Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Confocal Laser Skanning Mikroskopi Av Kalsiumdynamikk i Akutt Mus Bukspyttkjertelen Vev Skiver

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

Vi presenterer forberedelsen av akutte bukspyttkjertelvev skiver og deres bruk i konfokal laser skanning mikroskopi for å studere kalsiumdynamikk samtidig i et stort antall levende celler, over lange tidsperioder, og med høy romlig løsning.

Abstract

Den akutte pankreasvevsskiven for mus bukspyttkjertelen er et unikt in situ-preparat med bevart intercellulær kommunikasjon og vevsarkitektur som medfører betydelig færre forberedelsesinduserte endringer enn isolerte holmer, akini, kanaler eller dispergerte celler beskrevet i typiske in vitro-studier. Ved å kombinere den akutte bukspyttkjertelvevsskiven med levende celle kalsiumavbildning i konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM), kan kalsiumsignaler studeres i et stort antall endokrine og eksokrine celler samtidig, med en enkeltcellet eller til og med subcellulær oppløsning. Følsomheten tillater påvisning av endringer og muliggjør studiet av intercellulære bølger og funksjonell tilkobling samt studiet av avhengigheten av fysiologiske responser av celler på deres lokalisering innenfor holme- og parakrineforholdet med andre celler. Til slutt, fra dyrevelferdsperspektivet, senker registreringen av signaler fra et stort antall celler om gangen antall dyr som kreves i eksperimenter, noe som bidrar til 3R-erstatnings-, reduksjons- og raffineringsprinsippet.

Introduction

Pattedyr bukspyttkjertelen er en stor eksokrine og endokrine kjertel. Eksokrindelen utgjør 96-99% av det totale bukspyttkjertelvolumet og består av akini og kanaler. Den endokrine delen består av et stort antall holmer av Langerhans som står for de resterende 1-4% av det totale bukspyttkjertelen volum1. Eksokrindelen skiller ut store fordøyelsesenzymer som bryter ned energirike polymerer i mat, samt en bikarbonatrik væske, som kombineres med andre gastrointestinale sekreter for å gi et miljø som passer for virkningen av enzymer. Den endokrine delen skiller ut hormoner som regulerer postprandial distribusjon, lagring og interprandial frigjøring av energirike næringsstoffer. Selv om eksokrine vevet er relativt underutviklet og endokrine relativt godt utviklet ved fødselen, overgroder førstnevnte raskt sistnevnte ved avvenning 2,3,4. Tidlige studier av bukspyttkjertelfunksjon markerte fødselen av moderne fysiologi, og store metodologiske fremskritt på feltet har blitt etterfulgt av store vitenskapelige breaktroughs5. Å jobbe med bukspyttkjertelen er teknisk utfordrende på grunn av den intrikate strukturen i kjertelen, men er også en stor motivasjon på grunn av sykdommer som bukspyttkjertelkreft, pankreatitt og diabetes som presenterer store trusler mot folkehelsen, og for hvilke nye terapeutiske tilnærminger som trengs.

Isolerte holmer6, acini 7,8 og kanalfragmenter hadde blitt utviklet og brukt i flere tiår som gullstandardmetoder på grunn av deres fordeler sammenlignet med cellelinjer og primære dispergerte endokrine, acinar og kanalceller 9,10. Til tross for den markant forbedrede funksjonen til isolerte cellekollektiver, innebærer disse metodene fortsatt betydelig mekanisk og enzymatisk stress, isolerer celler fra det omkringliggende vevet og mangler dermed parakrineinteraksjoner og mekanisk støtte, og viktigst av alt, ledsages av betydelige endringer i normal fysiologi 11,12,13 . Den akutte pankreasvevsskiven for mus ble utviklet i 2001 av et opplevd behov for å utvikle en eksperimentell plattform som ligner på hjerne-, hypofyse- og binyreskiver med bevarte intercellulære kontakter, parakrineinteraksjoner, mesenchyme og vevsarkitektur, samt uten noen av de viktigste manglene i gullstandardmetoden i holmeforskning av den tiden- de isolerte holmene12, 14. Blant disse manglene er skade på de ytterste lagene, mangel på tilgjengelighet av kjerne holmeområder, og behovet for dyrking med muligens viktige effekter på celleidentitet og fysiologi12,15. Videre muliggjør vevsskivemetoden studier på dyremodeller med grovt forstyrret holmearkitektur der det er umulig å isolere holmer, eller når holmeutbyttet er ekstremt lavt ved tradisjonell isolasjon 16,17,18,19,20,21.

I tillegg er stykket mer egnet for å studere morfologiske endringer under utvikling av diabetes og pankreatitt, for eksempel, da det gir en bedre oversikt over hele vevet og er også kompatibel med å studere regionale forskjeller. Viktig, til tross for det tidlige fokuset på den endokrine delen, muliggjør vevsskivemetoden iboende studiet av de eksokrine komponentene 9,22,23. I løpet av det første tiåret etter introduksjonen ble metoden brukt til elektrofysiologiske studier av beta 14,24,25,26,27,28,29 og alfa 30,31 celler samt for å undersøke morfologiske og funksjonelle modning av bukspyttkjertelen 2,3 . Et tiår senere i 2013 ble metoden vellykket tilpasset for levende celle kalsiumavbildning av holmeceller ved hjelp av CLSM for å karakterisere deres respons på glukose32, deres funksjonelle tilkoblingsmønstre33, og forholdet mellom membranpotensial og intracellulært kalsium ved å kombinere en fluorescerende kalsiumfarge med et membranpotensialfargestoff 34. Senere samme år ble metoden også brukt til å vurdere kalsiumdynamikk i acinarceller22,35. I løpet av de følgende årene har bukspyttkjertelvevsskiver blitt brukt i en rekke forskjellige studier og vellykket tilpasset gris og menneskelig vev 9,36,37,38,39,40,41. Men samlet sett er kalsiumavbildning-i-mus bukspyttkjertelvev skiver generelt og i holmer spesielt -er fortsatt for det meste utført av denne gruppen. En av hovedårsakene til dette kan ligge i kombinasjonen av en teknisk utfordrende vevsskiveforberedelse, behovet for et konfokalt mikroskop og ganske kompleks dataanalyse. Hovedmålet med det nåværende papiret er å gjøre denne kraftige metoden mer tilgjengelig for andre potensielle brukere.

Det er allerede noen gode metodologiske artikler som omhandler i detalj med vevsskiveforberedelse og bruk av skiver til strukturelle og sekresjonsstudier, men ikke for konfikal kalsiumavbildning 9,42,43. Derfor fokuserer dette papiret på noen ekstra tips og triks under utarbeidelsen av skiver, på trinn som er kritiske for vellykket fargeinnlasting, bildeanskaffelse, samt på hovedtrinnene i grunnleggende kalsiumdataanalyse. Derfor bør dette bidraget ses på som komplementært til i stedet for som et alternativ for ovennevnte metode. På samme måte skal kalsiumavbildning i pankreasvevsskiver for mus ses på som en eksperimentell tilnærming som skal brukes til å svare på spesifikke spørsmål og er dermed komplementært til snarere enn et absolutt alternativ for andre kalsiumavbildningsmetoder i bukspyttkjertelfysiologi som isolerte kanaler eller akini, isolerte holmer, organoider, holmer transplantert inn i øyets fremre kammer, og innspillinger in vivo 11,44,45,46,47,48. Løftet om kalsiumavbildning i pankreasvevskiver hos mus er sannsynligvis best illustrert ved nylige vellykkede registreringer av kalsiumdynamikk i holmemesenchymale celler som pericytter49 og makrofager50, samt i kanalceller23.

Protocol

MERK: Alle eksperimenter ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer for pleie og bruk av dyr i forskning. Protokollen ble godkjent av administrasjonen i Republikken Slovenia for mattrygghet, veterinærsektor og plantebeskyttelse (tillatelsesnummer: 34401-35-2018/2).

1. Fremstilling av bukspyttkjertelvev skiver

MERK: Utarbeidelsen av akutte pankreatvevskiver for mus for kalsiumavbildning ved hjelp av CLSM krever en rekke instrumenter, forskjellige løsninger og fortsetter i en rekke kritiske trinn som er skjematisk presentert i figur 1 og beskrevet i detalj nedenfor.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflytdiagram. Skjematisk representasjon av alle trinn i prosessen med pankreas vev skiver forberedelse, begynner med injeksjon av agarose i den vanlige gallekanalen, etterfulgt av utvinning av bukspyttkjertelen og kutting. De tilberedte skivene kan brukes til å vurdere vevets levedyktighet med et Live /Dead-sett eller farget med en kalsiumsensor. Når de er farget, er de klare for avbildning. Innspillinger hentet fra bildebehandlingsprosessen brukes deretter til dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Utarbeidelse av løsninger
    MERK: Alle løsninger bør tilberedes på forhånd og kan oppbevares i kjøleskapet ved 4-8 °C i opptil en måned. For tilberedning og lagring av vevsskiver er det nødvendig med ca. 0,5 L ekstracellulær oppløsning (ECS) med 6 mM glukose og 0,3 L 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) buffer. For 1 dag med kalsiumavbildning med perifusionsystemet satt til 1-2 ml / min strømningshastighet, er det nødvendig med ca. 0,5 L ECS.
    1. Ekstracellulær løsning med 6 mM glukose
      1. Forbered 1 L ECS som inneholder 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glukose, 6 mM melkesyre, 3 mM myo-inositol, 2,5 mM KCl, 2 mM Na pyruvat, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 og 0,5 mM askorbinsyre. Bland grundig til alle ingrediensene er helt oppløst. Ta 50 μL ECS inn i et 0,5 ml mikrosenterfugerør, plasser det på osmometeret i henhold til produsentens instruksjoner, og kontroller osmolariteten.
        MERK: Osmolariteten skal være 300-320 mOsm. For stimulering av betaceller, bruk løsninger med høyere glukosekonsentrasjoner. For å sikre en fysiologisk pH-verdi på 7,4 under kutting og eksperimenter, boble ecs med karbogen (dvs. en gassblanding på 95% O2 og 5% CO2) ved barometrisk trykk. Et enkelt boblesystem kan settes opp ved å feste den ene enden av en 5 mm silisiumrør til kilden til karbogen (dvs. en trykkgassflaske) og den andre enden av slangen plassert direkte i flasken som inneholder ECS.
      2. Alternativt kan du lage en 10x lager som inneholder 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvat, 12,5 mM NaH2PO4 og 5 mM askorbinsyre. Når ECS som inneholder 6 mM glukose er nødvendig, bland 100 ml av lageret med 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2, 0,455 ml 13,2 M melkesyre og 1,08 g glukose, og fyll med dobbeltdestillert vann opp til 1 l. Bruk om nødvendig forskjellige mengder glukose for å oppnå andre glukosekonsentrasjoner.
    2. HEPES buffer med 6 mM glukose
      1. Forbered 0,5 L HEPES-bufret oppløsning (HBS) som inneholder 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glukose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2; titrat til pH = 7,4 med 1 M NaOH.
        MERK: Hvis carbogen ikke er tilgjengelig, kan denne bufferen brukes til alle trinn i stedet for ECS.
    3. Agarose (1,9 % m/m)
      1. Forvarsel et vannbad til 40 °C.
      2. Tilsett 0,475 g lavsmeltingspunkt agarose og 25 ml ECS som inneholder 6 mM glukose til en Erlenmeyer-kolbe, og legg kolben i en mikrobølgeovn med maksimal effekt i noen sekunder til den begynner å koke. Ta kolben ut av ovnen og virvle den et par ganger, til agarose oppløses helt. Overfør kolben med væsken agarose til forvarselet vannbad ved 40 °C for å avkjøle agarose til ønsket temperatur og for å holde den flytende til injeksjon. Fest kolben med en stabiliserende blyring.
        MERK: Agarose kan tilberedes på forhånd og oppbevares i kjøleskapet. Før bruk, varm agarose i mikrobølgeovnen til den flytende, og overfør Erlenmeyer-kolben til et vannbad forvarsel til 40 °C. Agarose kan brukes på nytt opptil 5x. Hvis det brukes på nytt utover 5x, blir det tett og vanskeligere å injisere.
  2. Injeksjon av bukspyttkjertelen med agarose
    MERK: Avsnittene 1.2 og 1.3 forklarer fremstilling av vevsskiver som kan brukes til ulike eksperimentelle formål som kalsiumavbildning, elektrofysiologi, immunhiistokjemi, sekresjonsstudier og strukturelle / mikroanatomiske studier.
    1. Fyll en 5 ml sprøyte med væsken agarose fra Erlenmeyer-kolben i vannbadet fra trinn 1.1.3.2, fjern eventuelle bobler og monter en 30 G nål. Beskytt kanylen med en hette, og hold den fylte sprøyten tilbake i vannbadet med kanylen vendt nedover og hele volumet av agarose under vannoverflaten. Fest sprøyten med en stabiliserende blyring slik at ringen presser sprøyten mot vannbadets vegg.
      MERK: Pass på at du ikke skyver noen agarose inn i nålen, da den vil herdes raskt og blokkere nålen. Hvis romtemperaturen er lav, og hvis injeksjonen utføres av en mindre erfaren person, øk temperaturen på vannbadet opp til 42 °C for å få litt ekstra tid til injeksjon.
    2. Fyll en isbøtte med is, og legg flasken som inneholder ECS i den. Boble ECS konstant på 1,5 ml/min med karbogen ved barometrisk trykk og romtemperatur for å sikre oksygenering og en pH på 7,4.
    3. Ofre en mus ved å administrere en høy konsentrasjon av CO2 etterfulgt av cervical dislokasjon. Gjør alle anstrengelser for å minimere dyrelidelse.
    4. Arbeid under et stereomikroskop, få tilgang til magen via laparotomi (figur 2A). Vend tarmen forsiktig til venstre side av musen (fra musens anatomiske perspektiv) for å eksponere den vanlige gallekanalen. Bruk tang til å løfte duodenaldelen litt, og finn den store duodenale papilla-papillaen til Vater. Klem den vanlige gallekanalen ved duodenal papilla ved hjelp av en hemostat (figur 2B,C) for å forhindre lekkasje av agarose fra kanalen inn i tolvfingertarmen.
      MERK: For å forhindre agaroselekkasje i tolvfingertarmen og videre opp og ned i mage-tarmkanalen, plasser hemostaten på en slik måte at den også klemmer tolvfingertarmen både proksimalt og distalt fra papillaen. Det er best å bruke en buet hemostat til dette formålet.
    5. Med små skarpe tang, nå under den vanlige gallekanalen, og bryt membranen som fester kanalen til bukspyttkjertelvevet. For bedre visuell kontroll og enklere injeksjon, fjern så mye fett og bindevev fra kanalen som mulig.
    6. Plasser kanalen vinkelrett på store tang (figur 2D), og injiser den tilberedte væsken agarose i den proksimale delen av den vanlige gallekanalen (figur 2D). Pass på å klemme sprøyten hardt da agarose er viskøs. Fortsett å fylle bukspyttkjertelen til den blir hvitaktig og litt distended eller i minst 20-30 s.
      MERK: Dette er det mest kritiske trinnet i stykkeforberedelsene. Hvis det er noen knekk i bukspyttkjertelens kanaltre, løft eller trekk bukspyttkjertelen forsiktig bort fra sprøyten for å jevne dem ut. Ikke bestem når du skal stoppe injeksjonen basert på volumet som injiseres fra sprøyten, da tilbakestrømningen ved injeksjonspunktet og fremoverlekkasjen i tolvfingertarmen vanligvis er mye høyere enn volumet som injiseres i bukspyttkjertelens kanaltre. Det er viktig at vellykkede injeksjoner utføres med praktisk talt ubemerket endringer i sprøytevolumet.
    7. Fjern sprøyten, og hell sakte 20 ml av den boblede iskalde ECS ved 0-4 °C fra flasken på bukspyttkjertelen for å avkjøle vevet og herde agarose.
    8. Trekk forsiktig ut bukspyttkjertelen ved hjelp av tang og fin tøff saks. Legg den ekstraherte bukspyttkjertelen i en 100 mm Petri-tallerken som inneholder ~40 ml iskald ECS, og beveg den forsiktig rundt for å vaske den. Overfør bukspyttkjertelen til en frisk 100 mm Petri-tallerken som inneholder ~ 40 ml iskald ECS.
    9. Fra den godt injiserte delen av bukspyttkjertelen, som ser hvitaktig ut (figur 3A), kutt opptil 6 vevsblokker, 0,1-0,2 cm3 i størrelse, ved hjelp av tang og tøff saks. Fjern dem fra ethvert binde- og fettvev.
    10. Fyll en 35 mm ikke-klebrig bunn-Petri-tallerken med ca. 5 ml flytende agarose ved 40 °C, overfør vevsblokkene inn i den, og legg straks Petri-parabolen på isen for å avkjøle den og herde agarose.
      MERK: Måten bukspyttkjertelen er fanget i agarose bestemmer hvordan de kuttes under kutting. Erfarne eksperimentalister kan prøve å finjustere blokkens posisjon i løpet av de få øyeblikkene før agarose herdes når de plasseres på is.
    11. Etter at agarose med vevsblokkene herdes, snu Petri-parabolen opp ned på en flat glatt overflate som lokket på en 100 mm Petri-tallerken, og fjern agarose ved forsiktig å kutte med en halv av et barberblad i margen mellom petriskålens sidevegg og agarose. Med et barberblad, kutt individuelle agarose kuber, som hver inneholder en vevsblokk, og pass på at hver vevsblokk er omgitt av agarose. Fest agaroseblokkene på prøveplaten på vibratomet med cyanoakrylatlim (figur 3B).

Figure 2
Figur 2: Injeksjon av agarose i den vanlige gallekanalen. (A) Åpne bukhulen og utsett organene i bukhulen. (B) Den forstørrede delen av området som er omsluttet av rektanglet i panel A. Den hvite flekken på tolvfingertarmen (indikert med pilen) indikerer vaterens ampulla. Holmer av Langerhans er betegnet med pilspisser. (C) Klem ampulla av Vater med en buet hemostat, og løft den litt for å eksponere og forsiktig strekke den vanlige gallekanalen (pilen). (D) Kanylering av den vanlige gallekanalen og injeksjon av 1,9% agarose oppløsning ved hjelp av en 5 ml sprøyte og en 30 G nål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Slicing
    1. Fyll skjærekammeret til vibratomet med ~ 0,15 L iskald ECS, og boble hele tiden med carbogen. Omgi skjærekammeret med is, og tilsett 2 isbiter (~10 ml hver) laget av ECS med 6 mM glukose i skjærekammeret. Monter barberbladet for kutting på vibratomet, og skru prøveplaten med agaroseblokker på plass.
    2. Sett sliceren til å kutte agarose blokker på 0,05 til 1 mm / s og 70 Hz i 140 μm tykke skiver med et overflateareal på 20-100 mm2. Følg produsentens instruksjoner for slicerinnstillinger.
    3. Umiddelbart etter hvert skjæretrinn, pause sliceren, samle forsiktig skivene med en fin pensel, og overfør dem til en 100 mm Petri-tallerken fylt med 40 ml HEPES-buffer med 6 mM glukose ved romtemperatur (figur 3C).
      MERK: Skivene kan oppbevares i HEPES-buffer ved romtemperatur i minst 12 timer, og bufferen bør byttes hver 2.

Figure 3
Figur 3: Klargjøring og kutting av bukspyttkjertelen. (A) Den ekstraherte bukspyttkjertelen etter agaroseinjeksjon. Hvitt vev til venstre indikerer en godt injisert del (duodenal del), mens den mer rødlige delen til høyre viser den utilstrekkelig injiserte delen av bukspyttkjertelen (miltdel). (B) Vibratom kutting av to blokker av bukspyttkjertelvev innebygd i agarose. (C) Akutt bukspyttkjertelvevskive med holmer av Langerhans indikert med pilspisser. Skalastang = 3000 μm. (D) Akutt bukspyttkjertelvevskive under lysmikroskopet med holmen Langerhans indikert med en pilspiss, asterisk indikerer en bukspyttkjertelkanal. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Levende/død analyse ved bruk av LIVE/DEAD levedyktighets-/cytotoksisitetssett for pattedyrceller

MERK: For noen eksperimenter er det nyttig å kontrollere levedyktigheten til cellene i skivene (figur 4) ved live/dead-analysen som følger.

  1. Følg produsentens anvisninger for å tine hetteglass med reagenser av LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, og klargjør arbeidsløsninger for calcein AM like før bruk. Bruk løsningene innen en dag.
  2. I et 15 ml sentrifugerør, bland 5 μL 4 mM calcein AM (komponent A), 20 μL 2 ml 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1, komponent B) og 10 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS) for å forberede en arbeidsløsning som inneholder ca. 2 μM calcein AM og 4 μM Eth- Virvel grundig.
  3. Bruk en fin pensel, overfør forsiktig vevskivene til en 3 ml Petri-tallerken med fersk HEPES-buffer for å fortynne serumsteraseaktivitet. Fjern HEPES-bufferen, og dekk skivene med 100-200 μL (eller mer om nødvendig) av arbeidsløsningen fra trinn 2.2.
  4. Inkuber skivene i 30-45 min ved romtemperatur i en lukket Petri-tallerken. Bilde vevsskivene ved hjelp av eksitasjons-/utslippsfiltre som anbefalt av produsenten.

3. Kalsiumfarge lasting

MERK: Fluorescerende fargestoffer bør skjermes fra lyseksponering under hele prosessen med tilberedning og lasting av fargestoffet, samt under håndtering av de fargede vevsskivene. Tinnfolie kan brukes til å dekke rør eller Petri-retter som inneholder kalsiumfargen.

  1. Fargestoff forberedelse
    1. Løs opp innholdet i ett hetteglass (50 μg) av cellens gjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargestoff (eksitasjon/utslipp 495/523 nm; se materialtabellen), 7,5 μL dimetylsulfoksid (DMSO) og 2,5 μL polaxamer (20% løsning i DMSO; Tabell over materialer) i 6,667 ml HBS som inneholder 6 mM glukose i et 15 ml skruehettrør.
      MERK: Denne endelige løsningen inneholder 6 μM av Ca2+ indikatorfargen, 0,11% DMSO og 0,037% polaxamer.
    2. Aspirer og utvis løsningen i skruehettrøret gjentatte ganger med en pipette i 20 s; senk røret i et ultralydbadkammer i 30 s, og virvel i 30 s for å forbedre solubilisering. Aliquot 3.333 ml av den endelige Ca2 + indikatorfargeløsningen tilberedt i trinn 3.1.1 til 5 ml Petri-retter.
  2. Fargelegging
    1. Overfør de tilberedte vevskivene fra 60 ml Petri-tallerkenen med HBS til 5 ml Petri-retter fylt med fargestoffoppløsningen ved å løfte hver vevskive forsiktig ved hjelp av en tynn, myk pensel og plassere den i fargestoffløsningen. Inkuber opptil 10 vevskiver per Petri-tallerken.
    2. Plasser den skivebelastede Petri-retten på en orbital shaker ved romtemperatur satt til orbital bevegelse ved 40 omdreininger per minutt i 50 minutter. Inkuber skivene i fargestoffløsningen utsatt for omgivelsesluft ved romtemperatur, men skjermet fra lys ved å dekke Petri-parabolen med tinnfolie.
  3. Lagring av stykker
    1. Overfør de fargede vevskivene fra 5 ml Petri-tallerkenen til en 60 ml Petri-tallerken fylt med fargefri HBS ved å løfte dem forsiktig med en fin, myk pensel. Oppbevar opptil 20 skiver per Petri-tallerken.
      MERK: Bruk vevsskivene til avbildning på dette tidspunktet. Vevskivene vil beholde Ca2+ indikatorfargen i flere timer. Overlevelsen av skiver og oppbevaring av fargestoffet kan forbedres ved å plassere Petri-parabolen i en isolert beholder, omgitt av is. Dette er spesielt viktig hvis de fargebelastede skivene skal transporteres. I tillegg, bytt HBS hver 2.

4. Kalsiumavbildning

  1. Oppsett av det konfiskeringsmikroskopet
    1. Velg en passende objektiv forstørrelse avhengig av studiens interesse. Velg 20x og 25x (numerisk blenderåpning [NA] 0,77-1,00) for visualisering av en hel holme, flere acini samtidig eller større kanaler. Velg høyere forstørrelser for å studere intracellulær dynamikk.
    2. Velg anskaffelsesmodus for tidsforløpavbildning (f.eks. tidsforløp, xyt eller lignende modus). Sett hullhullet til 100-200 μm.
    3. Sett lysbanen for grønne fluoroforer: eksitasjon ved 488 nm, og innsamling av utslipp ved 500-700 nm. Velg fortrinnsvis detektorer med høy kvanteeffektivitet (f.eks. gallium arsenidfosfid) over fotomultiplikatordetektorer.
  2. Oppsett av opptakskammeret og perifusionsystemet
    1. Monter opptakskammeret på det temperaturkontrollerte stadiet av mikroskopet og perifusionsystemet (enten tyngdekraftsmatet eller peristaltisk pumpebasert oppsett, volum 1 ml). Plasser innløpet og utløpet på ytterkantene av opptakskammeret for å unngå meandering av perfusatet i kammeret, og sett innløpet og utstrømningen til like verdier (1-2 ml/ min). Unngå drifting av flytende meniskhøyde og dråper i perifusatet.
    2. Sett temperaturkontrollen av perifusionsystemet til 37 °C.Initier perifusionen med den ikke-stimulerende løsningen, og forbered de stimulerende løsningene. Endre løsningene via motoriserte ventiler eller ved å manuelt bytte løsningene som mater perifusionsystemet.
  3. Registrer kalsiumdynamikk
    1. Overfør en enkelt vevsskive inn i opptakskammeret. Immobiliser vevsskiven med en U-formet platinavekt med stramt nylonnett (f.eks. fra nylonstrømper). Unngå å plassere nylontråder over strukturen av interesse.
    2. Finn en holme/acinus/rør ved hjelp av brightfield-alternativet. Kjør levende avbildning for å plassere de studerte strukturene i synsfeltet, og definer bildeparameterne. Optimaliser signal-til-støy-forholdet ved å justere lasereffekten, detektorforsterkningen og linjegjennomsnittet/binningen for å tillate visualisering av cellene samtidig som laserkraften holdes minimal.
    3. Juster brennplanet for opptaket til ~15 μm under skjæreflaten (figur 5) for å unngå registrering fra potensielt skadede celler på kuttoverflaten.
    4. Hent bilder. Sett samplingsfrekvensen til 1-2 Hz for å oppdage individuelle svingninger i utgangspunktet, og bruk en resonansskanner som er i stand til rask linjegjennomsnitt (8-20) med en høyere anskaffelsesgrad (>10 Hz) for å registrere intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]IC) aktivitet. Tillat et intervall (f.eks. 30 % av den totale prøvetiden) mellom påfølgende punktbelysninger for å forhindre fototoksisitet. Ta opp et høyoppløselig bilde (f.eks. 1024 x 1024 piksler, linjegjennomsnitt > 50) før oppkjøpet av tidsserien (se avsnitt 5).
      MERK: Samplingsfrekvensen på 1-2 Hz er under Nyquist-kriteriet for anskaffelsesfrekvens for de fleste celler, og formen på signalet vil bli undersamplet som standard.
    5. Se et elektronisk diagram, hvis tilgjengelig i bildebehandlingsprogramvaren, for å få umiddelbar tilbakemelding om forberedelsesrespons, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. Ved høy bleking under oppkjøpet, stopp opptaket og reduser lasereffekten samtidig som du øker detektorforsterkningen for å opprettholde signal-til-støy-forholdet. Ved mekanisk drift må det kontrolleres spenning mellom rør/kabler og mikroskopstadiet, samt væskelekkasje eller endringer av volumet i opptakskammeret. Eventuelt, forsøk å korrigere driften under oppkjøpet manuelt; Vær imidlertid oppmerksom på at dette i seg selv vil gi begrensede resultater.
      MERK: Endokrine celler er svært heterogene ved nesten-terskelkonsentrasjoner. En tilstrekkelig lengde på stimulering er nødvendig for å oppdage omfanget av aktiverings- / deaktiveringsforsinkelser i individuelle celler. Dette er spesielt viktig for nøyaktig påvisning av off-responses etter svært stimulatoriske protokoller.
    6. Bruk kalsiumavbildning til å diskriminere funksjonelt mellom endo- og eksokrine celler (figur 6). Hvis du vil registrere midlertidig aktivitet under aktivering og deaktivering, bruker du stimuli uten å stoppe registreringen.
    7. Lagre dataene etter slutten av eksperimenteringen (vurder å bruke en funksjon for automatisk lagring). La en kjøleperiode før du slår av laserstrømmen for ikke å skade laserne under avstengingsprosedyren.

5. Analyse av data

  1. Inspiser opptaket kvalitativt visuelt ved å spille av tidsforløpvideoen på nytt. Se etter celledrifter fra synsfeltet eller det optiske planet. Hvis det har oppstått en drift i det optiske planet, bruker du plugin-modulen for driftkorrigering i ImageJ.
  2. Velg interesseområder (ROIer) ved hjelp av mikroskopprogramvare eller tredjepartsprogramvare. Bruk bildet med høy oppløsning, maksimal projeksjon eller rammegjennomsnitt som referanse for å velge ROIer. Spill av tidsforløpavbildningen på nytt for å visualisere responderende celler som ikke er synlige i referansebilder. Plasser ROI-ene slik at det merkede området i en avkastning ikke overlapper med nærliggende celler for å unngå signalkryss mellom ROIer.
  3. Eksporter tidsseriedataene som GJENNOMSNITTSVERDI FOR AVKASTNING per ramme. Eksporter avkastningskoordinater.
  4. Korrigere tidsseriedataene for bleking (figur 7A) ved å bruke en kombinasjon av eksponentiell og lineær passform, som beskrevet av
    Equation 1(1)
    hvor x(t) betegner fluorescenssignalet på et tidspunkt t; xcorr(t) det korrigerte signalet på de tilsvarende tidspunktene; og a, b og c parameterne for tilpasningen beregnet som minste summen av kvadratene mellom korrelasjonen(t) og x(t).
  5. Analysere aktiverings- og deaktiveringsfasen av svaret (figur 7B). Beregn det første derivatet av tidsseriedataene, og bestem henholdsvis zenith og nadir av derivatet som tilsvarer aktivering og deaktivering. Alternativt kan du manuelt velge starten på faseøkningen. Lagre og eksporter aktiverings-/deaktiveringstidene og tilsvarende cellekoordinater.
  6. Analyser platåfasen (figur 7C). Oppdag individuelle svingninger ved å terske ut rådataene eller ved å testavne det første derivatet av tidsseriedataene. Definer begynnelsen og slutten på en individuell oscillasjon som tiden som tilsvarer svingningens halve amplitude.
    1. Beregn varigheten og frekvensen av individuelle svingninger for hver celle. Beregn den inverse verdien av interspike-intervallet (egnet for vanlige aktivitetsmønstre). Alternativt kan du dele antall svingninger etter tidsintervallet for posten (egnet for uregelmessige aktivitetsmønstre).
    2. Beregn det aktive klokkeslettet. Uttrykk det aktive klokkeslettet som summen av varigheter, og del denne verdien med tidsintervallet. Alternativt kan du multiplisere frekvensen og varigheten som tilsvarer en oscillasjon.
      MERK: Å dele summen av varigheter med tidsintervallet gir robuste resultater, men har lav statistisk diskriminering ettersom et enkelt datapunkt per celle oppnås. Multiplisering av frekvensen og varigheten av en oscillasjon gir en oscillasjon-til-oscillasjon temporal oppløsning.

Representative Results

Injeksjonen av agaroseoppløsningen i bukspyttkjertelkanalen er det mest kritiske trinnet i pankreasvevsskivepreparatet. En vellykket injeksjon kan gjenkjennes ved bleking av bukspyttkjertelen vev, som sett på venstre side av figur 3A, mens en ufullstendig injisert del av bukspyttkjertelen presenteres på høyre side av figur 3A. Langerhans holmer kan gjenkjennes av det blotte øye eller under et stereomikroskop, og dette hjelper til med å kutte de riktige delene av bukspyttkjertelen for etterfølgende innbygging i agaroseblokker (figur 3B). I en nykuttet pankreasvevsskive for mus kan holmer av Langerhans lett skille seg fra det omkringliggende eksokrinevevet og mesenchymet som hvite flekker under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brune strukturer under lysmikroskopet (figur 3D). Bukspyttkjertelvevskivene kan brukes til forskjellige typer eksperimenter i minst 12 timer etter kutting. I tillegg til den grove morfologiske vurderingen under stereomikroskopet, lysmikroskopet og de funksjonelle responsene til celler under kalsiumavbildning, kan levedyktigheten til bukspyttkjertelvevskivene vurderes (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Levedyktigheten til celler i vevsskiven. Levedyktigheten til celler ble bestemt med Live/Dead-analysen. Levende celler er farget av Calcein AM (vist i grønt), mens døde celler er farget med ethidium homodimer-1 (vist i rødt). Gule linjer angir plasseringen av X-Y-tverrsnittet i Z-stabelen som vises nederst og til høyre. Hele dybden på Z-stabelen er 88 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For kalsiumavbildningsforsøk må fluorescerende kalsiumindikator trenge gjennom noen få lag med celler. Figur 5A presenterer vellykket lasting av den cellegjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargen i bukspyttkjertelvevsskiven der individuelle holme- og acinarceller kan gjenkjennes. I motsetning er skiver i figur 5B-D ikke optimale på grunn av mislykket penetrasjon av fargestoffet (figur 5B), mangel på holmeceller (figur 5C) og mye nekrotisk vev på overflaten (figur 5D). Slike skiver kan kastes, kontrolleres for tilstedeværelse av ekstra holmer som er kuttet eller farget bedre (se tabell 1 for feilsøking), eller brukes til å registrere svarene til eksokrine celler.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på brukbare og ubrukelige preparater. (A) Et eksempel på en vellykket fremstilling av bukspyttkjertelen vevsskive med godt fargede celler i langerhans holmer, samt ductalceller og omkringliggende acinar vev. (B) Et eksempel på en dårlig farget vevsskive. (C) Eksempel på en holme av Langerhans med strukturelle seponeringer. (D) Et eksempel på en holme av Langerhans som inneholder mange døde celler og mye rusk. Oppslagstabellen "glow-over, glow-under" til høyre viser 0 intensitet i grønt og metning i blått. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative resultater fra kalsiumavbildning ved bruk av det cellegjennomtrengelige Ca2+ -indikatorfargen er vist i figur 6. I figur 6A presenteres et høyoppløselig bilde av en bukspyttkjertelvevskive, som inneholder en holme av Langerhans, acinarvev og en bukspyttkjertelkanal. For bedre distinksjon er den endokrine, eksokrine og kanalbaserte delen av bukspyttkjertelen vevsskive presentert i figur 6A farget i figur 6B. Bruk av passende stimuli kan funksjonelt diskriminere mellom forskjellige holmeceller, eller holme og ikke-holmeceller51. Betaceller vil vanligvis reagere på en firkantet pulsstimulering av glukose med en forbigående økning i [Ca. 2+]IC etterfulgt av raske kalsiumsvingninger på et vedvarende platå (figur 6C, øvre panel).

Siden alle betaceller er koblet til et enkelt, stort, funksjonelt synytium, er disse svingningene også svært godt synkronisert mellom forskjellige celler ved å spre [Ca2+]IC-bølger 32,34,52,53,54 (figur 7C). Langsommere [Ca2+]IC-svingninger med en periode på 5-15 minutter kan ligge til grunn for de raske svingningene eller til og med være den dominerende typen reponse55,56. Den samme enkle protokollen kan avsløre andre typer svar, spesielt i periferien av holmer (figur 6C, nedre panel). Siden disse cellene ikke er synkronisert med betaceller og reagerer med raskere og mer uregelmessige svingninger som allerede er til stede under lave glukoseforhold eller med en reduksjon i aktiviteten, er slike svar svært antydende for ikke-betaceller 21,32,57,58. Imidlertid krever deres definitive funksjonelle karakterisering mer komplekse protokoller med ekstra stimuleringstrinn eller alternative tilnærminger, som diskuteres nedenfor. Typiske responser av acinar- og kanalceller presenteres i henholdsvis figur 6D og figur 6E. Se litteraturen for mer informasjon om acinar og kanalceller 22,23,35.

Figure 6
Figur 6: Representative resultater av kalsiumdynamikk i distinkte typer bukspyttkjertelceller. (A) Et høyoppløselig bilde av en holme av Langerhans med omkringliggende vev. Skala bar = 100 μm. (B) Avgrensning av distinkte deler av bukspyttkjertelen vev med acinar vev vist i gult, en holme av Langerhans vist i rødt, og et segment av kanaltreet i blått. Skala bar = 100 μm. (C) Typiske spor av kalsiumdynamikk i beta og putative ikke-betaceller under stimulering med 12 mM glukose; 3 mM glukose ble brukt til ikke-stimulatoriske forhold. Protokoller som kan brukes til mer spesifikk diskriminering av ikke-betaceller, er beskrevet i diskusjonsdelen. (D) Et typisk spor av kalsiumdynamikk i acinarceller stimulert med 25 nM acetylkolin. (E) Et typisk spor av kalsiumdynamikk i kanalceller stimulert av 1 mM kenodeoksykolsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter vellykket kalsiumavbildning eksporteres og korrigeres dataene først for bleking ved en kombinasjon av eksponentiell og lineær passform, som beskrevet i protokolldelen. En tidsserie før og etter blekingskorreksjon presenteres i figur 7A. Deretter kan flere parametere i aktiverings- og deaktiveringsfasen av responsen samt platåfasen analyseres. En forsinkelse i utbruddet av [Ca. 2+]IC-økning etter stimulering kan måles som representert ved forsinkelseA i figur 7B og heterogeniteten i forsinkelser mellom enkeltceller (forsinkelseA1). De samme parameterne (forsinkelseD og forsinkelseD1) kan brukes til å beskrive deaktiveringsfasen. Etter den første forbigående [Ca2+]IC-økningen er platåfasen i de fleste bukspyttkjertel betaceller i en holme preget av relativt vanlig høy frekvens [Ca. 2+]IC-svingninger . Platåfasen kan beskrives ved å analysere de klassiske funksjonelle parametrene. Den skjematiske presentasjonen av [Ca. 2+]IC-svingninger , varighet, frekvens og prosentandel av aktiv tid presenteres i figur 7C. Ved kalsiumavbildning med oppkjøpsrater høyere enn 10 Hz, kan kalsiumbølger som gjentatte ganger sprer seg over holmen også gjenkjennes tydelig (figur 7C).

Figure 7
Figur 7: Analyse av tidsseriedata. (A) Retting av tidsseriedata for fotobleaching. (B) Analyse av aktiveringsforsinkelser etter stimulering og deaktivering etter opphør av stimulering med 12 mM glukose. Stimuleringsvarigheten er betegnet med den lysegrå, skyggelagte linjen i bildet. (C) Analyse av flere parametere i platåfasen: I) Svingningens varighet bestemt ved halvhøyde, II) frekvens av svingninger bestemt av inter-oscillasjonsintervaller. III) aktiv tid som et produkt av frekvens og varighet av svingninger. I-IV) Forsinkelser mellom svingninger i en gitt bølge av svingninger som sprer seg over langerhans holme bestemt av forsinkelsene (Δt) i tide der en enkelt celle når halv høyde av svingningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Bukspyttkjertelvevsskivemetoden er en rask eksperimentell metode for å studere morfologien og fysiologien til de endokrine og eksokrine delene av bukspyttkjertelen i en mer bevart, in situ forberedelse. Mange av fordelene er allerede påpekt i innledningen. Det er verdt å påpeke at generelt (dvs. ikke bare for kalsiumavbildning), sparer skivetilnærmingen for å studere bukspyttkjertelfysiologi tid fordi det ikke innebærer en gjenopprettingsperiode etter isolasjon. Sistnevnte er ikke absolutt nødvendig med alle typer eksperimenter og bruk av isolerte holmer fra forskjellige arter, men brukes vanligvis til å øke renhet, gjenopprette levedyktighet og funksjonalitet, og noen ganger å samle holmer fra flere givere 59,60,61,62,63,64 . Men i sammenheng med kalsiumavbildning har betacelleresponser vist seg å avhenge av kulturens varighet og forhold, og dette er en viktig kilde til variasjon som bør tas i betraktning ved bruk av isolerte holmer15,65. Det samme problemet bør vurderes for vevsskiver hvis deres langsiktige kultur blir et mye brukt alternativ i fremtiden22,36. Vevsskivemetoden har også et høyt utbytte og reduserer dermed potensielt dyrelidelser og øker statistisk kraft. Videre kan så mange skiver fremstilles fra et enkelt dyr, og fordi skivene overlever i lange perioder, inkludert samme dyr eller til og med samme holme i både eksperimentelle og kontrollgruppene blir gjennomførbare.

Etter hvert som den opprinnelige arkitekturen og celle-til-celle-kommunikasjonen bevares, og fordi den er kompatibel med en rekke strukturelle analyser, elektrofysiologiske, avbildningsmetoder og hormonsekresjonsanalyser, er denne metoden spesielt nyttig for å studere bukspyttkjertelfunksjoner som er avhengige av uforstyrrede interaksjoner mellom individuelle celler, for eksempel følsomhet overfor secretagogues, paracrine og immuninteraksjoner mellom forskjellige celletyper, mønstre av elektrisk aktivitet, egenskaper av kalsiumdynamikk og sekresjon av forskjellige hormoner. For kalsiumavbildning spesielt er de viktigste fordelene ved å bruke skiver eksponeringen av holmekjernen og muligheten til å skaffe signaler fra mange forskjellige celletyper med høy oppløsning. Avhengig av kravene til eksperimentet og dyrenes alder, kan tykkelsen varieres, skivene kan transfekeres, eller oppnås fra dyr med genetisk kodede reportere. Som forklart mer detaljert nedenfor, muliggjør de to sistnevnte tilnærmingene også spesifikk funksjonell identifikasjon og karakterisering av svar fra ikke-betaceller 31,66. Videre kan holmer fra veldefinerte deler av orgelet studeres for forskjeller i respons eller følsomhet for sykdom. Selv om de ikke krever en utvinning inkubasjonsperiode, kan de lett inkuberes med forskjellige farmakologiske midler, fettsyrer, høy glukose og cytokiner.

Viktigst, da høy oppløsning er oppnåelig i kombinasjon med encellet eller til og med subcellulær oppløsning, er konfokal kalsiumavbildning i skiver en av de mest egnede metodene for å analysere kalsiumbølger, funksjonell tilkobling og de forskjellige funksjonelle rollene til celler i forskjellige deler av en holme54,67. Til tross for en rekke fordeler har vevsskivetilnærmingen viktige begrensninger. For det første er det fortsatt delvis forstyrrende for holme- og eksokrine arkitektur, spesielt på kuttoverflaten, og forholdsregler, for eksempel lav temperatur, hyppig utveksling av løsninger og mild og rask manipulering, er nødvendig under forberedelsen for å forhindre ytterligere mekanisk og endogen enzymatisk skade. For det andre er mønstrene for nærings- og secretagogue-levering fortsatt dårligere enn in vivo-ruten, preparatet er løsrevet fra systemisk innervering, og interorgantilbakemelding, som mellom holmen og målvevet, er umulig, i motsetning til in vivo-tilnærminger. For det tredje er maksimal skivetykkelse begrenset av oksygenering, næringstilførsel og pH-regulering ved ~ 200 μm9. Videre trenger både forberedelse av skiver og avbildning mye trening, og grundige analyser av kalsiumdata fra lange tidsserier og fra mange celler krever spesialisert kunnskap som ofte ikke er inkludert i verktøysettet til en klassisk fysiolog og krever hjelp fra fysikere eller dataforskere. Fordelen med at homo- og heterotypiske interaksjoner bevares, kan også komplisere analysen av prøver på grunn av tilstedeværelsen av signaler fra andre celler i interesseområder. Avhengig av protokoller kan aktivering av andre celler føre til indirekte ytterligere stimulering eller hemming av en observert celle.

Dette kan bare løses avgjørende ved dekonvolusjonstilnærminger, ved mer komplekse stimuleringsprotokoller, inkludert stoffer som blokkerer noen av de indirekte effektene, ved å bruke spesifikke knock-out dyr, og ved nøye sammenligning av resultater med resultater fra andre studier som bruker mer reduksjonistiske metoder. I tillegg, hvis sekresjonsmålinger er nødvendige, bør du huske på at noen skiver kan mangle holmer, og den totale massen av endokrine vev i en enkelt skive er vanligvis lav. Utarbeidelsen av akutte bukspyttkjertelvevsskiver for avbildning innebærer flere kritiske trinn som er omtalt i avsnittene nedenfor og oppsummert i tabell 1, der leseren også kan finne korte, men viktige tips for feilsøking. Først, når du forbereder agaroseoppløsningen, må agarosepulveret oppløses helt, ellers kan de uløste partiklene hindre injeksjonen. Hold den homogene agaroseoppløsningen ved 37-45 °C for å forhindre herding av agarose på grunn av for lav temperatur på den ene siden og for å forhindre vevsskader på grunn av for høye temperaturer på den annen side. Etter bruk kan den gjenværende agarose lagres ved 4 °C og varmes opp igjen, selv om gjentatt oppvarming kan føre til økt tetthet på grunn av vannfordampning, noe som til slutt gjør injeksjonen vanskelig eller umulig.

Det neste kritiske trinnet i preparatet er å klemme den store duodenale papillaen riktig. En hvit flekk på tolvfingertarmen indikerer krysset mellom den vanlige gallekanalen og tolvfingertarmen. En klemme plassert for proksimalt vil resultere i hindring av noen laterale bukspyttkjertelgrener av den vanlige kanalen, deaktivere injeksjonen av disse delene, mens en klemme plassert for distalt vil føre til at agarose lekker gjennom den nedre motstandsbanen direkte inn i tolvfingertarmen. Før kanalisering av den vanlige gallekanalen kan det omkringliggende fettvevet forsiktig fjernes for bedre visualisering av kanalen og større kontroll under injeksjon. Utilstrekkelig presisjon under fjerning av det omkringliggende vevet kan føre til perforering av kanalen. Valget av nålediameteren som brukes til agarose injeksjon er også viktig. Hos mus brukes en 30 G nål fortrinnsvis; mindre (32 eller 33 G) nåler krever mer innsats på grunn av høy viskositet av agaroseoppløsningen og er mer utsatt for obstruksjon. Men hvis de brukes i kombinasjon med en agaroseløsning med lavere tetthet, kan de være svært nyttige i mindre musestammer og yngre dyr. I løpet av de første barseldagene kan agarose alternativt injiseres subkapsulært i stedet for intraductally2. Bruk av nåler med større diameter hos mus vil mest sannsynlig føre til skade på den vanlige gallekanalen. Dette kan også skje med riktig nåleediameter, og en tang kan bidra til å holde nålen på plass under injeksjon. Nåler med større diameter kan være den eneste løsningen i tilfelle større kanaler, som finnes hos rotter. Hvis nålen er for smal til å sikre en tett forsegling som forhindrer tilbakelekkasje, kan en ligatur plasseres rundt den ved vellykket inntreden i kanalen.

Agarose injeksjon tar litt innsats på grunn av løsningens viskositet, og når injeksjonsprosessen har startet, bør den ikke avbrytes da den lavsmeltende agaroseoppløsningen kan størkne i nålen eller de største delene av kanaltreet før injeksjonen er fullført. Dette vil resultere i dårlig vev penetrasjon og verre støtte under kutting. Kanalen skal alltid være kanylert på det punktet hvor venstre leverkanal og den cystiske kanalen kobles sammen for å danne den vanlige gallekanalen.. Hvis den vanlige gallekanalen blir perforert, prøv gjentatte ganger å cannulating nærmere tolvfingertarmen. Når bukspyttkjertelen er tilstrekkelig stabilisert med agaroseoppløsning og ekstrahert fra bukhulen, kuttes små biter av godt injisert vev. Før du legger dem inn i agarose, er det avgjørende å fjerne alle fett- og bindevevene når rester gjør kuttingen mer utfordrende. Det samme gjelder blodkar og kanalrester, unntatt når de er fokus for eksperimentet. I dette tilfellet må du sørge for å plassere dem på en slik måte at ønsket tverrsnitt vil bli oppnådd. Når du legger inn vevet i agarose, må du sørge for at temperaturen er passende (37 °C), og at vevet er helt omgitt av agarose, da krefter under vibratom kutting kan rive ut bukspyttkjertelvevet fra de agarose blokkene.

Rask tørking av vevsblokkene før du plasserer dem i agarose ved å plassere dem kort på et papirvev, kan bidra til å forhindre dårlig kontakt mellom vev og agarose i løpet av dette trinnet. Under størkning av agarose blokker, plasser Petri parabolen horisontalt, og forhindre kontakt mellom bukspyttkjertelen vev og bunnen av Petri parabolen. Hvis bukspyttkjertelen ikke injiseres helt, vil skjæreprosessen være utfordrende. Prøv derfor å redusere skjærehastigheten for å oppnå vevsskiver. For å minimere celleskader under vibratom kutting, bytt ut ECS (og isbitene laget av ECS) regelmessig i skjærekammeret. Sistnevnte vil redusere aktiviteten til bukspyttkjertelenzymer frigjort fra acinarvev under kutting. Tykkelsen på skivene er også av avgjørende betydning. For kalsiumdynamikk og elektrofysiologiske eksperimenter blir 140 μm skiver vanligvis kuttet; Men i henhold til målet med studien kan skivetykkelsen variere fra 90 μm til 200 μm. Husk at i tykkere skiver vil diffusjonen av oksygen og næringsstoffer være begrenset, men de vil inkludere mer vev. I tillegg kan andelen uklippede holmer forventes å øke med økende skivetykkelse. Skiver kan lagres i en regelmessig byttet ECS ved romtemperatur i flere timer eller til og med dyrkes i et passende cellemedium i flere dager; Dette kan imidlertid til slutt påvirke den normale holmecellefysiologien 3,22.

Når du forbereder fargestoffløsningen, må du sørge for forsiktig blanding av alle komponenter, og unngå eksponering for omgivelseslys. Bukspyttkjertelskiven består av mange cellelag, og opptaket av kalsiumfarge er begrenset til de første mest overfladiske cellelagene, som beskrevet tidligere for isolerte holmer58,68 og hypofyseskiver69. Men i motsetning til isolerte holmer der den omkringliggende kapselen og ytre cellelag hindrer penetrasjon av fargestoffet i dypere lag, gir vevsskiver tilgang til hele tverrsnittsoverflaten av holmen, noe som muliggjør samtidig måling av kalsiumdynamikk i hundrevis av celler fra alle lag av en holme. Fluorescerende Ca2+ indikatorer er de mest brukte for måling av kalsiumdynamikk, og sammen med CLSM muliggjør de opptak med høy temporal oppløsning, og når flere hundre Hertz. Når du velger den mest passende fluorescerende Ca2+ indikatoren, bør du vurdere forskjellige faktorer, inkludert indikatorformen, som påvirker cellelastemetoden, målemodus (kvalitativ eller kvantitativ) og dissosiasjonskonstant (Kd) som må være i Ca2 + konsentrasjonsområdet av interesse og avhenger av pH, temperatur, tilstedeværelse av Mg2 + og andre ioner, samt proteinbinding. Siden cellulære Ca2+-signaler vanligvis er forbigående, bør ca2+ bindingshastighetskonstanten også vurderes. For måling av [Ca2+]IC-dynamikken i bukspyttkjertelceller bruker denne gruppen hovedsakelig den cellegjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargen som er beskrevet i denne protokollen (Materialtabell), da det er en lang bølgelengdeindikator med utslippsbølgelengdene i spekteret der cellulær autofluorescence vanligvis er mindre problematisk, og energien til eksitasjonslys er lav, noe som reduserer potensialet for cellulær fotodamage. Fordi dette fargestoffet er fluorescerende ved lave Ca2+ konsentrasjoner, letter dette bestemmelsen av baseline [Ca2 +]IC og øker cellulær synlighet før stimulering. Etter å ha tilsagt Ca2+, øker fluorescensintensiteten til fargestoffet 14 ganger, noe som muliggjør påvisning av selv små endringer i [Ca2+]IC.

For vellykket kalsiumavbildning i levende celler må flere viktige maskinvareparametere vurderes, som beskrevet i protokolldelen. For levende celleavbildning der signalamplituder er lave og sjansene for fototoksisitet er høye, brukes mål med høyere NA fortrinnsvis til å samle mer lys fra prøven. Hvis kalsiumdynamikk må registreres med høy temporal oppløsning, bruk resonansskanneren i stedet for lineære galvanisometre. I tillegg til å velge riktig mål, unngår bruk av svært følsomme detektorer - for eksempel hybriddetektorer som krever mindre laserkraft, fototoksisitet og fotobleaching. Dette er av spesiell betydning for langvarig kalsiumavbildning. Andre viktige trinn i kalsiumavbildning er parameterinnstillinger for bildekvalitet for tidsserieanskaffelser. De viktigste er den tidsmessige og romlige oppløsningen. Ettersom kalsiumdynamikken i seg selv bestemmer den laveste akseptable temporale oppløsningen, må samplingsfrekvensen være minst to ganger høyere enn forventet signalfrekvens for å oppdage signalet eller til og med 10 ganger høyere for å oppdage formen på signalet pålitelig. I akutte bukspyttkjertelvevsskiver kan kalsiumdynamikk måles i hundrevis av celler samtidig, og derfor er den romlige oppløsningen også viktig. Dette kan forbedres ved å øke antall piksler eller ved å øke linjegjennomsnittet under direkte anskaffelse. På grunn av det inverse forholdet mellom den romlige og den tidsmessige oppløsningen er det imidlertid nødvendig med en avveining mellom begge innstillingene.

Hvis kalsiumavbildning må utføres i en bestemt cellepopulasjon i bukspyttkjertelen, er det nødvendig med en stimulans som kan skille cellene i stykket funksjonelt. Høy glukose reliably og raskt aktiverer betaceller til et oscillatorisk mønster som er lagt på et forhøyet kalsiumnivå og er svært synkronisert blant alle celler i en holme 32,58,70. Betacellene er den mest tallrike celletypen i en holme og ligger for det meste i holmekjernen hos mus. Den samme stimuleringsprotokollen reduseres og endrer noen ganger ikke sprengningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. For å diskriminere alfaceller funksjonelt, kan lav (3 mM) glukose, glutamat eller adrenalin brukes til å øke frekvensen eller basal [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. De representerer 10-20% av holmecellene og vil bli oppdaget på holmen periferi1. Deltaceller finnes også i periferien. De utgjør bare ~ 5% av det totale antallet endokrine celler i en holme og er vanligvis aktive i 6 mM glukose og reagerer på glukosestimulering med økt uregelmessig sprengningsaktivitet fra grunnlinjen eller et litt forhøyet kalsiumnivå 1,32,71,76. Ghrelin kan brukes til spesifikk stimulering av deltaceller 21,77,78,79 i kalsiumavbildningsforsøk. Protokoller for spesifikk funksjonell identifikasjon av PP- og epsilonceller gjenstår imidlertid å definere. Videre aktiverer 25 nM acetylkolin pålitelig acinarceller til sprengningsaktivitet 35,80,81. I tillegg kan en rekke andre secretagogues, som cerulein, cholecystokinin og karbamylcholine, brukes til å fremkalle kalsiumresponser i acinarceller 22,40,82,83.

Til slutt fremkaller 1 mM kenodeoksykolsyre pålitelig kalsiumresponser i kanalceller i vevsskiver; angiotensin II, ATP og noen andre secretagogues kan også brukes 11,23,84,85. Når en funksjonell identifikasjon basert på karakteristiske responser på spesifikke sekretesse og hemmere ikke er tilstrekkelig, kan genetisk merkede dyr31, transfekterte celler73 eller immunocytokjemi brukes til identifisering av forskjellige celletyper 9,22,71,86 . I løpet av de siste par årene har vevsskivemetoden blitt vellykket tilpasset menneskelig vev, og åpnet mange nye viktige forskningsveier i både eksokrine41 og endokrine fysiologi 9,36,37,39. Interessant nok har en detaljert vurdering av kalsiumdynamikk i menneskelige holmer vært notorisk vanskelig og gjenstår å undersøke nærmere87. Kombinert med avansert konfektmikroskopi har pankreasvevsskivemetoden gjort det mulig for mange nye innsikter i kalsiumdynamikken hos mus og vil forhåpentligvis gjøre det samme for menneskelig vev.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersiell eller økonomisk interesse.

Acknowledgments

Arbeidet som ble presentert i denne studien ble økonomisk støttet av Det slovenske forskningsbyrået (forskningskjernefinansieringsnr. P3-0396 og I0-0029, samt forskningsprosjekt nr. J3-9289, N3-0048 og N3-0133) og av Det østerrikske vitenskapsfondet / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale tilskudd I3562--B27 og I4319--B30). Vi takker Maruša Rošer, Maša Čater og Rudi Mlakar for utmerket teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

Biologi Utgave 170 Bukspyttkjertel agarose vevsskive in situ forberedelse konfokal laserskanning mikroskopi kalsiumavbildning encellet oppløsning 3R
Confocal Laser Skanning Mikroskopi Av Kalsiumdynamikk i Akutt Mus Bukspyttkjertelen Vev Skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,… More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter