Produksjon av humane CRISPR-konstruerte CAR-T-celler
Summary
Her presenterer vi en protokoll for genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjelp av CRISPR Cas Technology for å modifisere CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellebehandlinger ved hjelp av chimeric antigenreseptor T-celler (CAR-T-celler) har vist bemerkelsesverdig klinisk effekt hos pasienter med hematologiske maligniteter og blir for tiden undersøkt for ulike faste svulster. CAR-T-celler genereres ved å fjerne T-celler fra pasientens blod og konstruere dem for å uttrykke en syntetisk immunreseptor som omdirigerer T-cellene for å gjenkjenne og eliminere målsvulstceller. Genredigering av CAR-T-celler har potensial til å forbedre sikkerheten til dagens CAR-T-cellebehandlinger og ytterligere øke effekten av CAR-T-celler. Her beskriver vi metoder for aktivering, utvidelse og karakterisering av humane CRISPR-konstruerte CD19-styrte CAR-T-celler. Dette omfatter transduksjon av CAR lentiviral vektor og bruk av enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease å målrette gener av interesse i T-celler. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes universelt på andre CAR-konstruksjoner og målgener utover de som brukes til denne studien. Videre diskuterer denne protokollen strategier for gRNA-design, bly gRNA-seleksjon og målgen knockout validering for å reprodusere oppnå høy effektivitet, multipleks CRISPR-Cas9 engineering av klinisk klasse menneskelige T-celler.
Introduction
Chimeric antigen reseptor (CAR)-T celle terapi har revolusjonert feltet adoptivcelle terapier og kreft immunterapi. CAR-T-celler er konstruerte T-celler som uttrykker en syntetisk immunreseptor som kombinerer et antigenspesifikt enkeltkjedet antistofffragment med signaldomener avledet fra TCRzeta-kjeden og costimulatoriske domener som er nødvendige og tilstrekkelige for T-celleaktivering og kostimulering1,2,3,4 . Produksjonen av CAR-T-celler starter med å trekke ut pasientens egne T-celler, etterfulgt av ex vivo viral transduksjon av CAR-modulen og utvidelse av CAR-T-celleproduktet med magnetiske perler som fungerer som kunstig antigen som presenterer cellene5. Utvidede CAR-T-celler blir re-infundert til pasienten der de kan engraft, eliminere mål tumorceller og til og med vedvare i flere år etter infusjon6,7,8. Selv om CAR-T celleterapi har resultert i bemerkelsesverdige responsrater i B-celle maligniteter, klinisk suksess for faste svulster har blitt utfordret av flere faktorer, inkludert dårlig T-celle infiltrasjon9, en immundempende tumormikromiljø10, antigendekning og spesifisitet, og CAR-T celle dysfunksjon11,12 . En annen begrensning av nåværende CAR-T celleterapi inkluderer bruk av autologe T-celler. Etter flere runder med kjemoterapi og høy tumorbyrde, kan CAR-T-celler være av dårlig kvalitet sammenlignet med allogene CAR-T-produkter fra friske donorer i tillegg til tid og utgifter forbundet med produksjon av autologe CAR-T-celler. Genredigering av CAR-T-celleproduktet av CRISPR/Cas9 representerer en ny strategi for å overvinne gjeldende begrensninger i CAR-T-cellene13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 er et tokomponentsystem som kan brukes til målrettet genomredigering i pattedyrcelle18,19. CRISPR-assosiert endonuclease Cas9 kan indusere stedsspesifikke dobbeltstrengsbrudd styrt av små RNAer gjennom baseparing med mål-DNA-sekvensen20. I mangel av en reparasjonsmal repareres dobbeltstrengsskift av den feilutsatte banen for ikke-hjemmekoblende (NHEJ), noe som resulterer i frameshift-mutasjoner eller for tidlig stoppkokoner gjennom innsettings- og slettingsmutasjoner (INDELer)19,20,21. Effektivitet, brukervennlighet, kostnadseffektivitet og muligheten for multiks genomredigering gjør CRISPR/Cas9 til et kraftig verktøy for å forbedre effektiviteten og sikkerheten til autologe og allogene CAR-T-celler. Denne tilnærmingen kan også brukes til å redigere TCR-styrte T-celler ved å erstatte CAR-konstruksjonen med en TCR. I tillegg kan allogene CAR-T-celler som har begrenset potensial til å forårsake graft versus vertssykdom, også genereres ved genredigering av TCR-, b2m- og HLA-locus.
I denne protokollen viser vi hvordan CRISPR-engineering av T-celler kan kombineres med viral vektormediert levering av CAR-Transgene for å generere genom-redigerte CAR-T celleprodukter med forbedret effekt og sikkerhet. Et skjematisk diagram over hele prosessen vises i figur 1. Ved hjelp av denne tilnærmingen har vi demonstrert høyeffektiv gen knockout i primære menneskelige CAR-T celler. Figur 2A beskriver i detalj tidslinjen for hvert trinn for redigering og produksjon av T-celler. Strategier for guide RNA design og knockout validering diskuteres også for å anvende denne tilnærmingen til ulike målgener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi tilnærminger til genredigering av CAR-T-celler ved hjelp av CRISPR Cas9-teknologi og produserer produkter for ytterligere testing for funksjon og effekt. Ovennevnte protokoll er optimalisert for å utføre CRIPSR genredigering i primære menneskelige T-celler kombinert med tekniske T-celler med chimeriske antigenreseptorer. Denne protokollen gir høy knockout-effektivitet med minimal donor-til-donor-variasjon. Modifikasjon ved hjelp av CRISPR kan forbedre både effekt og sikkerhet av CAR-T celler ved å…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner Human Immunology Core for å gi normale donor T-celler og Flow Cytometry Core ved University of Pennsylvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
