Summary
דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.
Abstract
גליקוסאמינוגליקאנים גופרתיים (GAGs) כגון הפריאן סולפט (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) נמצאים בכל מקום באורגניזמים חיים וממלאים תפקיד קריטי במגוון מבנים ותהליכים ביולוגיים בסיסיים. כפולימרים, GAGs קיימים כתערובת פולידיספרס המכילה שרשראות פוליסכריד שיכולות לנוע בין 4000 Da ליותר מ -40,000 Da. בתוך שרשראות אלה קיימים תחומים של גופרית, המעניקים דפוס של מטען שלילי המאפשר אינטראקציה עם שאריות טעונות חיוביות של ליגנד חלבון קוגנייט. תחומים גופרתיים של GAGs חייב להיות באורך מספיק כדי לאפשר אינטראקציות אלקטרוסטטיות אלה. כדי להבין את הפונקציה של GAGs ברקמות ביולוגיות, החוקר חייב להיות מסוגל לבודד, לטהר, ולמדוד את הגודל של GAGs. דו"ח זה מתאר טכניקה מעשית ורב-תכליתית המבוססת על אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד שניתן למנף כדי לפתור הבדלים קטנים יחסית בגודל בין GAGs מבודדים ממגוון סוגי רקמות ביולוגיות.
Introduction
גליקוסאמינוגליקנס (GAGs) הם משפחה מגוונת של פוליסכרידים ליניאריים שהם יסוד בכל מקום באורגניזמים חיים ותורמים לתהליכים פיזיולוגיים בסיסיים רבים1. GAGs כגון הפריאן גופרתי (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) עשוי להיות גופרתי בעמדות שונות לאורך שרשרת הפוליסכריד, והענקת תחומים גיאוגרפיים של מטען שלילי. GAGs אלה, כאשר קשורים חלבונים פני התא המכונה proteoglycans, להקרין לתוך החלל החוץ תאי ונקשרים ליגנדים מודעים, המאפשר את הרגולציה של שני cis- (ליגנד מחובר לאותו תא) ו trans- (ליגנד מחובר לתא השכן) תהליכי איתות2. יתר על כן, GAGs גם לבצע תפקידים קריטיים כמו אלמנטים מבניים ברקמות כגוןקרוםהמרתף glomerular 3 , גליקוקליקס אנדותל וסקולרי4 וגליקוקליקס אפיתל ריאתי5, וברקמות חיבור כגון סחוס6.
אורך שרשראות הפוליסכריד GAG משתנה באופן משמעותי בהתאם להקשר הביולוגי שלה וניתן להאריך אותו באופן דינמי, לבקע ולשנותו על ידי מערכת רגולטורית אנזימטית מורכבת מאוד7. חשוב לציין, אורך שרשראות הפולימר GAG תורם באופן משמעותי לזיקתן המחייבת לליגנדים, ולאחר מכן לתפקוד הביולוגי שלהם8,9. מסיבה זו, קביעת הפונקציה של GAG אנדוגני דורש הערכה של גודלו. למרבה הצער, שלא כמו חלבונים וחומצות גרעין, מעט מאוד טכניקות זמינות קיימות כדי לזהות ולמדוד GAGs, אשר מבחינה היסטורית הביא חקירה מוגבלת יחסית לתוך התפקידים הביולוגיים של משפחת פוליסכריד מגוונת זו.
מאמר זה מתאר כיצד לבודד ולטהר GAGs מרוב הרקמות הביולוגיות, וגם, מתאר כיצד להשתמש אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) כדי להעריך את אורך הפולימרים המבודדים עם מידה לא מבוטלת של ספציפיות. בניגוד לגישות גליקומוניות אחרות, מורכבות מאוד (ולעתים קרובות מבוססות ספקטרומטריית מסה), ניתן להשתמש בשיטה זו באמצעות ציוד מעבדה וטכניקות סטנדרטיות. גישה מעשית זו עשויה, אם כן, להרחיב את יכולתם של החוקרים לקבוע את התפקיד הביולוגי של GAGs ילידים ואת האינטראקציה שלהם עם ליגנדים חשובים מבחינה הקשרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הדגימות הביולוגיות שניתחו בפרוטוקול זה התקבלו מעכברים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.
1. בידוד גופרתי של הפרין
- הזיון של דגימות רקמה
הערה: הזיון הוא צעד אופציונלי עבור רקמות עשירות בשומן.- הפוך תערובת 1:1 של מתנול ודיכלורומתאן. הכן כ 500 μL לדגימה; חתיכות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש עד 1 מ"ל.
- מניחים כל דגימת רקמה במיכל זכוכית קטן עם מכסה להזיות.
הערה: מסת המדגם עשויה להשתנות לכל רקמה של עניין וצרכים ניסיוניים. 50 מ"ג או פחות הוא בדרך כלל מספיק עבור תשואה GAG נאותה, אבל כמה אופטימיזציה עשויה להידרש על ידי משתמש הקצה. - הוסף 500 μL של פתרון מתנול:dichloromethane לכל מיכל זכוכית לערבב. ודא שכל דגימות הרקמה המוצקה שקועות לחלוטין בממס.
הערה: השתמש פיפטות סרולוגיות או צינורות חרוט פלסטיק לערבב ולטפל פתרון מתנול / דיכלורומתאן; פלסטיק אחר עלול להתמוסס. - מניחים דגימות על שייקר (בארון מאובטח) במכסה אדים כימי ומסעירים בעדינות למשך שעה אחת.
- תסעירו את הדגימות לערבב ולצנטריפוגה ב-17,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- בזהירות pipette את שבר ממס אורגני (supernatant). זהו שבר השומנים - הוא אינו מכיל GAGs וניתן להשליך אותו.
הערה: נסה לא להפריע לרקמה מכיוון שחלקים קטנים עלולים ללכת לאיבוד. עדיף להשאיר חלק מהשכבה האורגנית במיכל המדגם, במקום להסתכן באובדן המדגם. - השאירו את המכסה של מיכל הזכוכית פתוח ולתת לו להתאדות לילה בשכונה. לשנות את הצינור לשלב הבא כמו צינורות אלה לא ישרדו עיבוד נוסף.
- לאחר תערובת הממס התאדה לחלוטין, להמשיך התפוררות מכנית (אם מדגם שיורית הוא >50 מ"ג) או אקטינאז E העיכול (< 50 מ"ג).
- התפוררות מכנית של רקמה מוצקה (אופציונלי; עבור דגימות רקמה גדולות יותר)
הערה: רוב החלקים הקטנים יותר של רקמה מוצקה (כ 50 מ"ג או פחות) צריך להתמוסס לחלוטין במהלך שלב העיכול. עם זאת, דגימות גדולות יותר ידרשו התפוררות מכנית.- דגימות פלאש להקפיא עניין על ידי הצבת אותם בצינור פוליפרופילן בגודל מתאים והנחת הצינור הסגור לתוך חנקן נוזלי. אפשר לדגימה לקפוא עד מוצק לחלוטין.
- בעזרת מרגמה ועלי נקיים, טוחנים דגימות קפואות למרקם דמוי אבקה.
- המשך ישירות לעיכול אקטינאז E (שלב 1.4).
- התפלה וריכוז לדוגמה
הערה: זהו צעד אופציונלי ונדרש רק עבור דגימות רקמה נוזלית לדלל (למשל, נוזל שטיפה ברונכו-כתשית (BALF) או פלזמה).- דגימות נוזליות בריכה לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי)
- מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 3,000 Da.
- ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך אם אמצעי האחסון לדוגמה הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלית.
- לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL של deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
- הפוך את המסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x g בצינורות אוסף טריים, מתויג כראוי. להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
- אקטינאז E עיכול
הערה: שלב זה נדרש כדי לעכל ובסופו של דבר להסיר מזהמי חלבון מהדגימה שלך.- מערבבים דגימות 1:1 עם רקומביננטי Actinase E לריכוז הרצוי של 10 מ"ג /מ"ל. הוסף נפח מתאים של תרכיז מאגר עיכול פי 10. הריכוז הסופי הרצוי: 0.005 M סידן אצטט ו 0.01 M נתרן אצטט, pH 7.5. לדוגמה: 190 μL של מדגם נוזלי, 190 μL של 20 מ"ג / מ"ל אקטינאז E, 20 μL של 0.05 M סידן אצטט, 0.1 M נתרן אצטט.
- דגימות נסערות בעדינות לערבב, ולאחר מכן לעכל במשך 48-72 שעות ב 55 °C (עד 7 ימים עבור רקמה שלמה).
- מחממים ל-80°C במשך 15-20 דקות כדי לחמם את אקטינאז E.
- להקפיא את המדגם ב -80 °C (5 °F) או להמשיך שלב 1.5.
- התפלה וריכוז לדוגמה
הערה: אם מסה נמוכה של GAG של עניין צפוי במדגם הביולוגי, או אם שימור של ריאגנטים מתכלים (כלומר, עמודות מסנן צנטריפוגלי) רצוי, דגימות ניתן לאגד כדי לייצר תרכיז יחיד לכל קבוצה ניסיונית (למשל, על ידי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי).- מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
- ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך, אם נפח המדגם הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלי.
- לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
- הפוך מסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x g בצינורות איסוף טריים, מתויג כראוי (כלול בדרך כלל עם עמודות מסנן צנטריפוגלי). להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
- ייבוש
- או למקם את הדגימות מומסות בשלב 1.5.5 ברכז ואקום סיבובי לילה או ליופיל את הדגימות כמפורט להלן.
- להקפיא דגימות ביסודיות או לילה ב -80 °C (80 °F) או על ידי טבילה בחנקן נוזלי.
- פירס מכסה מדגם עם מחט 18 G ומניחים בתא הליופיליזר. יש להוסיף מגבות נייר לאריזה לפי הצורך.
- לתקן תא ליופיליזר ליופיליזר ולהקפיא יבש לילה (לפחות -40 °C (50 °F, 0.135 Torr)
- עמודת חילופי cation
- דגימות מיובשות resuspend ב עד 400 μL של 8 M urea, פתרון CHAPS 2% (או, אם דגימות איגום, resuspend למקסימום של (400/n) μL, שבו n = מספר הדגימות במאגר הרצוי. השתמש מעט ככל האפשר של פתרון דטרגנט ככל האפשר.
- שידוי העמודה חילופי cation (IEX) עם 400 μL של 8 M אוריאה, פתרון CHAPS 2%. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g בטמפרטורת החדר.
- טען 400 μL של דוגמאות לדוגמה/מקבצים במאגר לעמודה IEX. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g.
- לשטוף 3x עם 400 μL של 8 M אוריאה, 2% פתרון CHAPS. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g בכל פעם.
- Elute 3x עם 400 μL של 0.2 M NaCl. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g כל אחד. זהו שבר הזיקה הנמוכה - ניתן לשמור על כך למטרות בקרת איכות אם תרצה.
- Elute 3x עם 400 μL של 2.7 M (16%) NaCl. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g כל אחד. שבר זה יכיל את הגליקוזאמינוגליקנים המבודדים של עניין - שמור את כל זה!
- כדי להתפלת כל שבר מלוטש, להוסיף מתנול עד 80 וולט% ודגרה ב 4 °C (55 °F) לילה. ספין כל דגימה במשך 5 דקות ב 2,000 x g. לשחזר את שאריות מוצק כמו זה מיובש דה מלוח גליקוזאמינוגליקן.
הערה: לחלופין, דלג על שלב זה והמשיך לשלב 1.8 כדי להדיח את האלאט ללא מתנול.
- התפלה וריכוז לדוגמה
- במידת הצורך, הבריכה חמקה שברים (מ- 1.7.6) לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי).
- מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
- ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך, אם נפח המדגם הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלי.
- לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה. המשך ישירות לשלב 1.9.
- עיכול כונדרויטין
הערה: מטרת שלב זה היא להסיר GAGs לא עניין למשתמש הקצה. במקרה זה, כונדרויתינאז משמש להסרת כונדרויטין. ברקמות המשמשות ליצירת תוצאות מייצגות (נוזל שטיפה סימפונות-כתשי וריאה שלמה), עיכול כונדרויטין סולפט משאיר הפרין סולפט כשרידים העיקריים של GAG. משתמשי קצה ייתכן שיהיה צורך להוסיף צעדי עיכול נוספים בהתאם למטרות הניסיוניות שלהם.- טען 350 μL של חיץ העיכול (50 mM אמוניום אצטט עם 2 mM סידן כלורי מותאם pH 7.0) לעמוד מסנן צנטריפוגלי מבלי לגעת בממברנה.
- הוסף 5 μL של כונדרוינאז רקומביננטי ABC.
- מניחים את צינור הדגימות לתוך תנור 37 מעלות צלזיוס ודגורה במשך 1 שעה.
- הפוך את העמודה והצב לצינורות איסוף המסומנים כראוי. ספין במשך 1 דקות ב 2000 x g.
- מחממים דגימות ל 80 °C (55°F) במשך 15-20 דקות כדי לאימת כונדרוינאז ABC.
- התפלה וריכוז לדוגמה
- במידת הצורך, כונדרויטין הבריכה עיכל דגימות החל מהשלב 1.9.5 לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי)
- מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
- ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך אם נפח הדגימה הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלית.
- לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
- הפוך מסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x גרם בצינורות איסוף טריים, מתויג כראוי. להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
- ייבוש
הערה: בשלב זה, הייבוש נחוץ כך שניתן יהיה תוחם מחדש את הדגימות בכמות הקטנה ביותר האפשרית של מים ומאגר פועל.- או למקם את דגימות מעוכל כונדרויטין בשלב 1.10.5 ישירות ברכז ואקום סיבובי לילה או ליופילי כדלקמן:
- להקפיא דגימות ביסודיות או לילה ב -80 °C (80 °F) או על ידי טבילה בחנקן נוזלי.
- פירס מכסה מדגם עם מחט 18 G ומניחים בתא הליופיליזר. יש להוסיף מגבות נייר לאריזה לפי הצורך.
- לתקן תא ליופיליזר ליופיליזר ולהקפיא יבש לילה (לפחות 40 °C (40 °F, 0.135 Torr)
2. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד של גליקוזאמינוגליקאנים מבודדים ומטוהרים
- הכן פתרונות הדרושים לאלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) מראש(טבלה 1).
הערה: בחר את אחוז אקרילאמיד של פתרון ג'ל פתרון בהתאם לגודל של glycosaminoglycans צפוי להיות במדגם. 15% מומלץ לפתרון מקטעים גדולים יותר (אורך של יותר מ- 30 פריטים לא-פריטים); 22% עבור קטעים קטנים יותר (<20 יחידות משנה מפורקות). - מקם קלטת ריקה במיכל PAGE. להטיל את הג'ל פתרון כדלקמן: בצינור 15 מ"ל, לערבב 10 מ"ל של פתרון ג'ל פתרון פתרון, 60 μL של 10% אמוניום אסולפט (חייב להיות מוכן טרי), ו 10 μL של TEMED (להוסיף TEMED אחרון). הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש ב- pipette כדי להוסיף במהירות את פתרון 10 מ"ל לעיל לקלטת. כיסוי עם 2 מ"ל של מים מסוננים ומסוננים ומאפשרים לג'ל פתרון לפולימר במשך 30 דקות.
הערה: פרוטוקול PAGE הבא עבר מיטוב למערכת PAGE אנכית באמצעות קלטות יציקה בעובי של כ- 13.3 x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך) בעובי 1.0 מ"מ עם נפח כולל של כ- 12 מ"ל. ניתן להשתמש במערכות קלטות אחרות אך עשויות לדרוש מיטוב על-ידי משתמש הקצה. - לאחר הג'ל לפתרון יש פולימר מלא, להשליך את המים overlaid ולהטיל את ג'ל הערימה כדלקמן: בצינור 15 מ"ל, לערבב 3 מ"ל של פתרון ג'ל לערום, 90 μL של 10% אמוניום אסולפט (חייב להיות מוכן טרי), 3 μL של TEMED (להוסיף TEMED אחרון).
- הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש pipette כדי להוסיף במהירות את פתרון ג'ל לערום מעל ג'ל פתרון מוצק; מלא קלטת עד אפס מקום. הוסף מסרק מלא הכלול בגדר. אפשר ג'ל לערום פילמור במשך 30 דקות.
- לאחר שהג'ל הפך לפולימרי, ודאו שרצועת הקלטת מוסרת מתחתית הקלטת, והחזירו את הקלטת למכלול הטנק PAGE.
- מלאו את התאים העליונים והתחתונים במאגר התא העליון והתחתון, בהתאמה.
- ממיסים את הדגימות היבשות בשלב 1.11.4 בנפח המינימלי הדרוש של מים מסוננים דה-יונים (לכל היותר, 50% מנפח הבארות בג'ל PAGE). ערבבו 1:1 עם מאגר טעינה לדוגמה. טען את הדגימות ואת HS אוליגוסכריד "סולמות" (ראה טבלה 1)לתוך הג'ל.
- יש להפעיל מראש את הג'ל למשך 5 דקות ב-100 V. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 V במשך 20-25 דקות (עבור 15% ג'ל פתרון polyacrylamide), 40-50 דקות (עבור 18% ג'ל פתרון polyacrylamide), 90-100 דקות (עבור 22% ג'ל לפתרון polyacrylamide).
הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב מסוים של זמן הריצה של 200 V. פנול אדום נודד לפני הפרין אוליגוסכרידים כי הם 2 subunits פולימר אורך (כלומר, דרגת פילמור 2, או dp2); כחול ברומופנול נודד לפני dp10-dp14. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המתח מוחל כך הלהקה האדומה פנול נודד כמעט, אבל לא ממש, לתחתית הג'ל. התאם את זמן הריצה בהתאם.
3. פרוטוקול כתמי כסף
- הכן מראש את כל הפתרונות הדרושים להכתמת כסף(טבלה 2).
הערה: אין לגעת ישירות בג'ל הדף עד שהוא מוכתם, פותח ומונח בתמיסת עצירה. במקום זאת, לתפעל את הג'ל באמצעות כלי פלסטיק או זכוכית נקיים. טיפול ישיר בג'ל יגרום לעיוותים בהדפסת אצבע וממצאים גלויים אחרים על הג'ל לאחר הכתמתו. - לאחר השלמת הריצה, לפרק את הקסטה ולחלץ ג'ל במיכל נקי ובינוני-גדול מלא במים מסוננים.
הערה: כדי להימנע מטיפול ישיר בג'ל, השתמש בקצה פיפטה או בחפץ פלסטיק אחר כדי לקלף בעדינות את הג'ל מהקלטת בזמן שהוא שקוע במים. ג'ל עשוי להיות שביר - לטפל בזהירות.- זרוק את המים. מכתימים את הג'ל בתמיסת הכתמים הכחולה האלקית למשך 5 דקות.
- השלך כתם כחול אלקיאני. יש לשטוף/לשטוף/לשטוף במהירות 2-3x במים מסוננים ומסוננים עד להסרת רוב תמיסת הכתמים הכחולה האלקית.
- אפשר להתיר כתמים במים מסוננים דה-יוניזציה למשך הלילה על רוקר. ודאו שיש נפח רב של מים מסוננים ומסוננים כדי להבטיח שכל כתם שיורית יישטף לחלוטין מהג'ל למשך הלילה.
- ג'ל כביסה ב 50% מתנול (40 דקות בסך הכל, שינוי פתרון 2-3x).
- לשטוף ג'ל במים מסוננים deionized במשך 30 דקות. להשליך מים ולחזור על 3 זמן נוסף עבור סך של 2 שעות, החלפת המים בכל פעם.
- במיכל טרי ונקי, מכתימים את הג'ל במשך 30 דקות בתמיסת כתמי חנקות מכסף.
- שטפו/שטפו/שטפו במהירות 2-3x במים מסוננים ומסוננים כדי להסיר באופן מלא את תמיסת כתמי הכסף.
- לשטוף במשך 30 דקות במים מסוננים. להשליך מים ולחזור 2x במשך סך של 90 דקות, החלפת אמבט המים בכל פעם.
- להשליך מים ולהוסיף פתרון מתפתח.
- לאחר פיתוח פתרון מתווסף, בזהירות להתבונן ג'ל ולצפות את המראה של להקות. בהתאם לאיכות הכתם ומסת המדגם שנטען, הפיתוח יכול להימשך בין כמה שניות למספר דקות.
- ברגע הרצועות הרצויות גלויים, מיד להשליך פתרון פיתוח לשטוף לזמן קצר עם פתרון להפסיק.
- יש להשליך את שטיפת פתרון העצירה ולהחליף בתמיסת עצירה טרייה. אפשר להשרות במשך שעה על רוקר או שייקר.
- לשטוף במים מסוננים deionized לילה (עם זאת, הג'ל ניתן לדמיין מיד לאחר להפסיק לשטוף את הפתרון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כחול אלקי משמש להכתמת GAGs גופרית 10; אות זה מוגבר על ידי שימוש בכתם כסף 11לאחר מכן . איור 1 מספק הדגמה חזותית של תהליך פיתוח כתמי הכסף. כפי שהוכח, האות הכחול האלקי המייצג GAGs מופרדים על ידי אלקטרופורזה מוגבר כמו הסוכן המתפתח חודר ג'ל polyacrylamide. בדרך כלל, התהליך המתפתח יפחית את ה- GAGs מוכתמים בכחול כסף ואלקיאני בצורה תלוית צפיפות, כאשר הקצוות של כל רצועה מצטמצמים ראשונים בעוד שהאזורים הכתומים יותר בצפיפות במרכז יכתימו אחרונים.
בספרות, המגבלה המדווחת של זיהוי GAGs באמצעות גישות מבוססות PAGE נעה בין 0.5-1 מיקרוגרם12,13. כדי לקבוע את מגבלת הזיהוי באמצעות הגישה שלנו, אוליגוסכרידים הפרין סולפט של אורכי פולימר שונים (הפרין לא מופרך, dp20, dp10, dp6) הועמסו על ג'ל פוליאקרילמיד 22%, ואז רצו והכתימו כמתואר לעיל. כל אוליגוסכריד נטען פעמיים בשתי מסות שונות: 1.0 מיקרוגרם ו-0.5 מיקרוגרם. איור 2 מדגים שהטכניקה שלנו יכולה לזהות בקלות 0.5 מיקרוגרם של GAG מטוהר. ראוי לציין, הפרין unfractionated זוהה הכי פחות בקלות של ארבעת אוליגוסכרידים שונים נבדקו, ככל הנראה בשל התפלגות רחבה יותר של גדלי פולימר כי בהתאמה מפחית את הצפיפות של כל רצועה בודדת.
כדי להעריך את היעילות של טיהור GAG מדגימות ביולוגיות נוזליות, GAGs היו מבודדים משתי דגימות שטיפה סינכואלבולרי (BAL). כפי שמוצג באיור 3, המדגם הראשון שסומן כ- A המשמש לבידוד GAG היה 1 מ"ל של נוזל BAL שנקטף מעכבר 24 שעות לאחר ליפופוליסכריד תוך-אופן (LPS) (3 מ"ג/ק"ג), המנוהל כדי לגרום לשפוך HS אפיתל כשטפי 5. 10 מיקרוגרם של dp6 זמין מסחרית נוספה ישירות לנוזל BAL זה לשמש "ספייק ב" בקרה כדי להעריך אובדן של GAGs במהלך תהליך הבידוד. המדגם השני מסומן כ- B כלל 10 מ"ל של נוזל BAL מ-3 עכברים שקיבלו LPS תוך-ציוד (3 מ"ג/ק"ג) 24 שעות קודם לכן, ללא יתד-in EXOGENOUS GAG. שתי הדגימות עובדו לבידוד GAG בו זמנית, וכל שלושת השברים שנמשכו מעמודת חילופי היונים נשמרו ועובדו עוד יותר על מנת לקבוע אם כל GAGs היו נוכחים בשברים הזיקה והשטיפה הנמוכה. 2 מיקרוגרם של dp20, dp10 ו- dp6 אוליגוסכרידים המופרן גופרתיים נוהלו בג'ל הדף לצד דגימות אלה כדי לספק התייחסות שבאמצעותה ניתן להעריך באופן איכותי את גודלם של HS GAGs בכל שבר מרומם, כמו גם התייחסות להשוות צפיפות עם בקרת 10 מיקרוגרם "ספייק ב" כי עבר בידוד GAG.
כדי להדגים את השימוש בטכניקה זו על רקמה מוצקה, הפרין סולפט היה מבודד מחתיכת ריאה עכבר קפואה 15 מ"ג כמתואר לעיל. במהלך תהליך הבידוד והטיהור, שבר הזיקה הנמוך (0.2 M NaCl) שנעלה מעמודת חילופי היונים נשמר ועובד לצד שבר הזיקה הגבוהה (2.7 M NaCl) ורץ על הג'ל (איור 4). 2 מיקרוגרם של dp20, dp10 ו dp6 הפרין סולפט אוליגוסכרידים היו לרוץ לצד דגימות אלה כדי לספק התייחסות לגודל. כפי שניתן לראות, כל הומוגנט הריאה הניב כמות גדולה של HS מבודד, עם השברים הקטנים ביותר בערך שווה dp10 בגודל. ההעשרה היחסית של כתם כחול/כסף אלסיאנית בשבר NaCl של 2.7 M מדגימה כי הפרין סולפט נקשר עם זיקה גבוהה לעמודות חילופי היונים וניתן לחמוק מהטור עם ספציפיות גבוהה. הומוגנט הריאה כולו הניב כמות גדולה של גופרתי הפרין מבודד (שבר NaCl 2.7 M), עם השברים הקטנים ביותר בערך שווה dp10 בגודל.
איור 1: תהליך פיתוח כתמי כסף. כתמים כחולים אלקיאניים של הפרין לא מופרך (UFH) או אוליגוסכרידים המוגדרים בגודל (dp = מידת פילמור) המופרדים על ידי אלקטרופורזה מוגברת על ידי כתמי כסף. משמאל לימין: UFH, dp20, dp10, dp6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רגישות של ג'ל פוליאקרילמיד וכתם כסף לגילוי גופרתי הפריאן. הפרין המולפאט אוליגוסכרידים באורכים שונים (הפרין לא מופרך המכונה UFH, dp20, dp10, dp6) היו על ג'ל פוליאקרילמיד 22% ורץ וכסוף מוכתם. כל אוליגוסכריד נטען פעמיים בשתי מסות שונות: 1.0 מיקרוגרם (הרצועות השמאליות ביותר) ו -0.5 מיקרוגרם (הלהקות הימניות ביותר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יעילות טיהור GAG מדגימות ביולוגיות נוזליות. GAGs מבודדים משתי דגימות שטיפה סימפונות (BAL), המסומנות כאן כ-"A" ו-B, נוהלו על ג'ל פוליאקרילמיד 22% וכסוף מוכתם. מדגם A כלל 1mL של נוזל BAL שנקטף מעכבר 24 שעות לאחר טיפול עם 3 מ"ג/ קילוגרם ליפופוליסכריד תוך-רחמי (LPS). 10 מיקרוגרם נוסף של dp6 HS נוספו לדגימה זו כפקד "ספייק ב". מדגם B כלל 10 מ"ל של נוזל BAL מאוחסן שנאסף מ 3 עכברים 24 שעות לאחר מתן LPS. כל דגימה רצה לצד שברים מעמודת חילופי היונים שנרקמה עם דילול ("שטיפה") או ריכוזים נמוכים של NaCl (0.2 M). 2 מיקרוגרם של dp20, dp10 ו- dp6 אוליגוסכרידים המופלגים של הפרין סולפט שימשו כהפניות לגודל (הרצועות השמאליות ביותר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מדידת גודל הגופרית הפריאנית מבודדת ומטוהרת מריאה בריאה של עכבר. תוכן הפרין גופרתי מבודד ומטוהר מ-15 מ"ג דגימה קפואה של ריאה המבודדת מעכבר בריא ומופעלת על ג'ל פוליאקרילמיד 22%. הפריאן סולפט נעלה מטור חילופי היונים בריכוזים נמוכים (0.2 מ'; שבר זיקה נמוך) או בריכוזים גבוהים (2.7 מ', 16% פתרון; שבר זיקה גבוהה) של NaCl. 2 מיקרוגרם של dp20, dp10 ו- dp6 אוליגוסכרידים המופלגים של הפרין סולפט שימשו כהפניות לגודל (הרצועות השמאליות ביותר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הערה: יש לסנן את כל הפתרונות (0.22μm) לפני השימוש. | |||
| תמיסה | מתכון | הרכב | הערות |
| פתרון מאגר ריצה של ג'ל/תא תחתון (2 ליטר או 4 ליטר) | חומצה בורית, MW 61.83 | 2L: 12.36 גרם; 4L: 24.76 גרם | ריכוז רצוי: 0.1 M |
| בסיס טריס, MW 124.14 | 2L: 24.2 גרם; 4 ל': | ריכוז רצוי: 0.1 M | |
| דיסודיום EDTA MW 336.21 או דיהידרט, MW 372.36 | 2L: 6.7 גרם או 7.4 גרם, בהתאמה; 4L 13.4 גרם או 14.8 גרם, בהתאמה | ריכוז רצוי: 0.01 M | |
| מים דה-יוניזציה | 2L או 4L | כוונן את ה-pH ל-8.3 לאחר המסה מלאה של ריאגנטים | |
| מאגר ריצה בתא העליון (1 ליטר) | גליצין | 93 גרם | ריכוז רצוי: 1 M |
| בסיס טריס, MW 124.14 | 24.2 גרם | ריכוז רצוי: 0.2 M | |
| מים דה-יוניזציה | 1 ליטר | ||
| ג'ל לפתרון, 22% אקרילאמיד סה"כ (500 מ"ל) | אקרילאמיד, MW 71.08 | 100.1 גרם | ריכוז רצוי: 20.02% w/v |
| N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד (ביס, MW 154.17) | 10 גרם | ריכוז רצוי: 2% w/v | |
| סוכרוז | 75 גרם | ריכוז רצוי: 15% w/v | |
| פתרון מאגר ג'ל | 500 מ"ל | להביא לנפח כולל של 500mL; ידרוש פחות מ- 500 מ"ל של סה"כ מאגר | |
| ג'ל לפתרון, 15% אקרילאמיד סה"כ (400 מ"ל) | אקרילאמיד, MW 71.08 | 56.3 גרם | ריכוז רצוי: 14.08% w/v |
| N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד (ביס, MW 154.17) | 3.7 גרם | ריכוז רצוי: 2% w/v | |
| סוכרוז | 20.8 גרם | ריכוז רצוי: 15% w/v | |
| פתרון מאגר ג'ל | 400 מ"ל | להביא לנפח כולל של 400mL; ידרוש פחות מ- 400 מ"ל של סה"כ מאגר | |
| ג'ל לערום (100 מ"ל) | אקרילאמיד, MW 71.08 | 4.75 גרם | ריכוז רצוי: 4.75% w/v |
| N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד (ביס, MW 154.17) | 0.25 גרם | ריכוז רצוי: 0.25% w/v | |
| פתרון מאגר ג'ל | 100 מ"ל | הוסף חוצץ 80mL ותמיס ריאגנטים מלאים. לאחר מכן להתאים את ה- pH ל-76.3 עם חומצה הידרוכלורית, טיפה.. ואז להביא לנפח כולל של 100 מ"ל עם פתרון חוצץ ג'ל. | |
| מאגר טעינה לדוגמה (500 מ"ל) | סוכרוז | 250 גרם | ריכוז רצוי: 50% w/v |
| פנול אדום | 500 מ"ג | ריכוז רצוי: 1mg/mL | |
| כחול ברומופנול | 250 מ"ג | ריכוז רצוי: 0.5 מ"ג/מ"ל | |
| מים דה-יוניזציה | 500 מ"ל | להביא לנפח כולל של 500mL; יידרש פחות מ-500 מ"ל של מים בסך הכל | |
| הפרין נגזר אוליגוסכריד 'סולם' (2mL כל אחד) | dp6 | 0.1 מ"ג | הערה: ממליץ להשתמש אוליגוסכרידים שמקורם הפרין 6 subunits פולימר אורך (aka דרגה של פילמור 6, או dp6) עבור הרצועה הקטנה ביותר, dp20 עבור הלהקה הגדולה ביותר, ו dp10 עבור הלהקה האמצעית. עם זאת, שילובים אחרים ניתן להשתמש אם תרצה. ריכוז רצוי: 0.05 מ"ג/מ"ל |
| dp10 | 0.1 מ"ג | ||
| dp20 | 0.1 מ"ג | ||
| מים דה-יוניזציה | 3 מ"ל | ממיסים כל אוליגוסכריד בצינורות נפרדים עם 1 מ"ל כל אחד | |
| מאגר טעינה לדוגמה | 3 מ"ל | הוסיפו 1mL (1:1 תערובת) לכל פתרון אוליגוסכריד | |
טבלה 1: פתרונות הנדרשים עבור אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide של גליקוזאמינוגליקאנים מטוהרים. יש לסנן את כל הפתרונות (0.22 מיקרומטר) לפני השימוש.
| הערה: יש לסנן את כל הפתרונות (0.22μm) לפני השימוש. | |||
| תמיסה | מתכון | הרכב | הערות |
| פתרון כתמים כחולים אלקיאניים (500 מ"ל) | אבקת 8GX כחולה אלקית | 2.5 גרם | ריכוז רצוי: 0.5% w/v |
| 2% v/v חומצה אצטית קרחונית | 500 מ"ל | ||
| כתם כסף (200 מ"ל) | מים דה-יוניזציה | 192.7 מ"ל | הכן פתרון כתמים טרי; יש להשתמש בתוך שבוע. |
| 7.6M נתרן הידרוקסיד | 2 מ"ל | כדי להפוך, להוסיף 3.04 גרם כדורי נתרן הידרוקסיד ל 10 מ"ל מים | |
| אמוניום הידרוקסיד | 3.3 מ"ל | ||
| פתרון חנקתי מכסף 4M | 2 מ"ל | כדי להפוך, להוסיף 3.397 גרם כסף חנקתי למי 5 מ"ל. מוסיפים טיפה תוך כדי ערבוב כדי למנוע משקעים. | |
| פיתוח פתרון (501 מ"ל) | מים דה-יוניזציה | 500 מ"ל | הפתרון המתפתח חייב להיות טרי ולהשתמש בו תוך 24 שעות. |
| 2.5% חומצת לימון | 1 מ"ל | כדי להפוך, להוסיף 100 מ ג ל 4 מ"ל מים deionized. חומצת לימון חייבת להיות טרייה. | |
| פורמלדהיד | 250μL | ||
| פתרון עצירה (500 מ"ל) | מים דה-יוניזציה | 300 מ"ל | |
| חומצה אצטית קרחונית | 20 מ"ל | ||
| מתנול | 90 מ"ל | ||
טבלה 2: פתרונות הנדרשים להכתמת כסף של גליקוזאמינוגליקאנים המופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרלמיד. יש לסנן את כל הפתרונות (0.22 מיקרומטר) לפני השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לגאגים יש תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים ומגוונים. אחת הפונקציות העיקריות של GAGs גופרתי (כגון HS ו- CS) היא לקיים אינטראקציה עם ליגנדים ולאגד, אשר יכול לשנות פונקציות איתות במורד הזרם. גורם חשוב של זיקה מחייבת GAG לליגנדים מודעים הוא אורך שרשרת הפולימר GAG 8,9,14. מסיבה זו, חשוב לחוקרים להיות מסוגלים להגדיר בדיוק סביר את גודל שרשראות GAG מבודדות מדגימות ביולוגיות של עניין. כדי להיות מעשי, טכניקה זו צריכה להיות מסוגלת להתבצע באמצעות ציוד מעבדה משותף ריאגנטים.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד ולטהר GAGs מדגימות ביולוגיות, להפריד אותם לפי גודל באמצעות PAGE, ולהמחיש אותם באמצעות טכניקת כתמי כחול וכסף Alcian. אמנם ישנן מספר דרכים להפריד glycosaminoglycans לפי גודל, הגישה שלנו יש כמה עוצמות ספציפיות ליישום של טכניקה זו במעבדות מדעי החיים. ראשית, עם מגבלה של זיהוי של 0.5 מיקרוגרם, טכניקה זו רגישה מאוד בזיהוי GAGs של עניין. מניסיוננו, אפילו דגימות המכילות ריכוזים נמוכים יחסית של GAGs (כלומר, דגימות נוזל BAL) צריך להניב יותר ממספיק GAG לגילוי באמצעות שיטה זו. בעוד התשואה מבידוד וטיהור של נוזל BAL ישתנה לפי טכניקה ו- GAG ספציפי של עניין, זה היה הניסיון שלנו כי 10 מ"ל של נוזל BAL גלם מניב מספיק HS כדי להיות ניתן לזיהוי באמצעות טכניקה זו. התשואה מאיברים מוצקים גבוהה משמעותית, בהתאם לרקמה שנקטפת, אך הניסיון שלנו הוא כי מדגם מוצק ראשוני של 10 מ"ג יניב HS בשפע לגילוי באמצעות טכניקה זו.
חשוב לציין כי ההדמיה הסופית של ג'ל ה- PAGE המוכתם תשתנה בהתאם לטכנולוגיות ההדמיה העומדות לרשות משתמש הקצה. ניתן לצלם תמונות דיגיטליות של הג'ל באמצעות מספר מערכות שונות, כולל מערכות תיעוד ג'ל רבות הזמינות מסחרית או מצלמה מסחרית רגילה, בהתאם לציוד הזמין ולרגישות הזיהוי הנדרשת (בדרך כלל מוכתבת על ידי כמות הדגימה הנטענת על הג'ל). כמו כן יש לציין כי מקור האור הנדרש לתמונה דיגיטלית ג'ל זה עשוי להשתנות בהתאם לצפיפות המדגם ולכמות זמן הפיתוח הנדרש במהלך תהליך הכתמת. ג'לים המתפתחים במהירות ומייצרים רצועות מוכתמות בכסף הנראות לעין בלתי ידרשו טרנסיפלציות UV עבור התמונות הטובות ביותר, שכן רוב האור ייספג בכחול אלקיאני לא משוחזר. ג'לים הדורשים זמני פיתוח ארוכים יותר (כגון אלה עם כמויות קטנות מאוד של מדגם) ידרשו תאורת אפינפרין או טרנסילציה עם אור ספקטרום מלא רגיל, שכן זה יהיה נספג בצורה הטובה ביותר על ידי כתם הכסף.
חוזק נוסף של טכניקה זו הוא כי היא מותאמת במיוחד למעבדות מדעי החיים, בשל הבסיס שלה בטכנולוגיית PAGE פשוטה, באמצעות ציוד ריאגנטים כי הם זמינים בדרך כלל ונרכשו בזול. אמנם ישנן גישות אחרות לכמת את אורך פולימרים GAG מבודדים (למשל, אלקטרופורזה נימית), הם בדרך כלל דורשים גם ידע וגם ציוד שאינו זמין בדרך כלל ברוב מעבדות מדעי החיים15,16. הפשטות של גישה זו והאופי הזול והזמין יחסית של ריאגנטים הנדרשים הופכים טכניקה זו להתאמה בקלות על ידי חוקרי מדעי החיים המעוניינים ללמוד ביולוגיה של GAG בהקשר של שדות המשנה הנתונים להם. יתר על כן, טכניקה זו משמשת השלמה חיונית לטכניקות מבוססות ספקטרומטריית מסה של גילוי GAGs ברקמות ביולוגיות. בעוד גישות מבוססות ספקטרומטריית מסה מסוגלים לזהות GAGs עם רגישות גבוהה להבחין הבדלים עדינים במבנה מדגימות מורכבות17, בשל אופי הטכנולוגיה הוא אינו מסוגל להבחין בין פולימרים GAG לפי גודל. מסיבה זו, גישה מבוססת דף חיונית כדי divining הגודל של פולימרים HS בדגימות ביולוגיות של עניין.
חשוב לציין כי ישנן מספר מגבלות על הטכניקות המתוארות במאמר זה. הראשון והבולט ביותר הוא שבגלל אינטראקציית המטען-תשלום שהם מרכזיים בתגובת הכתמים הכחולה האלקית, גישה זו היא סלקטיבית מאוד עבור GAGs גופרתיים מאוד ורק תכתים חלש יותר moieties טעון יותר נייטרלי (למשל, חומצה היאלורונית18). לכן, טכניקה זו עשויה להטות את תוצאותיה כלפי moieties GAG חומצי יותר. מסיבה זו, יש להשתמש בגישות משלימות למדידת תוכן GAG בדגימות ביולוגיות של עניין (למשל, טכניקות מבוססות ספקטרומטריית מסה) בנספח כדי לספק תמונה מלאה יותר של ה- GAGs הנמצאים בדגימות ניסיוניות. יתר על כן, עבור משתמשי קצה המעוניינים במיוחד למדוד את גודל היאלורנן, אחרים תיארו טכניקות מבוססות PAGE דומות הממנפות חלבון מחייב חומצה היאלורונית ביוטינילית (HABP) אשר עשוי להיות מותאם לטכניקה הבסיסית המתוארת כאן19.
לסיכום, הטכניקה המוצגת במאמר זה יכולה לשמש כדי לבודד, לטהר ולזהות GAGs מדגימות ביולוגיות עם רגישות רבה וספציפיות, כמו גם כדי למדוד את האורך המקורי של שרשראות פוליסכריד אלה. מידע זה יכול להיות קריטי לבדיקת השערות על אינטראקציות GAG-ליגנד בשל החשיבות של אורך פולימר GAG בקביעת זיקה מחייבת ליגנד קוגנייט. לגישה זו יש מספר יתרונות, ובראשם הפשטות היחסית שלה והסתגלות למעבדות המחקר במדעי החיים, אם כי היא מוגבלת על ידי ההטיה היחסית שלה כלפי moieties GAG טעון שלילית. למרות חיסרון זה, טכניקה זו מייצגת כלי חזק שיעודד חוקרים לחקור את תפקידם של GAGs בהומיוסטזיס איברים ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ו- EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
