Summary
여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 이용한 입양 세포 치료는 혈액학적 악성 종양 환자에서 놀라운 임상 효능을 입증했으며 현재 다양한 고형 종양에 대한 조사를 받고 있습니다. CAR-T 세포는 환자의 혈액에서 T 세포를 제거하고 표적 종양 세포를 인식하고 제거하기 위해 T 세포를 리디렉션합성 면역 수용체를 발현하도록 엔지니어링하여 생성됩니다. CAR-T 세포의 유전자 편집은 현재 CAR-T 세포 치료의 안전성을 개선하고 CAR-T 세포의 효능을 더욱 증가시킬 가능성이 있습니다. 여기에서는 인간 CRISPR 에서 설계한 CD19 지향 CAR-T 세포의 활성화, 확장 및 특성화에 대한 방법을 설명합니다. 이는 CAR 렌티바이러스 벡터의 트랜스듀션및 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 엔도누셀의 사용을 T 세포에 대한 관심있는 유전자를 표적으로 하는 것으로 구성된다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 이 연구를 위해 사용된 것 이외에 그밖 CAR 구조 및 표적 유전자에 보편적으로 적용될 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 gRNA 설계를 위한 전략을, 리드 gRNA 선택 및 임상급 인간 T 세포의 고효율, 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 공학을 재현가능하게 달성하기 위한 표적 유전자 녹아웃 검증에 대해 설명합니다.
Introduction
키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료제는 입양세포 치료 및 암 면역요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. CAR-T 세포는 T-세포 활성화 및 공동 자극1,2,3,4에 필요한 TCRzeta 사슬 및 비용 발생 도메인에서 파생된 신호 도메인과 항원 특이적 단일 사슬 항체 단편을 결합하는 합성 면역 수용체를 발현하는 T-세포설계 . CAR-T 세포의 제조는 환자의 T 세포를 추출하는 것으로 시작하여 CAR 모듈의 전 생체 바이러스 성 트랜스포 변환 및 인공 항원 제시 세포로 작동하는 자기 구슬로 CAR-T 셀 제품의 확장에 선행된다5. 확장된 CAR-T 세포는 이식할 수 있는 환자로 재주입되어 표적 종양 세포를 제거하고 주입6,7,8까지다년간 지속된다. CAR-T 세포 치료는 B 세포 악성 종양에서 놀라운 반응률을 초래했지만, 고형 종양에 대한 임상 성공은 가난한 T 세포 침투9,면역 억제 종양 미세 환경10,항원 커버리지 및 특이성 및 CAR-T 세포 기능 장애11,12를 포함한 여러 요인에 의해 도전되었습니다. . 현재 CAR-T 세포 치료의 또 다른 제한은 자가 T 세포의 사용을 포함한다. 화학요법과 높은 종양 부담의 다발 후에, CAR-T 세포는 자가 CAR-T 세포의 제조와 관련되었던 시간 및 비용 이외에 건강한 기증자에서 동종 CAR-T 제품에 비해 나쁜 질일 수 있습니다. CRISPR/Cas9에 의한 CAR-T 세포 제품의 유전자편집은 CAR-T 세포13,14,15,16,17의현재 한계를 극복하기 위한 새로운 전략을 나타낸다.
CRISPR/Cas9는 포유류세포(18,19)에서표적 게놈 편집에 사용될 수 있는 2개의 성분 시스템이다. CRISPR-관련 엔도누블레스 Cas9은 표적 DNA서열(20)과염기 페어링을 통해 작은 RNA에 의해 유도된 사이트 별 이중 가닥 브레이크를 유도할 수 있다. 수리 템플릿이 없는 경우, 이중 가닥 파손은 오차경향이 있는 비homologous end 결합(NHEJ) 경로에 의해 수리되며, 삽입 및 삭제 돌연변이(INDELs)19,20,21을통해 프레임 시프트 돌연변이 또는 조기 정지 코돈의 결과로 된다. 효율성, 사용 용이성, 비용 효율성 및 멀티플렉스 게놈 편집 능력은 CRISPR/Cas9를 자가 및 동종 CAR-T 세포의 효능과 안전성을 향상시키는 강력한 도구입니다. 이 방법은 CAR 구조를 TCR로 대체하여 TCR 지시 T 셀을 편집하는 데도 사용할 수 있습니다. 또한, 숙주 질병 대 접목을 일으킬 수 있는 잠재력이 제한된 동종 CAR-T 세포는 또한 TCR, b2m 및 HLA 궤적을 편집하는 유전자에 의해 생성될 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 T 세포의 CRISPR 공학이 향상된 효험과 안전성을 가진 게놈 편집 CAR-T 세포 제품을 생성하기 위하여 CAR-Transgene의 바이러스 벡터 매개 납품과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 전체 프로세스의 회로도도는 그림 1에표시됩니다. 이 접근을 사용하여, 우리는 1 차적인 인간 CAR-T 세포에 있는 고효율 유전자 녹아웃을 보여주었습니다. 그림 2A는 T 셀 편집 및 제조를 위한 각 단계의 타임라인을 자세히 설명합니다. 가이드 RNA 설계 및 녹아웃 검증을 위한 전략은 또한 각종 표적 유전자에 이 접근을 적용하기 위하여 토론됩니다.
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Protocol
인간 T 세포는 펜실베니아 대학 인간 면역학 코어를 통해 조달되었으며, 이는 MIATA 및 펜실베니아 대학 윤리 지침에 부합하는 샘플 수령, 처리, 동결 및 분석을 위한 확립된 표준 운영 절차 및/또는 프로토콜을 갖춘 우수 실험실 실습의 원칙에 따라 운영됩니다.
1. 렌티바이러스 벡터 생산
참고: 바이러스 성 제품은 4 개의 별도 플라스미드로 포장 구조 (Rev, gag/pol/RRE, VSVg 및 전송 플라스미드)를 분리하여 복제 결함이 있어 복제 능력이 있는 바이러스를 초래할 수 있는 재결합 이벤트의 가능성을 크게 줄였습니다.
- FEFection 하루 전에 HEK293T 세포를 준비하십시오. 표준 배양 배지의 30mL에서 T150 배양 용기에서 약 6 x 106 세포를 플레이트 (R10:RPMI 1640이라고 함 10% 태아 송아지 혈청으로 보충, 10m HEPES, 1% 펜/스트렙, 1% L-글루타민) 및 37°C. 18-24h 이후의 하룻밤 배양, 세포는 60-70% 컨실수 있어야 하며 건강해 보입니다(플라스크 를 가로지르는 수지상 프로젝션 및 균일한 분포). 세포가 건강해 보이는 경우 1.2단계로 진행하십시오.
- 리포펙션 시약(96 μL), pTRP 개그/폴(Lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev(Lot# RR13SEP19B-3)를 포함하는 트랜스페션 믹스를 준비하세요. (18 μg), pTRP VSVG (Lot# RR13SEP19C) (7 μg) 포장 플라스미드 및 15 μg의 발현 플라스미드 (cd19bbz scFv pTRPE로 복제).
- 각 경질 반응에 대해, 1m의 감소세럼 최소 필수 미디어와 1.2 단계에서 설명된 4개의 플라스미드를 포함하는 튜브 1개와, 1mL의 감소된 혈청 최소 필수 미디어 2mL를 포함하는 1개의 튜브와 90μL의 리포펙션 시약을 준비한다. 이 두 가지 솔루션을 1mL 플라스미드 믹스를 리포페션 시약 믹스의 2mL에 드롭와이즈 로 추가하여 결합합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 용액을 적극적으로 혼합해야 합니다. 실온에서 15분 동안 용액을 배양합니다.
- 한편, HEK293T 셀 플라스크에서 미디어를 흡인하고 10mL의 감소된 혈청 으로 부드럽게 세척하고 필수 용지를 최소화하고 다시 흡인한다.
- 부드럽게 5 mL 세로지피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크의 하단 모서리에 단계 1.2.1에서 형체 혼합 (3 mL)을 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 기울여 세포 배양 플라스크에 걸쳐 트랜스퍼션 믹스를 고르게 분배하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 셀 단층층을 방해하지 않도록 하십시오. 10분 간 인큐베이션 후 R10 미디어 35mL을 추가하고 24시간 동안 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다.
- 24시간 후, HEK293T 세포 배양물에서 상체를 수집하고 50mL 원추형 튜브로 이송한다. HEK29T 세포에 신선한 R10을 추가하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 24h를 더 합니다. 상체(300 x g)를 회전하여 세포 이물질을 제거하고 0.45 μm 필터를 통해 상퍼를 필터링합니다.
- 초원심분리(25,000 x g~2.5h 또는 8000 x g 하룻밤(O/N)로 1.3단계에서 여과물을 농축한다. 48h 바이러스를 풀링하는 동안 24h 바이러스 펠릿을 4°C에 저장합니다.
- 48h 컬렉션에 대해 1.3-1.4단계를 반복하고 24h 및 48h 바이러스 컬렉션을 결합합니다. 48h 컬렉션의 펠릿은 렌티바이러스의 결합된 수확을 포함합니다.
- 약 1mL의 차가운 R10및 알리코에 바이러스 성 펠릿을 100 μL 바이알로 재보펜합니다. 즉시 드라이 아이스를 사용하여 알리쿼트를 얼리고 -80 °C에 보관하십시오.
- 렌티바이러스 상체의 직렬 희석으로 고정량의 CD3/CD28 비드 활성화 1차 인간 T세포를 변환하여 변환 단위/mL에서 기능성 바이러스 성 티터를 계산합니다. 유동 세포측정에 의해 72시간 후에 CAR-Transctionction을 측정합니다.
- 안티 FCM63 scFv 항체를 가진 CD19 지향 CAR용 스테인. 다른 키메라 항원 수용체의 경우, 불소호레 표지된 재조합 단백질을 사용한 얼룩이 CAR scFv에 특이적이다. 유동 세포측정에 의해 20% 이하의 CAR 양성 세포를 생성하는 바이러스 희석은 바이러스 성 티터를 계산하는 가장 정확한 희석이다. 20% 이상의 CAR 양성 세포, 각 양성 세포에 대 한 기회는 두 번 증가 증가, 변환 입자의 수의 과소 평가 결과. mL당 변환 단위(TU/mL) =(X%CAR 양수 x 희석 인자)/(mL의 트랜스듀션 부피)를 계산합니다.
2. 1 차인간 T 세포에 있는 sgRNAs 및 유전자 중단의 디자인
- CRISPR sgRNA 설계
참고: 여러 서버와 프로그램이 대상별 sgRNA의 설계를 용이하게 합니다. 이 프로토콜에서 CRISPR sgRNA는 CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no) 및 브로드 연구소(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)의 gRNA 설계 포털을 사용하여 설계되었습니다.- 각 표적 유전자에 대해, 초기 코딩 엑슨 서열을 표적으로 하기 위하여 6 10sgRNA 서열을 디자인합니다.
참고: sgRNA는 높은 표적 효능과 낮은 표적 효능이 있어야 합니다. sgRNA 효능을 결정하기 위한 각 기계 학습 알고리즘은 약간 다르게 작동합니다. 따라서, 다중 sgRNA 설계 도구를 비교하고 스크리닝을 위해 6-10 sgRNA 목록을 큐레이팅하는 것이 좋습니다.
- 각 표적 유전자에 대해, 초기 코딩 엑슨 서열을 표적으로 하기 위하여 6 10sgRNA 서열을 디자인합니다.
- 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 중단
- 건강한 자원 봉사 기증자로부터 자가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC's)를 얻습니다. 프로토콜의 회로도 타임라인은 도 2A에 설명되어 있으며 아래에 설명되어 있습니다.
- CD4+ 및 CD8+ T 셀을 시판 가능한 CD4 및 CD8 선택 키트를 사용하여 분리합니다.
- CD4+와 CD8+ T 셀을 1:1 비율로 결합하고 R10의 3x106 셀 /mL에서 하룻밤 동안 배양하여 5 ng / mL huIL-7 및 huIL-15로 보충합니다. IL-7 및 IL-15의 첨가는 IL-7 및 IL-15로 확장된 중앙 메모리 표현형 및 CAR-T 세포를 촉진하는 것으로 알려져 있기 때문에 IL-2 확장된 CAR-T 세포22,23,24에비해 우수한 항종양 효능을 갖는 것이 좋습니다.
- 다음 날, T 세포와 원심분리기를 5-10 x 106 셀에 300 x g에서 5 분 동안 계산합니다. 모든 상류체를 버리고 셀 펠릿을 최소한의 필수 매체로 씻어 내십시오. 제조업체의지침(재료 표)에따라 핵형성 용액의 100μL에서 펠릿을 재연한다.
- 세포를 세척하는 동안, 실온에서 10 분 동안 SgRNA의 5 μg와 Cas9 뉴클레아제의 10 μg를 배양하여 Cas9 및 gRNA와 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체를 준비합니다(RT). Cas9 ~ sgRNA의 어금니 비율은 1:2.4이다. Cas9 및 전기 포기 증강을 포함 하지만 sgRNA를 포함 하는 모의 컨트롤을 권장 합니다.
참고: 멀티플렉스 유전자 편집은 각 표적에 대한 RNP 복합체를 개별적으로 만들고 다음 단계에서 설명한 바와 같이 핵혈과 동시에 세포를 결합함으로써 이 단계에서 수행될 수 있다. RNP 컴플렉스를 조립할 시약을 선택하는 것이 KO 효율을 높이는 열쇠입니다. 예를 들어, 상이한 공급업체로부터의 Cas9 뉴클레아제는 표적 에 대한 다양한 효과를 가지며 화학적으로 변형된 gRNA는 T 세포에 대한 독성을 감소시켜 KO 효율을 증가시킨다. - 2.2.5단계에서 RNP 복합체와 2.2.4단계에서 재중단된 세포를 결합하고 4μM 전기기 증강제(인간 게놈에 비동형인 sDNA 올리고뉴클레오티드)의 4.2 μL을 추가한다. 잘 섞어서 전기기공 큐벳으로 옮춥니까. 전기기 효율을 손상시키면서 기포를 피하십시오.
- 펄스 코드 EH111을 사용하여 전기 전극 세포. 전기포기 후 R10의 인큐베이션 셀은 5ng/mL huIL-7 및 huIL-15에서 5x106 셀/mL에서 30°C에서 12웰 플레이트에서 48h로 보충하였다. 48h 후, T 세포 활성화 및 확장을 진행합니다.
3. T 세포 활성화, 렌티바이러스 트랜스듀션 및 확장
참고: 스크리닝 sgRNA의 경우 CAR 구조의 렌티바이러스 트랜스듀션(3.2단계)이 필요하지 않습니다.
- 전화 된 T 세포를 카운트하고 5 ng / mL huIL-7 및 huIL-15로 보충 된 따뜻한 R10을 사용하여 1 x 106 셀 /mL의 농도로 희석하십시오. 살아있는 T 세포 당 3 구슬의 비율로 항 CD3/안티 CD28 단클론 항체 코팅 자기 구슬을 추가하여 세포를 활성화합니다.
참고: 전기기는 비 전극 세포에 비해 약 60% ± 15%의 실행 가능한 세포를 초래하는 중요한 세포 죽음을 일으킵니다. 라이브/데드 셀 카운트를 사용하여 적절한 양의 구슬을 결정합니다. 세포를 37°C로 옮기고 하룻밤 동안 배양합니다. - 하룻밤 자극 후, 1 단계에서 렌티 바이러스 상수와 CRISPR 설계 T 세포를 변환합니다. 37°C에서 72h에 대한 감염(MOI)의 복합성을 달성하기 위해 1.7단계에서 계산된 바이러스 성 티터를 기반으로 적절한 부피를 첨가한다.
참고: R10에서 재중단된 바이러스 펠릿은 세포 농도, 바이러스 성 티터 및 원하는 MOI에 따라 세포 위에 간단하게 첨가됩니다. - 72h 후, 현재 배양부 R10의 50%를 공급하여 10ng/mL huIL-7 및 huIL-15를 함유하고 또 다른 48h를 위해 인큐베이터로 돌려보도록 한다. T 셀과 구슬 사이에 형성된 클러스터를 방해하지 마십시오.
- 48h 후, 세포 비드 혼합물을 부드럽게 다시 한 다음 자기 분리를 하여 세포로부터 구슬을 제거한다. 비드 제거 후 세포를 카운트하고 5 ng /mL huIL-7 및 huIL-15로 보충 R10을 사용하여 0.8 x 106 세포 / mL의 농도를 가져옵니다. 구슬 제거 후, 세포 수는 전기 포기전에 1 일째에 세포 수와 유사해야한다(도 2B).
- 24 시간 후, 세포를 카운트 및 R10 + 5 ng / mL huIL-7 및 huIL-15와 1 x 106 세포 / mL의 농도로 공급. 성장 운동학및 세포 크기가 세포가 자극에서 쉬었다는 것을 보여줄 때까지 매 24 시간마다 이것을 반복합니다.
참고: 이 시점에서 T 세포는 약 24시간마다 두 배입니다. T 세포는 일반적으로 5-7 인구 두 배로 겪고 약 300 ± 50 fL의 세포 부피를 휴식 할 때. - 일단 휴식을 취하면 CRISPR에서 설계된 CAR-T 세포를 스핀 다운하고 동결 매체 (1:1 X-Vivo 및 FBS + 10 % DMSO)에서 냉동 보존을 위해 재차 중단하십시오. 사용된 CAR-T 세포는 실험 전에 16시간 동안 37°C에서 해동및 쉬어야 한다.
참고: 녹아웃 효율 및 CAR 통합을 측정하기 위해 예약된 약 10x106 셀을 보관하십시오. 확장 기간 동안 예상되는 인구 두 배와 볼륨 변화가 그림 2B,2C에표시됩니다. 추가적으로, 도 2D는 목모와 유전자 편집된 CAR-T 세포 둘 다에 CAR 발현의 수준을 보여줍니다.
4. CRISPR 효율성
- 유전체 DNA 추출 및 표적 유전자 증폭
- 각 선별 배양에서 3-5 x 106 T 세포를 회전시하십시오. 세포는 마른 펠릿으로 동결될 수 있거나 게놈 DNA 추출을 진행할 수 있다. DNA 추출 시, 200μL의 인산염 완충식살린(PBS)에서 펠릿을 재연하고 제조업체 지침에 따라 표준 DNA 추출 키트를 사용하여 전기화 된 세포로부터 게놈 DNA를 추출한다.
- 간단히, 단백질 제 K와 하중 리세이드 세포는 DNA 결합 열에 lysate. 원심분리 하는 동안, DNA는 오염 물질이 통과하는 동안 막에 결합. 남은 오염 물질과 효소 억제제를 제거하기 위해 두 번의 세척 단계 후, 물 속에서 DNA를 엘로트하십시오.
- DNA 폴리머라제, 액세서리 단백질, 염 및 dNTP를 포함하는 표준 PCR 믹스를 사용하여 게놈 DNA의 200-300 ng를 증폭시키고 10 μM 앞으로 및 역 프라이머는 의도된 이중 가닥 브레이크 영역을 측면으로 합니다.
참고: PCR 프라이머 설계의 경우, gRNA 절단 부위를 측면으로 하는 기준 게놈 서열(http://www.ensemble.org 사용하여 찾을 수 있음)이 NCBI 프라이머 블라스트 툴(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)에 입력된다. PCR 프라이머는 앰플리턴이 600-700bp의 목표 크기를 가지고 있도록 설계되어야 합니다. 이 길이를 사용하면 gRNA 절단 부위(최소 150bp)에서 충분한 거리로 앰플리코 내에 결합하는 시퀀싱 프라이머를 설계하여 Cas9 유도 된 인델 주위의 좋은 시퀀싱 품질을 보장할 수 있습니다 (4.2.1 참조). 각 gRNA는 gRNA 절단 부위가 근접하지 않는 한 독특한 프라이머 쌍을 필요로 합니다. - 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품 전체를 실행하고 표준 아가로즈 젤 정화 키트를 사용하여 앰플리턴을 정화합니다.
참고: PCR에 대한 최적의 Tm을 결정하는 프로세스는 여러 차례의 문제 해결을 수행할 수 있습니다. 이는 KO 서열에 인델이 있고 표적 유전자는 일반적으로 100bp 의 인델이 없는 시퀀싱을 위해 준비되어야 하기 때문이다. 이는 비동형 최종 결합으로 인한 인델로 인해 크게 달라질 수 있습니다. 중첩 시퀀싱 프라이머를 PCR 프라이머에 설계하고 시퀀싱된 제품의 농도를 증가시켜 시퀀싱에 문제가 발생할 수 있습니다.
- 각 선별 배양에서 3-5 x 106 T 세포를 회전시하십시오. 세포는 마른 펠릿으로 동결될 수 있거나 게놈 DNA 추출을 진행할 수 있다. DNA 추출 시, 200μL의 인산염 완충식살린(PBS)에서 펠릿을 재연하고 제조업체 지침에 따라 표준 DNA 추출 키트를 사용하여 전기화 된 세포로부터 게놈 DNA를 추출한다.
- 시퀀싱 및 인델 감지
- 젤 정제 앰플리시온에 결합하고 Sanger 시퀀싱을 위해 모의 및 녹아웃 앰플리통을 보내는 시퀀싱 프라이머를 디자인합니다. 시퀀싱이 완료되면 TIDE 분석을 위해 추적 파일을 데스크톱 유전학 소프트웨어(tide.deskgen.com, 데스크톱 유전학)에 업로드합니다.
- 시퀀싱 프라이머 설계의 경우 PCR 앰플리코의 시퀀스를 표준 프라이머 설계 소프트웨어(NCBI, Eurofins 또는 기타 공개적으로 사용할 수 있는 도구)에 입력합니다. 설계 소프트웨어는 sanger 시퀀싱에 적합한 여러 프라이머 시퀀스를 제안합니다.
- gRNA 절단 부위의 상류 또는 하류에서 최소 150bp 이상 바인슬렉을 선택하고 역방향 프라이머를 선택하여 인델 주위의 좋은 시퀀싱 품질을 보장합니다. 시퀀싱 크로마토그램은 TIDE 분석을 위해 4.2에서 사용되므로 시퀀싱 품질이 정확한 인델 분해에 좋다는 것이 중요합니다(Hultquist 외 참조). 25.
- 조류(DEcomposition에 의한 인델추적) 분석을 사용하여 유전체레벨(26)에서노크(KO) 효율을 감지한다. 이 알고리즘은 시퀀스 추적에서 indels 스펙트럼을 정확하게 재구성하고 Tide 소프트웨어에 의한 음수 선형 모델링 후 적합도를 반영하여 R2 값을 계산합니다.
- 젤 정제 앰플리시온에 결합하고 Sanger 시퀀싱을 위해 모의 및 녹아웃 앰플리통을 보내는 시퀀싱 프라이머를 디자인합니다. 시퀀싱이 완료되면 TIDE 분석을 위해 추적 파일을 데스크톱 유전학 소프트웨어(tide.deskgen.com, 데스크톱 유전학)에 업로드합니다.
- 표적 단백질 검출
- T 세포의 표면에 유전자 생성물이 발현되는 표적 유전자의 경우, 표적 단백질에 특이적인 불소 크롬 태그 항체를 가진 각 선별 배양에서 약 1 x 105 세포를 얼룩지게 한다. 도 3A,3B에도시된 바와 같이 혈류 세포측정에 의한 모의 대조군과 녹아웃 그룹 간의 표적 단백질의 발현 수준을 비교한다.
- 유전자 생성물이 세포내발성으로 발현되는 표적 유전자의 경우, 리스 버퍼에서 스크리닝 그룹당 약 3 x106백만 개의 세포를 lyse하고 SDS-PAGE 및 서부 블로팅에 대한 표준 프로토콜을 따릅니다. 대안적으로, 표면 또는 세포내 유동 세포측정은 표적 단백질을 위해 프로브하기 위하여 이용될 수 있다.
5. iGUIDE를 사용하여 오프 타겟 효과 모니터링 - 라이브러리 준비, DNA 염기서열 분석 및 분석
참고 : iGUIDE 기술은 Cas9 유도 분열의 위치를 감지하고 DNA 이중 좌초 휴식의 분포를 정량화 할 수 있습니다.
- 노블스 등21에의해 설명 된 대로 iGUIDE를 수행 . iGUIDE 기술을 사용하여 TRAC 궤적을 표적으로 하는 sgRNA의 오프 타겟 효과는 슈타트마우어 외, 202013에서나타났다.
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Representative Results
우리는 여기에서 TCR 리디렉션T 세포뿐 아니라 자가 및 동종 CAR-T 세포를 둘 다 생성하는 데 사용할 수 있는 T 세포를 유전적으로 설계하는 프로토콜을 기술합니다.
도 1은 CRISPR 편집T 셀 제조 과정에 관련된 단계에 대한 자세한 설명을 제공한다. 이 과정은 관심 있는 유전자에 sgRNA를 설계하여 시작합니다. SgRNA가 설계되고 합성되면 적절한 Cas 단백질로 RNP 복합체를 만드는 데 사용됩니다. T 세포는 건강한 기증자 또는 환자 이혈수 및 RNP 복합체로부터 격리되어 전기기 또는 핵형성에 의해 전달됩니다. 사후 편집, T 세포는 CAR 또는 TCR 구조에 대한 렌티바이러스 벡터 코딩으로 활성화되고 변환된다. 활성화 후, T 세포는 배양에서 확장되고 향후 연구를 위해 냉동 보존됩니다. 실험실에서 수행된 상세한 프로토콜은 도 2에설명되어 있다. 확장 하는 동안, 인구 두 배로 및 볼륨 변경 프로토콜 에 걸쳐 추적 하 고 예제는 모의 및 편집 된 CAR-T 셀 모두에 대 한 그림 2B와 C에 표시 됩니다. 도 2B,C는 관심 유전자의 KO가 팽창 시 증식 및 활성화에 큰 변화를 일으키지 않았다는 것을 보여준다. 이러한 결과는, 그러나, 편집되는 표적 유전자에 의존하고 그러므로 증식 및 확장에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있고 아닐 수 있습니다.
세포가 극저온 보존되면, CAR 발현의 수준은 또한 추가 기능적 연구를 위해 결정됩니다. 이 경우 도 2D에 도시된 바와 같이, 우리는 모의 편집및 KO CAR-T 셀 모두에서 CD19 CAR 발현을 확인했으며, 큰 변화는 보이지 않았다. 이것은 다시 편집되는 관심의 유전자에 달려 있습니다. 마지막으로, KO 효율은 단백질 수준 검출을 위한 유동 세포질 및 서부 블롯과 같은 다중 기술을 이용하여 결정될 수 있고 또한 KO의 유전자 수준 검출을 위한 Sanger 시퀀싱을 할 수 있다. 도 3A 및 3B는 PDCD1 및 TRAC 궤적이 sgRNA를 사용하여 표적으로 하는 대표적인 유동 세포측정플롯을 보여주며, PDCD1 sgRNA의 경우 90%, TRAC sgRNA의 경우 여러 명의 건강한 기증자에 걸쳐 98%의 효율을 나타낸다. 따라서 이 프로토콜은 생존 가능성을 최소화하면서 고효율 녹아웃을 달성할 수 있습니다.
그림 1. CRISPR Cas9 기술을 사용하여 T 세포 편집 및 1 차 인간 CAR-T 세포의 제조를 보여주는 회로도 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 편집 된 CAR-T 세포와 인구 두 배의 확장. (A)1차 인간 카트 셀에서 CRISPR 편집 및 제조의타임라인. (B)모의 및 CRISPR에서 인구 두 배로 카-T 세포의 팽창 시 쿨터 카운터를 사용하여 측정된 CD19 CAR-T 세포(n=3 건강한 기증자; KO=녹아웃)(C)CELL 크기(μm3)CAR-T 세포의 팽창 시 쿨터 카운터를 이용하여 측정(n=3 건강한 기증자). (D)모의 및 편집된 CAR-T 세포 모두에서 CAR 발현을 보여주는 여러 기증자에서 CAR 염색 및 평균을 보여주는 대표적인 유동 세포 측정 플롯. CAR 발현은 불소로 피공및 림프구/싱글/라이브 셀(n=3 건강한 기증자, UTD=추론되지 않음)에 게이트된 항관용형 항체를 사용하여 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 유동 세포측정을 사용하여 편집된 CAR-T 셀에서 KO 효율을 특성화합니다. (A)대표적인 유동 세포측정플롯은 모의 및 편집된 CAR-T 세포에서 TRAC 궤적을 표적으로 하는 gRNA를 이용하여 PD-1 KO 효율을 나타내는 다중 기증자에서 PD-1 염색 및 평균을 나타내는 대표적인 흐름 세포측정플롯이다. PD-1 발현은 PD-1 항체(Clone EH12.2H7)를 사용하여 플루오로포어로 공주하고 림프구/싱글/라이브 셀(n=3 건강한 기증자)에 게이트됨을 검출하였다. 오류 막대는 평균± 표준 오류(SEM)를 나타냅니다. p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 웰치의 테스트에 의해. (B)대표적인 유동 세포측정플롯은 모의 및 편집된 CAR-T 세포에서 TRAC 궤적을 표적으로 하는 gRNA를 이용하여 CD3 KO 효율을 나타내는 다수의 기증자에서 CD3 염색 및 평균을 보여주는 대표적인 흐름 세포측정플롯이다. CD3 발현은 CD3 항체(Clone OKT3)를 사용하여 플루오로포어로 컨쥬게이징하고 림프구/싱글/라이브 세포(n=3 건강한 기증자)에 게이트됨을 검출하였다. 오류 막대는 평균± 표준 오류(SEM)를 나타냅니다. p<0.0001, *** p=0.0005, ** p=0.001 웰치의 테스트에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 CRISPR Cas9 기술을 사용하여 CAR-T 세포를 유전자 편집하고 기능과 효능을 더 테스트하기 위해 제품을 제조하는 접근법을 설명합니다. 상기 프로토콜은 키메라 항원 수용체를 가진 엔지니어링 T 세포와 결합된 1차 인간 T 세포에서 CRIPSR 유전자 편집을 수행하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 최소한의 기증자- 기증자- 기증자 가변성으로 높은 녹아웃 효율성을 허용합니다. CRISPR을 사용하여 수정은 T 세포 기능을 억제하는 수용체를 제거하고 동종 CAR-T 세포를 제조함으로써 CAR-T 세포의 효능과 안전성을 모두 향상시킬 수 있습니다.
소규모 확장 프로토콜의 경우, 그룹당106개의 세포로 시작하여 건강한 정상 기증자에서 평균6개의 인구가 두 배로 증가하는 약 5006개의 CAR-T 세포로 이어집니다. 그러나, 이것은 관심의 유전자가 T 세포 활성화, 변환 및 증식에 영향을 미치는 경우에 따라 달라질 수 있습니다. 5억 개의 세포가 KO 효율, 체외 분석은 및 생체 내 에세이를 확인하기에 충분합니다. CRISPR 편집이 활성화 전이나 후에 수행할 수 있는 프로토콜및 CAR-Transduction에 대한 변형이 다릅니다. Ren 외는 구슬 자극 및 CAR-Transduction15후에 세포가 편집되는 한 가지 변이를 설명하였다. 비드 자극 전에 CRISPR 편집의 장점은 T 세포가 아직 증식되지 않았기 때문에 더 낮은 세포 수량을 편집해야 하므로 시술의 시간이 더 많이 걸리고 비용 효율적입니다. 또한, 선행 편집을 수행하는 것은 클리닉으로 직접 번역할 수 있습니다. 사실, 이 프로토콜의 많은 단계는 벤치에서 침대 쪽으로 이동할 때 KO 효율의 일관성을 증가 시키는 진료소에서 채택될 수 있는 무슨에 의해 통보되었습니다.
프로토콜의 각 단계에서 선택할 수 있는 여러 변수가 있습니다. 예를 들어, T 세포는 전극 또는 뉴클레오감염될 수 있다. 둘 다 비교 가능한 KO 효율성을 달성하는 동안, 핵을 사용하는 우리의 경험에서 더 높은 생존 후 편집을 가지고 따라서 바람직하다. 그러나, 전기포레이터를 사용하면 장기적으로 더 비용 효율적인 것으로 판명될 수 있다. 이 두 장비는 소형 T 셀 확장에 사용됩니다. 대규모 및 임상 규모의 확장을 위해서는 편집을 수행하기 위해 프로토콜을 다시 최적화해야 하며 핵형성을 위한 다양한 장비가 필요합니다. 사용자의 요구에 따라 소규모 및 대규모 편집 및 확장에 사용할 수 있는 여러 기술 플랫폼이 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개가 없습니다.
Acknowledgments
우리는 펜실베니아 대학의 정상적인 기증자 T 세포와 흐름 세포 측정 코어를 제공하는 인간 면역학 코어를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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