Zoll Winkelstrebe. Verwenden Sie eine Nylon-Sicherungsmutter als Scharnierstange. Nicht festziehen, lassen Sie einen Spalt, damit sich die Tür auf diesem Scharnier dreht.
- Markieren, zentrieren, bohren und befestigen Sie die beiden magnetischen Türmagnete mit #6-32x3/4" Schwenkkopfschrauben. Befestigen Sie dann die Fangplatten mit #6-32x3/8" Flachkopfschrauben, siehe Abbildung 2C,D.
3. Beimpfung von Pflanzen in Wohnungen
- Bereiten Sie frische Mehltausporen als Inokula vor (z. B. Arabidopsis-Mehltau Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Züchten Sie saubere Arabidopsis-immungeschwächte Pad4-1-mutierte Pflanzen 11 in einer Wachstumskammer (22 °C, 65% relative Luftfeuchtigkeit für 6-8 Wochen) und impfen Sie eine oder eine halbe flache Pad4-1-Pflanzen, um ausreichend frische Mehltausporen aufzubauen (Abbildung 3A).
- Züchten Sie die Pflanzen zur Bestimmung von Infektionsphänotypen in Standard 11 in x 21 in x 2,5 in Wohnungen.
HINWEIS: Arabidopsis-Pflanzen , die sechs bis acht Wochen lang unter kurzem Tag (8 h hell, 16 h dunkel; 22 °C) angebaut werden, eignen sich gut für Infektionstests mit Mehltau. - Wenn frische Mehltausporen von infizierten Pflanzen 8-10 Tage nach der Impfung (dpi) verfügbar sind, bewegen Sie eine flache Pflanzenfläche für den Infektionstest in die Impfbox in der Impfkammer (Abbildung 1B,2C).
- Schneiden Sie 15-20 stark infizierte Arabidopsis-Blätter (oder 4-6 infizierte Rosetten, je nach Blatt- / Rosettengröße und Impfgrad), lassen Sie die Blätter trocknen, wenn Kondenswasser vorhanden ist.
- Nehmen Sie 1-2 Blätter oder eine Rosette mit einer langen Pinzette mit einer Hand und stellen Sie die Blätter auf den Kopf. Führen Sie dann beide Hände durch die Öffnung der Kammer und schlagen Sie vorsichtig mit einer Schere auf den Arm der Pinzette, während Sie die Blätter/Rosette langsam über das Netz bewegen, das an der Impfbox montiert ist (Abbildung 3B). Wiederholen Sie dies, bis alle Blätter oder Rosetten verwendet sind.
HINWEIS: Reife Sporen lösen sich leicht von Konidiophoren der infizierten Blätter. Versuchen Sie, Sporen auf dem Netz so gleichmäßig wie möglich zu entfernen. - Verwenden Sie einen oder zwei feine Fächerbürsten, um die Sporen vorsichtig durch das Netz zu streichen (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Oberfläche des Netzes vier oder mehr Mal in verschiedene Richtungen bürsten, um eine gleichmäßige Verteilung der Sporen auf die Pflanzen im Boden der Impfbox zu maximieren (Abbildung 3D). Tupfen Sie das Netz einige Male vorsichtig mit den Bürsten, um die Sporen abzuschütteln, die im Netz stecken.
- Lassen Sie die Sporen für eine halbe Minute ruhen. Ziehen Sie dann die Wohnung mit den geimpften Pflanzen aus der Impfbox heraus. Decken Sie die Wohnung mit einer Kunststoffkuppel ab und legen Sie sie in eine Wachstumskammer (22 °C, 65% relative Luftfeuchtigkeit). Die Phänotypisierung der Krankheit kann bei 5 oder 8 bis 12 dpi 12 durchgeführt werden.
4. Pflanzen mit kleineren Impfboxen beimpfen
HINWEIS: In Fällen, in denen weniger Pflanzen geimpft werden sollen, kann weiterhin die Standard-Impfbox verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pflanzen in die Mitte der Box stellen. Entfernen und bürsten Sie Sporen im Bereich des Netzes, das die Pflanzen bedeckt, um sicherzustellen, dass alle Pflanzen geimpft werden, während Inokula gespart wird. Alternativ und vorzugsweise können kleinere Impfboxen verwendet werden (wie unten beschrieben).
- Wandeln Sie Kartons in eine Impfbox um. Entfernen Sie einfach die Ober- und Unterseite der Box, kleben Sie die Ecke ab, um sie bei Bedarf festzumachen, und montieren Sie ein 50-μm-Netz in geeigneter Größe durch Kleben oder Heften auf der Oberseite (Abbildung 4A, B).
- Bewegen Sie die Wohnung mit den Pflanzen in die Impfkammer, stellen Sie die kleinere Impfbox auf die Wohnung, um die Pflanzen abzudecken.
- Sporen wie oben beschrieben entfernen und bürsten.
5. Abgelöste Blätter in Petrischalen impfen
HINWEIS: In Fällen, in denen (i) frische Mehltausporen sehr begrenzt sind und/oder (ii) Pflanzen sauber gehalten werden müssen, während Krankheitsphänotypen und/oder Protein-subzelluläre Lokalisation in infizierten Zellen beurteilt werden müssen, können abgelöste Blätter für Infektionen in MS-Agarplatten verwendet werden.
- Machen Sie eine Mini-Impfbox, die nur geringfügig größer als eine Petrischale ist.
- Bereiten Sie 1/2-Stärke Murashige und Skoog (MS) mittelgroße Agarplatten (1,5%) vor. Fügen Sie Thiabendazol (40 mg / L) hinzu, um bei Bedarf Schimmelpilzkontamination zu reduzieren. Lagern Sie die Teller bis zum Gebrauch bei 4 °C im Kühlschrank.
- Schneiden Sie ein oder zwei vollständig expandierte Blätter von der Basis des Blattstiels für jede einzelne zu testende Pflanze. Führen Sie den Blattstiel der abgelösten Blätter in einem Winkel von ~30° in Agarmedium ein.
HINWEIS: Jede Platte kann 20-40 Blätter enthalten, abhängig von der Größe der Blätter und der verwendeten Platte (Abbildung 4C). - Beimpfen Sie die Blätter in der Impfkammer wie oben beschrieben. Bewegen Sie die Platte mit dem Deckel in eine Wachstumskammer.
- Schneiden Sie einen kleinen Abschnitt eines Blattes und überprüfen Sie die subzelluläre Lokalisation von Proteinen zu bestimmten Zeitpunkten.
- Zur Beurteilung der Infektionsphänotypen werden die Blätter mit 4 oder 5 dpi auf eine frische aseptische MS-Agar-Platte übertragen. Schneiden Sie die Basis des Blattstiels ab, bevor Sie die Blätter in das frische Agarmedium einführen. Beurteilen Sie die Krankheitsphänotypen bei 8 oder 9 dpi.
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Representative Results
Hier stellen wir eine neue Mehltau-Sporen-Impfmethode vor, die einfach herzustellen, zu bedienen und einzustellen ist. Abbildung 1 zeigt die Montage der Standard-Impfbox mit Schwerpunkt auf der Marke des abnehmbaren Deckels, der mit einem 50-μm-Membrannetz montiert ist. Abbildung 2 zeigt den Aufbau der Impfkammer. Abbildung 3 zeigt die wichtigsten Schritte des Impfprozesses mit diesem System. Abbildung 4 zeigt andere Impfboxen, mit denen eine ganze flache oder weniger Pflanzen oder abgelöste Blätter auf MS-Agar-Medium geimpft werden können. Schließlich liefert Abbildung 5 Daten zur Darstellung der Impfgleichmäßigkeit, die sich in der Sporenverteilung oder den Phänotypen von Pflanzeninfektionen widerspiegelt.
Abbildung 1. Herstellung einer Impfbox. (A-B) Fotos, die die Box mit geschlossener Tür (A) oder offen zum Einsetzen einer Wohnung von Arabidopsis-Pflanzen (B) zeigen. Beachten Sie, dass ein Paar magnetische Verschlüsse der Schranktür zum Halten der Tür verwendet werden. (C) Ein Foto, das die Montage eines Netzes am Rechteckrahmen als kritischen Schritt für die Herstellung des Deckels der Box zeigt. Notizklemmen und Eckhalterungen werden verwendet, um das Netz zu positionieren, bevor es durch verschraubte Nägel fixiert wird. (D-E) Fotos, die den abnehmbaren Deckel der Box mit einem neuen Edelstahlgewebe (D) oder einer montierten Box (E) zeigen. Beachten Sie, dass das Netz zwischen 3/4 Zoll Holzquadratdübel mit der angegebenen Länge in D und E befestigt ist. Gelbe Linien markieren die Größenmessung der Box. Eine Impfbox, die in eine Standardwohnung passt, kann die Phänotypisierungseffizienz erheblich verbessern, insbesondere wenn viele Pflanzen geimpft werden sollen (z. B. während eines genetischen Screenings). Ein abnehmbarer Deckel, der mit einem Netz montiert ist, erleichtert die Reinigung oder den Austausch des Netzes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Herstellung einer Impfkammer. (A) Ein Foto, das die erste Montage der vier Acrylplatten mit Eckklemmen zeigt. (B) Ein Foto, das eine Ansicht von oben nach unten in der Kunststoffkammer zeigt. (C-D) Fotos zeigen das fertig montierte Impfsystem (C) und einen der beiden magnetischen Verschlüsse (oben) und rechtwinklige Scharniere (unten), die an einer Seite als Tür (D) installiert sind. Beachten Sie, dass das Impffenster zum Entfernen und Bürsten von Sporen durch den Benutzer dient (dargestellt durch gewölbte Linien). Die gelben Linien markieren das Größenmaß der Box. Eine Impfkammer ist ein Plus, aber ohne sie kann die Impfung immer noch mit einer Impfbox in einem kleinen windstillen Raum oder einer Umgebung durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Illustration des Impfvorgangs. (A) Bilder mit frischem Mehltau auf Blättern angedeuteter Pflanzen. (B) Ein Bild, das zeigt, wie man Sporen auf dem Netz abschüttelt, indem man sanft auf die Pinzette schlägt, die die infizierten Blätter greift. (C) Bilder, die zwei feine Fächerbürsten und sanftes Bürsten von Sporen auf dem Netz zeigen. (D) Eine schematische Zeichnung, die die Richtungen des Sporenbürstens auf dem Netz zeigt, die zu einer gleichmäßigen Sporenverteilung auf Pflanzen im Boden der Impfbox führen können. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die Verwendung frischer Sporen für die Impfung entscheidend für eine erfolgreiche Infektion ist. Nach unserer Erfahrung sind Konidien, die auf infizierten Blättern zwischen 8 und 12 dpi produziert werden, frisch und können leicht durch Schütteln gelöst werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Einfache, provisorische Kartonimpfungen für Infektionstests. (A) Ein Karton zur Beimpfung von Pflanzen in einer Standardwohnung. (B) Mittelgroße Impfkästen zur Beimpfung von weniger Pflanzen. (C) Eine kleine Impfbox zur Beimpfung abgelöster Blätter in quadratischer Petrischalenplatte, die MS-Agarmedium enthält. Gelbe Linien markieren die Größenmessung der Box. Kartons anderer Größen können verwendet werden, wenn sie in die Wohnungen passen, die die zu prüfenden Pflanzen enthalten. Kunststoffboxen sollten nicht verwendet werden, da Sporen aufgrund ihrer statischen Elektrizität von der Kunststoffoberfläche angezogen werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5. Beurteilung der Impfgleichmäßigkeit. (A) Eine schematische Zeichnung, die die Positionen von sechs mikroskopisch kleinen Objektträgern auf der Unterseite einer Wohnung zeigt. Eine repräsentative Schliffaufnahme rechts zeigt eine gleichmäßige Sporenverteilung auf dem Objektträger nach einer starken Beimpfung. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Ein Balkendiagramm, das die Dichte der an sechs Stellen (1 bis 6) verteilten Sporen zeigt, wie in (A) nach drei simulierten Impfungen mit Sporen von vier (für leichte Impfung ) oder 15 (für schwere Impfung) vollständig expandierten infizierten Blättern von Pad4-1-Pflanzen . Gezählt wurden Sporen in einer Fläche von 4 x 0,25 cm2 , begrenzt durch einen gerasterten Glasdeckel (von ibidi USA Inc. oder Eigenbau) auf jedem Objektträger. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Sporendichte zwischen sechs Objektträgern in jedem der beiden Impfschemata festgestellt (Student t-Test; S . > 0,5). Fehlerbalken zeigen SD an. (C) Repräsentative Pflanzen der Arabidopsis Col-0 Wildtyp- und Pad4-1-Mutante , die 12 Tage nach einer schweren Impfung mit G. cichoracearum UCSC1 infiziert wurden. Beachten Sie, dass alle pad4-1-Pflanzen im Vergleich zu Col-0-Pflanzen eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit aufwiesen. Mehrere Faktoren bestimmen die Impfgleichmäßigkeit. Im Allgemeinen ist es relativ einfacher, eine gleichmäßige Impfung zu erreichen, wenn genügend Inokula verwendet wird, um eine Dichte von > 50 Sporen/cm2 zu erreichen. Frische Konidien, die durch Schütteln gelöst werden, können leicht disaggregiert und einzeln durch das Netz gebürstet werden. Alte oder tote Konidien neigen dazu, Aggregate zu bilden, sind daher schwer zu entfernen und zu zerstreuen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Unsere Meshed-Box-basierte Impfmethode hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Impfmethoden. Erstens kann es eine gleichmäßige Verteilung der Sporen erreichen, wenn es richtig betrieben wird, wie in Abbildung 5 gezeigt. Zweitens kann die Verwendung von ~ 50 μm Mesh sowie die Sporenentfernung durch sanftes Schütteln infizierter Blätter die Pflanzeninfektion durch Thripse oder andere pflanzeninfizierende Insekten, die in Quellpflanzen vorhanden sind, reduzieren. Drittens kann die Verwendung von unterschiedlich großen Impfboxen zur Beimpfung von Pflanzen oder abgelösten Blättern in der Kunststoffkammer (die beide leicht durch Sprühen von 75% Ethanol gereinigt werden können) das Inokulum effektiver nutzen und Kreuzkontaminationen reduzieren. Wir fanden heraus, dass während des gesamten Impfprozesses keine oder nur sehr wenige Pilzsporen aus den Impfkammern entwichen.
Eine qualitativ hochwertige Impfbox ist der Schlüssel für eine gleichmäßige Impfung. Wir fanden heraus, dass die Standard-Impfbox für die Beimpfung junger und reifer Pflanzen von Arabidopsis (Abbildung 1), Sämlingen von Erdbeeren, Saudistel und N. benthamiana (nicht gezeigt) verwendet werden kann. Die Höhe der Box kann weiter zunehmen, wenn Pflanzen größer als fünf Zoll sind, um einen ausreichenden Abstand (> 5 Zoll) vom Netz zu den darunter liegenden Pflanzen zu gewährleisten, um eine gleichmäßige Sporenverteilung zu ermöglichen. Die Höhe der Kunststoffkammer kann auch entsprechend erhöht werden, um ausreichend Platz zum Manövrieren von Sporenverschiebungen und Bürsten auf der Oberseite der Impfbox zu schaffen.
Eine gleichmäßige und dichte Befestigung eines ~50 μm Mesh Ihrer Wahl am Deckel der Impfbox ist wichtig und erfordert besondere Sorgfalt. Die Porengröße ist etwas größer als die der Mehltausporen, die meist 30-40 μm Durchmesser haben. Der Deckel kann nach Gebrauch durch Waschen mit Leitungswasser gereinigt oder mit 75% Ethanol besprüht werden. Wir empfehlen die Verwendung eines 48-μm-Edelstahlgewebes, da das Netz haltbarer ist und länger hält.
Die Impfkammer schafft eine windstille Umgebung und minimiert das Entweichen von Sporen während der Sporenentfernung und/oder des Bürstens. Die Kammer besteht aus transparentem Kunststoffglas, so dass der Benutzer mit bloßem Auge sehen kann, ob die gelösten Sporen vor dem Bürsten mehr oder weniger gleichmäßig auf dem Netz verteilt sind. Dies ist besonders wichtig, wenn eine leichte und gleichmäßige Impfung erforderlich ist. Das sanfte, aber schnelle Bürsten in verschiedene Richtungen ist ebenfalls wichtig, da es aggregierte Sporen zerstreuen und einzeln durch die Poren drücken kann, wodurch eine gleichmäßige Verteilung erreicht wird, nachdem die Sporen gefallen sind und sich auf den Boden der Impfbox abgesetzt haben. Für eine einfache Handhabung sollte die Impfkammer auf einen Tisch mit einer geeigneten Höhe gestellt werden, so dass Sporenentfernung und Bürsten leicht mit den Händen durch das Fenster der Kammer durchgeführt werden kann.
Die Meshed-Box-basierte Impfung kann mit unterschiedlich großen Impfboxen nach oben oder unten skaliert werden. Einfache, provisorische Meshed-Inoculation Boxen sind einfach herzustellen und könnten bei richtiger Anwendung zufriedenstellende Ergebnisse erzielen. Zwar kann diese Methode im Vergleich zur Impfung mit der vakuumbetriebenen Absetzturmmethode7 beim Sporenentfernen und Bürsten länger dauern. Auch für die Beimpfung großer und hoher Pflanzen kann die hier beschriebene Standard-Impfbox zu klein sein, so dass eine größere Impfbox und eine größere Kammer verwendet werden müssen, um eine gleichmäßige Impfung zu erreichen. Bei einigen Pflanzenarten wie Tabak und Gurke können abgelöste Blätter oder Keimblätter mit dieser Methode beimpft werden, um die Krankheitsanfälligkeit der gesamten Pflanze zu beurteilen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOS-1901566) an S. Xiao unterstützt. Die Autoren danken F. Coker und C. Hooks für die Wartung der Pflanzenwachstumsanlage und Jorge Zamora für die technische Hilfe bei der Herstellung der Impfbox und der Kammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 µm stainless steel grid mesh screen; Size: 24" X 48" | Amazon | NA | For making the lid of an inoculation box |
| #6-32 x ¾" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32 zinc plated nylon lock nut (4-Pack) | Home Depot | NA | For making an inoculation chamber |
| #6-32x3/8” Phillips flat head machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing magnet door catch plates |
| #8-32x1/2" machine screws, flat washers and nuts | Home Depot | NA | For securing corner braces and door hinge |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 17 ½" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 20" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 18" X 30" | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 0.250 thick clear extruded acrylic film-masked sheet; Size: 20" X 29 ½ " | Professional Plastics | SACR.250CEF | For making an inoculation chamber |
| 1-5/8" cabinet door magnetic catch white | Home Depot | Model #P110-W | For making an inoculation chamber |
| 2" steel zinc-plated corner brace (8-Pack) | Home Depot | Model #13611 | For making an inoculation box & chamber |
| 3" Corner Clamp | Harbor Freight Tools | SKU 63653, 1852, 60589 | For making inoculation chamber |
| 3/4" steel zinc plated corner brace (4-Pack) | Home Depot | Model #13542 | For making an inoculation box & chamber |
| 4-7/8" zinc-plated light duty door pull handles | Home Depot | Model #15184 | For making an inoculation box |
| Fine fan-blender brushes | Michaels Store | M10472846 | For inoculation |
| Kelleher 3/4" x 3/4" x 36" wood square dowel | Home Depot | NA | For making the lid of an inoculation box |
| Medium density fiberboard (1/4" x 2' x 4'); | Home Depot | Model# 1508104 | For making an inoculation box |
| Round glass coverslips with a 500 µm grid | ibidi USA Inc. | 10816 | For determining spore density |
References
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