Summary

인간 CRISPR-엔지니어링 CAR-T 셀 생산

Published: March 15, 2021
doi:

Summary

여기서, 우리는 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 CRISPR Cas 기술을 사용하여 1 차적인 인간 T 세포에 있는 유전자 편집을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포)를 이용한 입양 세포 치료는 혈액학적 악성 종양 환자에서 놀라운 임상 효능을 입증했으며 현재 다양한 고형 종양에 대한 조사를 받고 있습니다. CAR-T 세포는 환자의 혈액에서 T 세포를 제거하고 표적 종양 세포를 인식하고 제거하기 위해 T 세포를 리디렉션합성 면역 수용체를 발현하도록 엔지니어링하여 생성됩니다. CAR-T 세포의 유전자 편집은 현재 CAR-T 세포 치료의 안전성을 개선하고 CAR-T 세포의 효능을 더욱 증가시킬 가능성이 있습니다. 여기에서는 인간 CRISPR 에서 설계한 CD19 지향 CAR-T 세포의 활성화, 확장 및 특성화에 대한 방법을 설명합니다. 이는 CAR 렌티바이러스 벡터의 트랜스듀션및 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 엔도누셀의 사용을 T 세포에 대한 관심있는 유전자를 표적으로 하는 것으로 구성된다. 이 프로토콜에 기술된 방법은 이 연구를 위해 사용된 것 이외에 그밖 CAR 구조 및 표적 유전자에 보편적으로 적용될 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 gRNA 설계를 위한 전략을, 리드 gRNA 선택 및 임상급 인간 T 세포의 고효율, 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 공학을 재현가능하게 달성하기 위한 표적 유전자 녹아웃 검증에 대해 설명합니다.

Introduction

키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포 치료제는 입양세포 치료 및 암 면역요법 분야에 혁명을 일으켰습니다. CAR-T 세포는 T-세포 활성화 및 공동 자극1,2,3,4에 필요한 TCRzeta 사슬 및 비용 발생 도메인에서 파생된 신호 도메인과 항원 특이적 단일 사슬 항체 단편을 결합하는 합성 면역 수용체를 발현하는 T-세포설계 . CAR-T 세포의 제조는 환자의 T 세포를 추출하는 것으로 시작하여 CAR 모듈의 전 생체 바이러스 성 트랜스포 변환 및 인공 항원 제시 세포로 작동하는 자기 구슬로 CAR-T 셀 제품의 확장에 선행된다5. 확장된 CAR-T 세포는 이식할 수 있는 환자로 재주입되어 표적 종양 세포를 제거하고 주입6,7,8까지다년간 지속된다. CAR-T 세포 치료는 B 세포 악성 종양에서 놀라운 반응률을 초래했지만, 고형 종양에 대한 임상 성공은 가난한 T 세포 침투9,면역 억제 종양 미세 환경10,항원 커버리지 및 특이성 및 CAR-T 세포 기능 장애11,12를 포함한 여러 요인에 의해 도전되었습니다. . 현재 CAR-T 세포 치료의 또 다른 제한은 자가 T 세포의 사용을 포함한다. 화학요법과 높은 종양 부담의 다발 후에, CAR-T 세포는 자가 CAR-T 세포의 제조와 관련되었던 시간 및 비용 이외에 건강한 기증자에서 동종 CAR-T 제품에 비해 나쁜 질일 수 있습니다. CRISPR/Cas9에 의한 CAR-T 세포 제품의 유전자편집은 CAR-T 세포13,14,15,16,17의현재 한계를 극복하기 위한 새로운 전략을 나타낸다.

CRISPR/Cas9는 포유류세포(18,19)에서표적 게놈 편집에 사용될 수 있는 2개의 성분 시스템이다. CRISPR-관련 엔도누블레스 Cas9은 표적 DNA서열(20)과염기 페어링을 통해 작은 RNA에 의해 유도된 사이트 별 이중 가닥 브레이크를 유도할 수 있다. 수리 템플릿이 없는 경우, 이중 가닥 파손은 오차경향이 있는 비homologous end 결합(NHEJ) 경로에 의해 수리되며, 삽입 및 삭제 돌연변이(INDELs)19,20,21을통해 프레임 시프트 돌연변이 또는 조기 정지 코돈의 결과로 된다. 효율성, 사용 용이성, 비용 효율성 및 멀티플렉스 게놈 편집 능력은 CRISPR/Cas9를 자가 및 동종 CAR-T 세포의 효능과 안전성을 향상시키는 강력한 도구입니다. 이 방법은 CAR 구조를 TCR로 대체하여 TCR 지시 T 셀을 편집하는 데도 사용할 수 있습니다. 또한, 숙주 질병 대 접목을 일으킬 수 있는 잠재력이 제한된 동종 CAR-T 세포는 또한 TCR, b2m 및 HLA 궤적을 편집하는 유전자에 의해 생성될 수 있다.

이 프로토콜에서, 우리는 T 세포의 CRISPR 공학이 향상된 효험과 안전성을 가진 게놈 편집 CAR-T 세포 제품을 생성하기 위하여 CAR-Transgene의 바이러스 벡터 매개 납품과 결합될 수 있는 방법을 보여줍니다. 전체 프로세스의 회로도도는 그림 1에표시됩니다. 이 접근을 사용하여, 우리는 1 차적인 인간 CAR-T 세포에 있는 고효율 유전자 녹아웃을 보여주었습니다. 그림 2A는 T 셀 편집 및 제조를 위한 각 단계의 타임라인을 자세히 설명합니다. 가이드 RNA 설계 및 녹아웃 검증을 위한 전략은 또한 각종 표적 유전자에 이 접근을 적용하기 위하여 토론됩니다.

Protocol

인간 T 세포는 펜실베니아 대학 인간 면역학 코어를 통해 조달되었으며, 이는 MIATA 및 펜실베니아 대학 윤리 지침에 부합하는 샘플 수령, 처리, 동결 및 분석을 위한 확립된 표준 운영 절차 및/또는 프로토콜을 갖춘 우수 실험실 실습의 원칙에 따라 운영됩니다. 1. 렌티바이러스 벡터 생산 참고: 바이러스 성 제품은 4 개의 별도 플라스미드로 포장 구조 (Rev, gag…

Representative Results

우리는 여기에서 TCR 리디렉션T 세포뿐 아니라 자가 및 동종 CAR-T 세포를 둘 다 생성하는 데 사용할 수 있는 T 세포를 유전적으로 설계하는 프로토콜을 기술합니다. 도 1은 CRISPR 편집T 셀 제조 과정에 관련된 단계에 대한 자세한 설명을 제공한다. 이 과정은 관심 있는 유전자에 sgRNA를 설계하여 시작합니다. SgRNA가 설계되고 합성되면 적절한 Cas 단백질로 RNP ?…

Discussion

여기에서 우리는 CRISPR Cas9 기술을 사용하여 CAR-T 세포를 유전자 편집하고 기능과 효능을 더 테스트하기 위해 제품을 제조하는 접근법을 설명합니다. 상기 프로토콜은 키메라 항원 수용체를 가진 엔지니어링 T 세포와 결합된 1차 인간 T 세포에서 CRIPSR 유전자 편집을 수행하기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 최소한의 기증자- 기증자- 기증자 가변성으로 높은 녹아웃 효율성을 허용합니다. CRI…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 펜실베니아 대학의 정상적인 기증자 T 세포와 흐름 세포 측정 코어를 제공하는 인간 면역학 코어를 인정합니다.

Materials

4D-Nucleofactor Core Unit Lonza AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit Lonza AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix ThermoFisher 12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody Biolegend 317322 Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1 Biolegend Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers IDT 1075915
CD3/CD28 Dynabeads ThermoFisher 40203D
CD4+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15062
CD8+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle Corning 430768
Corning T150 cell culture flask Millipore Sigma CLS430825
DMSO Millipore Sigma D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504
DynaMag Magnet ThermoFisher 12321D
Glutamax supplement ThermoFisher 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEPES (1 M) ThermoFisher 15630080
huIL-15 PeproTech 200-15
huIL-7 PeproTech 200-07
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup Takara 740609.25
Opti-MEM ThermoFisher 31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L Lonza V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016
pTRPE expression Plasmid in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE CytoArt 200105
RPMI1640 ThermoFisher 12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9 Aldevron 9214
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 326823
Viral packaging mix in house
X-Vivo-15 Media Lonza BE02-060F

References

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).

Play Video

Cite This Article
Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (169), e62299, doi:10.3791/62299 (2021).

View Video