Summary

إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR

Published: March 15, 2021
doi:

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.

Abstract

وقد أظهرت علاجات الخلايا بالتبني باستخدام مستقبلات مستضد الشميريك الخلايا التائية (CAR-T الخلايا) فعالية سريرية ملحوظة في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية ويجري حاليا التحقيق لمختلف الأورام الصلبة. يتم إنشاء خلايا CAR-T عن طريق إزالة الخلايا التائية من دم المريض وهندستها للتعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تعيد توجيه الخلايا التائية للتعرف على الخلايا السرطانية المستهدفة والقضاء عليها. تحرير الجينات من خلايا CAR-T لديه القدرة على تحسين سلامة العلاجات الحالية CAR-T الخلية وزيادة فعالية خلايا CAR-T. هنا، ونحن نصف أساليب لتنشيط وتوسيع وتوصيف البشرية CRISPR المهندسة CD19 موجهة CAR-T الخلايا. ويشمل ذلك نقل ناقل مكافحة الأمراض إلى جانب استخدام الحمض النووي الريبي الدليلي الوحيد (sgRNA) وCas9 endonuclease لاستهداف الجينات ذات الأهمية في الخلايا التائية. يمكن تطبيق الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول عالميا على بنيات CAR الأخرى واستهداف الجينات خارج تلك المستخدمة في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، يناقش هذا البروتوكول استراتيجيات لتصميم الحمض النووي الريبي، واختيار الحمض النووي الريبي الرصاص والتحقق من صحة خروج المغلوب الجينات المستهدفة لتحقيق استنساخ عالية الكفاءة، متعددة كريسبر-Cas9 الهندسة من الدرجة السريرية الخلايا التائية البشرية.

Introduction

أحدث العلاج بالخلايا الشيمية المضادة (CAR) -T ثورة في مجال علاجات الخلايا بالتبني والعلاج المناعي للسرطان. تم تصميم CAR-T-الخلايا التائية التعبير عن مستقبلات المناعة الاصطناعية التي تجمع بين مستضد محددة جزء الأجسام المضادة سلسلة واحدة مع مجالات الإشارات المستمدة من سلسلة TCRzeta والمجالات costimulatory اللازمة وكافية لتنشيط الخلايا التائية والتحفيز المشترك1،2،3،4 . تصنيع خلايا CAR-T يبدأ عن طريق استخراج الخلايا التائية الخاصة بالمريض، تليها تحويل فيروسي ex vivo من وحدة CAR وتوسيع منتج خلية CAR-T مع الخرز المغناطيسي الذي يعمل كمضاد اصطناعي يقدم الخلايا5. يتم إعادة غرس خلايا CAR-T الموسعة في المريض حيث يمكنهم الإصابة ، والقضاء على الخلايا السرطانية المستهدفة وحتى الاستمرار لعدة سنوات بعد التسريب6و7و8. على الرغم من أن العلاج بالخلايا CAR-T قد أدى إلى معدلات استجابة ملحوظة في الأورام الخبيثة B-الخلية, وقد تم تحدي النجاح السريري للأورام الصلبة من قبل عوامل متعددة بما في ذلك ضعف تسلل الخلايا التائية9, وبيئة دقيقة الورم المثبطة للمناعة10,تغطية مستضد وخصوصية, واختتلال وظيفي خلية CAR-T11,12 . وهناك قيد آخر للعلاج الحالي بالخلايا CAR-T يشمل استخدام الخلايا التائية الذاتية. بعد جولات متعددة من العلاج الكيميائي وارتفاع عبء الورم، يمكن أن تكون خلايا CAR-T ذات نوعية رديئة بالمقارنة مع منتجات CAR-T الذاتية من المتبرعين الأصحاء بالإضافة إلى الوقت والنفقات المرتبطة بتصنيع خلايا CAR-T الذاتية. يمثل تحرير الجينات لمنتج خلية CAR-T بواسطة CRISPR/Cas9 استراتيجية جديدة للتغلب على القيود الحالية لخلايا CAR-T13و14و15و16و17.

CRISPR/Cas9 هو نظام مكونين يمكن استخدامه لتحرير الجينوم المستهدف في خلايا الثدييات18،19. يمكن أن تحفز Cas9 المرتبطة ب CRISPR Endonuclease فواصل مزدوجة الخيط الخاصة بالموقع تسترشد بالرناسات الصغيرة من خلال الاقتران الأساسي مع تسلسل الحمض النووي المستهدف20. في حالة عدم وجود قالب إصلاح، يتم إصلاح فواصل مزدوجة حبلا من قبل الخطأ عرضة nonhomologous نهاية الانضمام (NHEJ) المسار، مما أدى إلى الطفرات frameshift أو codons وقف سابق لأوانه من خلال الطفرات الإدراج والحذف (INDELs)19،20،21. الكفاءة وسهولة الاستخدام وفعالية التكلفة والقدرة على تحرير الجينوم متعددة تجعل CRISPR / Cas9 أداة قوية لتعزيز فعالية وسلامة خلايا CAR-T ذاتية التشغيل ومتعددة التجانس. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لتحرير TCR توجيه الخلايا التائية عن طريق استبدال بناء CAR مع TCR. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تولد الخلايا الذاتية CAR-T التي لديها إمكانات محدودة للتسبب في الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف عن طريق تحرير الجينات TCR، b2m، وHLA الموضع.

في هذا البروتوكول، نعرض كيف يمكن الجمع بين هندسة CRISPR للخلايا التائية مع ناقل فيروسي بوساطة تسليم CAR-Transgene لتوليد منتجات خلايا CAR-T المحررة من الجينوم مع تعزيز الفعالية والسلامة. يظهر رسم تخطيطي للعملية بأكملها في الشكل 1. باستخدام هذا النهج، أظهرنا خروج المغلوب الجينات عالية الكفاءة في الخلايا الأساسية CAR-T الإنسان. يصف الشكل 2A بالتفصيل الجدول الزمني لكل خطوة لتحرير وتصنيع الخلايا التائية. كما تتم مناقشة استراتيجيات تصميم الحمض النووي الريبي دليل والتحقق من خروج المغلوب لتطبيق هذا النهج على الجينات المستهدفة المختلفة.

Protocol

تم شراء الخلايا التائية البشرية من خلال جامعة بنسلفانيا نواة المناعة البشرية، التي تعمل بموجب مبادئ الممارسة المختبرية الجيدة مع إجراءات التشغيل القياسية المعمول بها و / أو بروتوكولات لاستلام العينات، وتجهيزها، وتجميدها، وتحليلها وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية MIATA وجامعة بنسلفانيا.<…

Representative Results

نحن نصف هنا بروتوكولا للهندسة الوراثية للخلايا التائية ، التي يمكن استخدامها لتوليد كل من خلايا CAR-T الذاتية واللوججينية ، وكذلك الخلايا التائية المعاد توجيهها TCR. يقدم الشكل 1 وصفا مفصلا للمراحل التي تنطوي عليها عملية تصنيع الخلايا التائية المحررة من CRISPR. ت?…

Discussion

هنا نصف النهج لتحرير الجينات CAR-T الخلايا باستخدام التكنولوجيا CRISPR Cas9 وتصنيع المنتجات لمزيد من الاختبار لوظيفة وفعالية. تم تحسين البروتوكول أعلاه لأداء تحرير الجينات CRIPSR في الخلايا التائية البشرية الأولية جنبا إلى جنب مع الخلايا التائية الهندسية مع مستقبلات مستضد الشيمي. يسمح هذا البروت?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نعترف بنو المناعة البشرية لتوفير الخلايا التائية المانحة العادية وجوهر قياس التدفق الخلوي في جامعة بنسلفانيا.

Materials

4D-Nucleofactor Core Unit Lonza AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit Lonza AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix ThermoFisher 12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody Biolegend 317322 Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1 Biolegend Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers IDT 1075915
CD3/CD28 Dynabeads ThermoFisher 40203D
CD4+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15062
CD8+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle Corning 430768
Corning T150 cell culture flask Millipore Sigma CLS430825
DMSO Millipore Sigma D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504
DynaMag Magnet ThermoFisher 12321D
Glutamax supplement ThermoFisher 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEPES (1 M) ThermoFisher 15630080
huIL-15 PeproTech 200-15
huIL-7 PeproTech 200-07
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup Takara 740609.25
Opti-MEM ThermoFisher 31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L Lonza V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016
pTRPE expression Plasmid in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE CytoArt 200105
RPMI1640 ThermoFisher 12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9 Aldevron 9214
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 326823
Viral packaging mix in house
X-Vivo-15 Media Lonza BE02-060F

References

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).

Play Video

Cite This Article
Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (169), e62299, doi:10.3791/62299 (2021).

View Video