Summary
Dieser Bericht beschreibt Techniken zur Isolierung und Reinigung von sulfatierten Glykosaminoglykanen (GAGs) aus biologischen Proben und einen Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ansatz, um ihre Größe anzunähern. GAGs tragen zur Gewebestruktur bei und beeinflussen Signalprozesse durch elektrostatische Interaktion mit Proteinen. Die GAG-Polymerlänge trägt zu ihrer Bindungsaffinität für verwandte Liganden bei.
Abstract
Sulfatierte Glykosaminoglykane (GAGs) wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) sind in lebenden Organismen allgegenwärtig und spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl grundlegender biologischer Strukturen und Prozesse. Als Polymere existieren GAGs als polydisperse Mischung, die Polysaccharidketten enthält, die von 4000 Da bis weit über 40.000 Da reichen können. Innerhalb dieser Ketten existieren Domänen der Sulfatierung, die ein Muster negativer Ladung verleihen, das die Interaktion mit positiv geladenen Rückständen verwandter Proteinliganden erleichtert. Sulfatierte Domänen von GAGs müssen eine ausreichende Länge haben, um diese elektrostatischen Wechselwirkungen zu ermöglichen. Um die Funktion von GAGs in biologischen Geweben zu verstehen, muss der Prüfer in der Lage sein, die Größe von GAGs zu isolieren, zu reinigen und zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine praktische und vielseitige Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-basierte Technik, die genutzt werden kann, um relativ kleine Größenunterschiede zwischen GAGs zu lösen, die aus einer Vielzahl von biologischen Gewebetypen isoliert wurden.
Introduction
Glykosaminoglykane (GAGs) sind eine vielfältige Familie linearer Polysaccharide, die ein allgegenwärtiges Element in lebenden Organismen sind und zu vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beitragen1. GAGs wie Heparansulfat (HS) und Chondroitinsulfat (CS) können an verschiedenen Positionen entlang der Polysaccharidkette sulfatiert werden, wodurch geografische Domänen negativer Ladung entstehen. Diese GAGs, wenn sie an Zelloberflächenproteine gebunden sind, die als Proteoglykane bekannt sind, projizieren in den extrazellulären Raum und binden an verwandte Liganden, was die Regulation sowohl der cis- (Liganden, der an dieselbe Zelle gebunden ist) als auch der trans- (Liganden, die an benachbarte Zellen gebunden sind) Signalprozesse ermöglichen2. Darüber hinaus spielen GAGs auch eine kritische Rolle als Strukturelemente in Geweben wie der glomerulären Basalmembran3,dem vaskulären endothelialen Glycocalyx4 und dem pulmonalen epithelialen Glycocalyx5und in Bindegeweben wie Knorpel6.
Die Länge von GAG-Polysaccharidketten variiert je nach biologischem Kontext erheblich und kann durch ein hochkomplexes enzymatisches Regulationssystem dynamisch verlängert, gespalten und modifiziert werden7. Wichtig ist, dass die Länge der GAG-Polymerketten wesentlich zu ihrer Bindungsaffinität für Liganden und anschließend zu ihrer biologischen Funktion beiträgt8,9. Aus diesem Grund erfordert die Bestimmung der Funktion eines endogenen GAG eine Wertschätzung seiner Größe. Leider gibt es im Gegensatz zu Proteinen und Nukleinsäuren nur sehr wenige leicht verfügbare Techniken zum Nachweis und zur Messung von GAGs, was in der Vergangenheit zu einer relativ begrenzten Untersuchung der biologischen Rollen dieser vielfältigen Polysaccharidfamilie geführt hat.
Dieser Artikel beschreibt, wie GAGs aus den meisten biologischen Geweben isoliert und reinigt werden, und beschreibt auch, wie man Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verwendet, um die Länge der isolierten Polymere mit einem angemessenen Grad an Spezifität zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen, hochkomplexen (und oft massenspektrometrischen) glykomischen Ansätzen kann diese Methode mit Standardlaborgeräten und -techniken eingesetzt werden. Dieser praktische Ansatz könnte daher die Fähigkeit der Forscher erweitern, die biologische Rolle nativer GAGs und ihre Interaktion mit kontextuell wichtigen Liganden zu bestimmen.
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Protocol
Alle biologischen Proben, die in diesem Protokoll analysiert wurden, wurden von Mäusen gemäß Protokollen gewonnen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado genehmigt wurden.
1. Heparansulfat-Isolierung
- Delipidierung von Gewebeproben
HINWEIS: Die Delipidierung ist ein optionaler Schritt für fettreiche Gewebe.- Stellen Sie eine 1:1-Mischung aus Methanol und Dichlormethan zusammen. Bereiten Sie etwa 500 μL pro Probe vor; größere Gewebestücke können bis zu 1 ml benötigen.
- Legen Sie jede Gewebeprobe in einen kleinen Glasbehälter mit einem Deckel zur Entpissenbildung.
HINWEIS: Die Probenmasse kann je nach interessierendem Gewebe und experimentellem Bedarf variieren. 50 mg oder weniger sind in der Regel ausreichend für eine ausreichende GAG-Ausbeute, aber der Endbenutzer kann eine gewisse Optimierung erforderlich machen. - 500 μL der Methanol:Dichlormethan-Lösung in jeden Glasbehälter geben und mischen. Stellen Sie sicher, dass alle festen Gewebeproben vollständig in Lösungsmittel getaumt sind.
HINWEIS: Verwenden Sie serologische Pipetten oder konische Kunststoffröhrchen, um die Methanol/Dichlormethan-Lösung zu mischen und zu handhaben. andere Kunststoffe können sich auflösen. - Legen Sie die Proben auf einen Shaker (in gesichertem Gestell) in einem chemischen Abzug und rühren Sie 1 h lang sanft.
- Die Proben zum Mischen rühren und bei 17.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Pipetten Sie vorsichtig die organische Lösungsmittelfraktion (Überstand) aus. Dies ist die Lipidfraktion - sie enthält keine GAGs und kann verworfen werden.
HINWEIS: Versuchen Sie, das Gewebe nicht zu stören, da kleine Stücke verloren gehen könnten. Es ist vorzuziehen, einen Teil der organischen Schicht im Probenbehälter zu belassen, anstatt den Probenverlust zu riskieren. - Lassen Sie den Deckel des Glasbehälters offen und lassen Sie ihn über Nacht in der Haube verdampfen. Wechseln Sie das Rohr für den nächsten Schritt, da diese Rohre die weitere Verarbeitung nicht überleben.
- Sobald das Lösungsmittelgemisch vollständig verdampft ist, fahren Sie mit dem mechanischen Zerfall (wenn die Restprobe >50 mg beträgt) oder dem Actinase E-Aufschluss (< 50 mg) fort.
- Mechanischer Zerfall von festem Gewebe (optional; bei größeren Gewebeproben)
HINWEIS: Die meisten kleineren Stücke festen Gewebes (ca. 50 mg oder weniger) sollten sich während des Verdauungsschritts vollständig auflösen. Größere Proben erfordern jedoch eine mechanische Zersetzung.- Flash-Freeze-Proben von Interesse, indem Sie sie in ein entsprechend großes Polypropylenrohr legen und das geschlossene Röhrchen in flüssigen Stickstoff legen. Lassen Sie die Probe einfrieren, bis sie vollständig fest ist.
- Mit einem sauberen Mörser und Stößel gefrorene Proben zu einer pulverartigen Konsistenz mahlen.
- Fahren Sie direkt mit der Actinase E-Verdauung fort (Schritt 1.4).
- Entsalzung und Konzentration der Probe
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt und nur für verdünnte flüssige Gewebeproben (z. B. broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) oder Plasma) erforderlich.- Pool von flüssigen Proben in geeigneten experimentellen Gruppen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe)
- Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einer Molekulargewichtsabschaltung (MWCO) von 3.000 Da geben.
- 30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.
- Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen drehen. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Actinase E Verdauung
HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um Proteinverunreinigungen aus Ihrer Probe zu verdauen und letztendlich zu entfernen.- Mischen Sie die Proben 1:1 mit rekombinanter Actinase E auf eine gewünschte Konzentration von 10 mg/ml. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 10x Aufschlusspufferkonzentrat hinzu. Gewünschte Endkonzentration: 0,005 M Calciumacetat und 0,01 M Natriumacetat, pH 7,5. Zum Beispiel: 190 μL flüssige Probe, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M Calciumacetat, 0,1 M Natriumacetat.
- Rühren Sie die Proben sanft zum Mischen, dann verdauen Sie sie für 48-72 h bei 55 ° C (bis zu 7 Tage für das gesamte Gewebe).
- Auf 80 °C für 15-20 min erhitzen, um Actinase E zu inaktivieren.
- Frieren Sie die Probe bei -80 °C ein oder fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.
- Entsalzung und Konzentration der Probe
HINWEIS: Wenn eine geringe Masse des interessierenden GAG in der biologischen Probe erwartet wird oder wenn die Konservierung von verbrauchbaren Reagenzien (d. H. Zentrifugalfiltersäulen) wünschenswert ist, können Proben gepoolt werden, um ein einzelnes Konzentrat pro experimenteller Gruppe zu erzeugen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe).- Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da geben.
- 30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.
- Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen (in der Regel mit den Zentrifugalfiltersäulen enthalten) schleudern. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Austrocknung
- Entweder legen Sie die gelösten Proben aus Schritt 1.5.5 über Nacht in einen Rotationsvakuumkonzentrator oder lyophilisieren Sie die Proben wie unten beschrieben.
- Proben entweder über Nacht bei -80 °C oder durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gründlich einfrieren.
- Probendeckel mit einer 18 G Nadel durchstechen und in die Lyophilisatorkammer legen. Fügen Sie Papierhandtücher zum Verpacken nach Bedarf hinzu.
- Lyophilisatorkammer auf Lyophilisator fixieren und über Nacht gefriertrocken (mindestens -40 °C, 0,135 Torr)
- Kationenaustauschsäule
- Austrocknete Proben in bis zu 400 μL 8 M Harnstoff, 2% ige CHAPS-Lösung (oder, wenn Proben gepoolt werden, bis zu einem Maximum von (400/n) μL wiederverwenden, wobei n = die Anzahl der Proben im gewünschten Pool ist. Verwenden Sie so wenig wie möglich von der Reinigungslösung.
- Gleichsetzen Sie die Kationenaustauschsäule (IEX) mit 400 μL 8 M Harnstoff, 2% CHAPS-Lösung. 5 min bei 2.000 x g bei Raumtemperatur drehen.
- Laden Sie 400 μL Proben/gepoolte Proben in die IEX-Säule. 5 min bei 2.000 x g drehen.
- 3x mit 400 μL 8 M Harnstoff, 2% CHAPS-Lösung waschen. Drehen Sie für 5 Minuten bei 2.000 x g jedes Mal.
- Elute 3x mit 400 μL von 0,2 M NaCl. Spin für 5 min bei jeweils 2.000 x g. Dies ist der Anteil mit niedriger Affinität - dieser kann auf Wunsch für die Qualitätskontrolle beibehalten werden.
- Elute 3x mit 400 μL von 2,7 M (16%) NaCl. Spin für 5 min bei jeweils 2.000 x g. Diese Fraktion enthält die isolierten Glykosaminoglykane von Interesse - behalten Sie alles!
- Um jede eluierte Fraktion zu entsalzen, fügen Sie Methanol bis zu 80 Vol.-% hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C über Nacht. Drehen Sie jede Probe für 5 min bei 2.000 x g. Gewinnen Sie den festen Rückstand zurück, da dieser getrocknetes entsalztes Glykosaminoglykan ist.
HINWEIS: Alternativ überspringen Sie diesen Schritt und fahren Sie mit Schritt 1.8 fort, um das Eluat ohne Methanol zu entsalzen.
- Entsalzung und Konzentration der Probe
- Falls erforderlich, die eluierten Fraktionen (ab 1.7.6) in geeignete experimentelle Gruppen (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe) aufteilen.
- Das Gesamte Probenvolumen wird in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da geben.
- 30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.
- Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss. Fahren Sie direkt mit Schritt 1.9 fort.
- Chondroitin Verdauung
HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, GAGs zu entfernen, die für den Endbenutzer nicht von Interesse sind. In diesem Fall wird Chondroitinase verwendet, um Chondroitin zu entfernen. In den Geweben, die zur Erzeugung repräsentativer Ergebnisse (broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit und ganze Lunge) verwendet werden, hinterlässt die Verdauung von Chondroitinsulfat Heparansulfat als primären Rest-GAG. Endbenutzer müssen möglicherweise zusätzliche Verdauungsschritte hinzufügen, abhängig von ihren experimentellen Zielen.- Laden Sie 350 μL Aufschlusspuffer (50 mM Ammoniumacetat mit 2 mM Calciumchlorid eingestellt auf pH 7,0) in die Zentrifugalfiltersäule, ohne die Membran zu berühren.
- Fügen Sie 5 μL rekombinante Chondroitinase ABC hinzu.
- Das Probenröhrchen in einen 37 °C Backofen geben und 1 h inkubieren.
- Drehen Sie die Säule um und legen Sie sie in entsprechend beschriftete Auffangröhrchen. Spin für 1 min bei 2000 x g.
- Proben 15-20 min auf 80 °C erhitzen, um Chondroitinase ABC zu inaktivieren.
- Entsalzung und Konzentration der Probe
- Falls erforderlich, Chondroitin-Verdaute Proben aus Schritt 1.9.5 in geeigneten experimentellen Gruppen bündeln (z. B. durch biologische Replikation oder experimentelle Gruppe).
- Legen Sie das gesamte Probenvolumen in eine 500 μL Zentrifugalfiltersäule mit einem MWCO von 3.000 Da.
- 30 min bei 14.000 x g bei Raumtemperatur drehen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, wenn das gewünschte Probenvolumen die Kapazität der Zentrifugalfiltersäule überschreitet.
- Waschen Sie jede Säule 3x mit 400 μL entionisiertem, gefiltertem Wasser. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Filter umkehren und 1 min bei 2.000 x g in frischen, entsprechend beschrifteten Auffangröhrchen spinnen. Bei -80 °C einfrieren oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Austrocknung
HINWEIS: In diesem Schritt ist eine Austrocknung notwendig, damit Proben in möglichst kleiner Wassermenge und Laufpuffer wieder aufgewendet werden können.- Entweder legen Sie die Chondroitin-Verdautproben aus Schritt 1.10.5 über Nacht direkt in einen Rotationsvakuumkonzentrator oder lyophilisieren Sie wie folgt:
- Proben entweder über Nacht bei -80 °C oder durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gründlich einfrieren.
- Probendeckel mit einer 18 G Nadel durchstechen und in die Lyophilisatorkammer legen. Fügen Sie Papierhandtücher zum Verpacken nach Bedarf hinzu.
- Lyophilisatorkammer auf Lyophilisator fixieren und über Nacht gefriertrocken (mindestens 40 °C, 0,135 Torr)
2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese isolierter und gereinigter Glykosaminoglykane
- Bereiten Sie die für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 1).
HINWEIS: Wählen Sie den Prozentacrylamid der auflösenden Gellösung in Abhängigkeit von der Größe der Glykosaminoglykane, die voraussichtlich in der Probe sein werden. 15% wird für die Auflösung größerer Fragmente empfohlen (mehr als 30 Disaccharid-Untereinheiten in der Länge); 22% für kleinere Fragmente (<20 Disaccharid-Untereinheiten in der Länge). - Legen Sie die leere Kassette in den PAGE-Tank. Gießen Sie das auflösende Gel wie folgt: In 15 ml Röhrchen 10 ml auflösende Gellösung, 60 μL 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden) und 10 μL TEMED (TEMED zuletzt hinzufügen) mischen. 2-3x vorsichtig umkehren. Verwenden Sie die Pipette, um die oben genannte 10-ml-Lösung schnell zur Kassette hinzuzufügen. Mit 2 ml entionisiertem, gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 min polymerisieren lassen.
HINWEIS: Das folgende PAGE-Protokoll wurde für ein vertikales PAGE-System mit 13,3 x 8,7 cm (Breite x Länge) 1,0 mm dicken Gießkassetten mit einem Gesamtvolumen von ca. 12 ml optimiert. Andere Kassettensysteme können verwendet werden, müssen jedoch möglicherweise vom Endbenutzer optimiert werden. - Nachdem das auflösende Gel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser und werfen Sie das Stapelgel wie folgt aus: In einem 15-ml-Röhrchen 3 ml der Stapelgellösung, 90 μL 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden), 3 μL TEMED (TEMED zuletzt hinzufügen).
- 2-3x vorsichtig umkehren. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das erstarrte auflösende Gel hinzuzufügen. Kassette bis zur Krempe füllen. Vollständig im Lieferumfang des Setups enthaltener Kamm einsetzen. Lassen Sie das Stapelgel 30 Minuten polymerisieren.
- Sobald das Gel polymerisiert ist, stellen Sie sicher, dass der Bandstreifen vom Boden der Kassette entfernt wird, und legen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe.
- Füllen Sie die obere und untere Kammer mit einem oberen bzw. unteren Kammerpuffer.
- Die getrockneten Proben aus Schritt 1.11.4 werden in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem, gefiltertem Wasser (höchstens 50% des Volumens der Vertiefungen im PAGE-Gel) gelöst. Mischen Sie 1:1 mit Sample Loading Buffer. Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharid-"Leitern" (siehe Tabelle 1)in das Gel.
- Führen Sie das Gel 5 Minuten bei 100 V vor. Dann führen Sie das Gel bei 200 V für 20-25 min (für ein 15% Polyacrylamid auflösendes Gel), 40-50 min (für ein 18% Polyacrylamid auflösendes Gel), 90-100 min (für 22% Polyacrylamid auflösendes Gel).
HINWEIS: Eine gewisse Optimierung der 200 V Laufzeit kann erforderlich sein. Phenolrot wandert vor Heparin-Oligosacchariden, die 2 Polymeruntereinheiten in der Länge sind (dh Polymerisationsgrad 2 oder dp2); Bromphenolblau wandert vor dp10-dp14. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Spannung so angelegt wird, dass das phenolrote Band fast, aber nicht ganz, zum Boden des Gels wandert. Passen Sie die Laufzeit entsprechend an.
3. Silberfärbungsprotokoll
- Bereiten Sie alle für die Silberfärbung erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 2).
HINWEIS: Berühren Sie das PAGE-Gel erst direkt, wenn es gefärbt, entwickelt und in Stopplösung gelegt wurde. Manipulieren Sie stattdessen das Gel mit sauberen Kunststoff- oder Glaswerkzeugen. Die direkte Handhabung des Gels führt nach dem Färben zu Fingerabdruckverzerrungen und anderen sichtbaren Artefakten auf dem Gel. - Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel in einem sauberen, mittelgroßen Behälter, der mit entionisiertem, gefiltertem Wasser gefüllt ist.
HINWEIS: Um eine direkte Handhabung des Gels zu vermeiden, verwenden Sie die Pipettenspitze oder einen anderen Kunststoffgegenstand, um das Gel vorsichtig von der Kassette abzuziehen, während Sie in Wasser getaunken sind. Gel kann zerbrechlich sein - vorsichtig behandeln.- Entsorgen Sie das Wasser. Das Gel in Alcian blau färben Sie es für 5 min.
- Entsorgen Sie alcian blauen Fleck. Schnell 2-3x mit entionisiertem, gefiltertem Wasser abspülen/waschen, bis der größte Teil der alcianblauen Färbelösung entfernt wurde.
- In entionisiertem, gefilterten Wasser über Nacht auf der Wippe entfärben lassen. Stellen Sie sicher, dass ausreichend entionisiertes, gefiltertes Wasser vorhanden ist, um sicherzustellen, dass alle Restflecken über Nacht vollständig vom Gel abgewaschen werden.
- Waschgel in 50% Methanol (40 min insgesamt, Lösung 2-3x wechseln).
- Gel in entionisiertem, gefiltertem Wasser für 30 min waschen. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie 3 weitere Zeit für insgesamt 2 h, wobei Sie das Wasser jedes Mal ersetzen.
- In einem frischen, sauberen Behälter das Gel 30 min in Silbernitrat-Färbelösung einfärben.
- Schnell 2-3x in entionisiertem, gefiltertem Wasser abspülen/waschen, um die Silberfärbelösung vollständig zu entfernen.
- 30 min in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie es 2x für insgesamt 90 Minuten, wobei Sie das Wasserbad jedes Mal ersetzen.
- Entsorgen Sie Wasser und fügen Sie die Entwicklungslösung hinzu.
- Sobald die Entwicklungslösung hinzugefügt wurde, beobachten Sie das Gel sorgfältig und achten Sie auf das Auftreten von Bändern. Abhängig von der Qualität des Flecks und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung von wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten dauern.
- Sobald die gewünschten Bänder sichtbar sind, entsorgen Sie sofort die sich entwickelnde Lösung und waschen Sie sie kurz mit Derstopplösung.
- Entsorgen Sie die Stop-Lösungswäsche und ersetzen Sie sie durch frische Stop-Lösung. 1 h auf einer Wippe oder einem Shaker einweichen lassen.
- Über Nacht in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen (das Gel kann jedoch sofort nach dem Abwaschen der Stopplösung abgebildet werden).
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Representative Results
Alcianblau wird verwendet, um sulfatierte GAGs 10zu färben; Dieses Signal wird durch die Verwendung eines nachfolgenden Silberflecks 11verstärkt. Abbildung 1 zeigt eine visuelle Demonstration des Entwicklungsprozesses der Silberfärbung. Wie gezeigt, wird das alcianblaue Signal, das durch Elektrophorese getrennte GAGs darstellt, verstärkt, wenn das entwicklungsende Mittel in das Polyacrylamidgel eindringt. Typischerweise reduziert der Entwicklungsprozess silber- und alcianblaugefärbte GAGs in einer dichteabhängigen Weise, wobei die Kanten jedes Bandes zuerst reduziert werden, während die dichter färbenden Bereiche in der Mitte zuletzt flecken.
In der Literatur liegt die berichtete Nachweisgrenze von GAGs mit PAGE-basierten Ansätzen zwischen 0,5-1 μg12,13. Um die Nachweisgrenze mit unserem Ansatz zu bestimmen, wurden Heparansulfat-Oligosaccharide unterschiedlicher Polymerlängen (unfraktioniertes Heparin, dp20, dp10, dp6) auf ein 22% iges Polyacrylamidgel geladen, dann wie oben beschrieben ausgeführt und gefärbt. Jedes Oligosaccharid wurde zweimal mit zwei verschiedenen Massen geladen: 1,0 μg und 0,5 μg. Abbildung 2 zeigt, dass unsere Technik 0,5 μg gereinigtes GAG recht leicht nachweisen kann. Bemerkenswerterweise wurde unfraktioniertes Heparin von den vier verschiedenen getesteten Oligosacchariden am wenigsten leicht nachgewiesen, wahrscheinlich aufgrund einer breiteren Verteilung der Polymergrößen, die die Dichte jedes einzelnen Bandes entsprechend reduziert.
Um die Effizienz der GAG-Reinigung aus flüssigen biologischen Proben zu beurteilen, wurden GAGs aus zwei bronchoalveolären Lavage-Proben (BAL) isoliert. Wie in Abbildung 3gezeigt, war die erste Als A markierte Probe, die für die GAG-Isolierung verwendet wurde, 1 ml BAL-Flüssigkeit, die 24 Stunden nach intratrachealem Lipopolysaccharid (LPS) (3 mg/kg) von einer Maus entnommen wurde, um alveoläres epitheliales HS-Ausscheiden zu induzieren 5. 10 μg kommerziell erhältliches dp6 wurden direkt zu dieser BAL-Flüssigkeit hinzugefügt, um als "Spike-in"-Kontrolle zur Beurteilung des GaGsverlustes während des Isolationsprozesses zu dienen. Die zweite als B markierte Probe bestand aus 10 ml BAL-Flüssigkeit, die von 3 Mäusen gebündelt wurden, denen 24 Stunden zuvor intratracheales LPS (3 mg/kg) ohne exogenes GAG-Spike-in verabreicht wurde. Beide Proben wurden gleichzeitig für die GAG-Isolierung verarbeitet, und alle 3 Fraktionen, die aus der Ionenaustauschsäule eluiert wurden, wurden zurückgehalten und weiterverarbeitet, um festzustellen, ob GAGs in den niedrigaffinen und Waschfraktionen vorhanden waren. 2 μg kommerziell erworbene dp20-, dp10- und dp6-Heparansulfat-Oligosaccharide wurden im PAGE-Gel neben diesen Proben ausgeführt, um eine Referenz zur qualitativen Bewertung der Größe von HS-GAGs in jeder eluierten Fraktion sowie eine Referenz zum Vergleich der Dichte mit der 10 μg "Spike In" -Kontrolle zu liefern, die einer GAG-Isolierung unterzogen wurde.
Um die Anwendung dieser Technik auf festes Gewebe zu demonstrieren, wurde Heparansulfat aus einem 15 mg Stück gefrorener Mauslunge isoliert, wie oben beschrieben. Während des Isolations- und Reinigungsprozesses wurde die aus der Ionenaustauschsäule eluierte Niedrigaffinitätsfraktion (0,2 M NaCl) zurückgehalten und neben der hochaffinen (2,7 M NaCl) Fraktion verarbeitet und auf dem Gel laufen (Abbildung 4). 2 μg kommerziell erworbene dp20-, dp10- und dp6-Heparansulfat-Oligosaccharide wurden neben diesen Proben ausgeführt, um eine Referenz für die Größe zu liefern. Wie zu sehen ist, ergab das gesamte Lungenhomogenat eine ausreichende Menge an isoliertem HS, wobei die kleinsten Fragmente ungefähr der Größe von dp10 entsprachen. Die relative Anreicherung von Alcian Blau/Silber Flecken-Avid-GAGs in der 2,7 M NaCl-Fraktion zeigt, dass Heparansulfat mit hoher Affinität an die Ionenaustauschsäulen bindet und mit hoher Spezifität aus der Säule eluiert werden kann. Das gesamte Lungenhomogenat ergab eine ausreichende Menge an isoliertem Heparansulfat (2,7 M NaCl-Fraktion), wobei die kleinsten Fragmente ungefähr der Größe von dp10 entsprachen.
Abbildung 1:Entwicklungsprozess von Silberflecken. Die durch Elektrophorese getrennte Alkoblaufärbung von unfraktioniertem Heparin (UFH) oder größendefinierten Oligosacchariden (dp = Polymerisationsgrad) wird durch Silberfärbung verstärkt. Von links nach rechts: UFH, dp20, dp10, dp6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Empfindlichkeit von Polyacrylamidgel und Silberfleck zum Nachweis von Heparansulfat. Heparansulfat-Oligosaccharide unterschiedlicher Länge (unfraktioniertes Heparin aka UFH, dp20, dp10, dp6) wurden auf einem 22% igen Polyacrylamidgel und lief und silbergefärbt. Jedes Oligosaccharid wurde zweimal mit zwei verschiedenen Massen geladen: 1,0 μg (linke Bänder) und 0,5 μg (rechte Bänder). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Effizienz der GAG-Reinigung aus flüssigen biologischen Proben. GAGs, die aus zwei bronchoalveolären Lavageproben (BAL) isoliert wurden, die hier als "A" und "B" gekennzeichnet sind, wurden auf einem 22% igen Polyacrylamidgel und silbergefärbt ausgeführt. Probe A bestand aus 1 ml BAL-Flüssigkeit, die 24 Stunden nach der Behandlung mit 3 mg/kg intratrachealem Lipopolysaccharid (LPS) von einer Maus gewonnen wurde. Zusätzliche 10 μg dp6 HS wurden dieser Probe als "Spike-in"-Kontrolle hinzugefügt. Probe B bestand aus 10 ml gepoolter BAL-Flüssigkeit, die 24 Stunden nach Verabreichung von LPS von 3 Mäusen gesammelt wurden. Jede Probe wurde zusammen mit Fraktionen aus der Ionenaustauschsäule durchgeführt, die entweder mit Verdünnungsmittel ("Wash") oder niedrigen Konzentrationen von NaCl (0,2 M) eluiert wurden. 2 μg kommerziell erworbene dp20-, dp10- und dp6-Heparansulfat-Oligosaccharide wurden als Größenreferenzen verwendet (linke Bänder). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Messung der Größe von Heparansulfaten, die aus einer gesunden Mauslunge isoliert und gereinigt wurden. Heparinsulfatgehalt isoliert und gereinigt aus 15 mg gefrorener Probe einer Lunge, die von einer gesunden Maus isoliert wurde und mit einem 22% igen Polyacrylamidgel betrieben wird. Heparansulfat wurde aus der Ionenaustauschsäule mit entweder niedrigen Konzentrationen (0,2 M; niedrige Affinitätsfraktion) oder hohen Konzentrationen (2,7 M, 16% ige Lösung; hohe Affinitätsfraktion) von NaCl eluiert. 2 μg kommerziell erworbene dp20-, dp10- und dp6-Heparansulfat-Oligosaccharide wurden als Größenreferenzen verwendet (linke Bänder). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| HINWEIS: Alle Lösungen müssen vor Gebrauch gefiltert werden (0,22μm). | |||
| Lösung | Rezept | Zusammensetzung | Kommentare |
| Auflösender Gel-/Unterkammer-Laufpuffer (2 L oder 4 L) | Borsäure, MW 61,83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Gewünschte Konzentration: 0,1 M |
| Tris Basis, MW 124.14 | 2L: 24,2 g; 4L: | Gewünschte Konzentration: 0,1 M | |
| Esdium EDTA MW 336.21 oder Dihydrat, MW 372.36 | 2L: 6,7 g bzw. 7,4 g; 4L 13,4 g bzw. 14,8 g | Gewünschte Konzentration: 0,01 M | |
| Entionisiertes Wasser | 2L oder 4L | Stellen Sie den pH-Wert nach dem vollständigen Auflösen der Reagenzien auf 8,3 ein | |
| Oberkammer-Laufpuffer (1 L) | Glycin | 93 g | Gewünschte Konzentration: 1 M |
| Tris Basis, MW 124.14 | 24,2 g | Gewünschte Konzentration: 0,2 M | |
| Entionisiertes Wasser | 1 L | ||
| Auflösendes Gel, 22% Gesamtacrylamid (500 ml) | Acrylamid, MW 71,08 | 100,1 g | Gewünschte Konzentration: 20,02% w/v |
| N,N'-Methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154.17) | 10 g | Gewünschte Konzentration: 2% w/v | |
| Saccharose | 75 g | Gewünschte Konzentration: 15% w/v | |
| Auflösender Gelpuffer | 500 ml | Auf ein Gesamtvolumen von 500 ml bringen; benötigt weniger als 500 ml Puffersumme | |
| Auflösendes Gel, 15% Gesamtacrylamid (400 ml) | Acrylamid, MW 71,08 | 56,3 g | Gewünschte Konzentration: 14,08% w/v |
| N,N'-Methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Gewünschte Konzentration: 2% w/v | |
| Saccharose | 20,8 g | Gewünschte Konzentration: 15% w/v | |
| Auflösender Gelpuffer | 400 ml | Auf ein Gesamtvolumen von 400 ml bringen; benötigt weniger als 400 ml Puffersumme | |
| Stapelgel (100 ml) | Acrylamid, MW 71,08 | 4,75 g | Gewünschte Konzentration: 4,75% w/v |
| N,N'-Methylen-bis-acrylamid (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Gewünschte Konzentration: 0,25% w/v | |
| Auflösender Gelpuffer | 100 ml | Fügen Sie 80 ml Puffer hinzu und lösen Sie Reagenzien vollständig auf. Dann stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure tropfenweise auf 76,3 ein. Dann mit auflösendem Gelpuffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml bringen. | |
| Probenladepuffer (500 ml) | Saccharose | 250g | Gewünschte Konzentration: 50% w/v |
| Phenol rot | 500 mg | Gewünschte Konzentration: 1mg / ml | |
| Bromphenolblau | 250 mg | Gewünschte Konzentration: 0,5 mg / ml | |
| Entionisiertes Wasser | 500mL | Auf ein Gesamtvolumen von 500 ml bringen; benötigt insgesamt weniger als 500 ml Wasser | |
| Heparin-abgeleitete Oligosacharid-Leiter (jeweils 2 ml) | dp6 | 0,1 mg | HINWEIS: Empfehlen Sie die Verwendung von Heparin-abgeleiteten Oligosacchariden 6 Polymeruntereinheiten in der Länge (auch bekannt als Polymerisationsgrad 6 oder dp6) für das kleinste Band, dp20 für das größte Band und dp10 für das mittlere Band. Auf Wunsch können jedoch auch andere Kombinationen verwendet werden. Gewünschte Konzentration: 0,05 mg/ml |
| dp10 | 0,1 mg | ||
| dp20 | 0,1 mg | ||
| Entionisiertes Wasser | 3mL | Jedes Oligosaccharid in separaten Röhrchen mit je 1 ml auflösen | |
| Probenladepuffer | 3mL | 1 ml (1:1-Mischung) zu jeder Oligosaccharidlösung hinzufügen | |
Tabelle 1: Lösungen, die für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese von gereinigten Glykosaminoglykanen benötigt werden. Alle Lösungen müssen vor Gebrauch gefiltert werden (0,22 μm).
| HINWEIS: Alle Lösungen müssen vor Gebrauch gefiltert werden (0,22μm). | |||
| Lösung | Rezept | Zusammensetzung | Kommentare |
| Alcian blaue Färbelösung (500mL) | Alcian blau 8GX Pulver | 2,5 g | Gewünschte Konzentration: 0,5% w/v |
| 2% v/v Eisessigsäure | 500mL | ||
| Silberfleck (200 mL) | Entionisiertes Wasser | 192,7 ml | Bereiten Sie die Fleckenlösung frisch vor; innerhalb einer Woche verwenden. |
| 7,6 M Natriumhydroxid | 2 ml | Zur Herstellung 3,04 g Natriumhydroxidpellets zu 10 ml Wasser hinzufügen | |
| Ammoniakwasser | 3,3 ml | ||
| 4M Silbernitratlösung | 2 ml | Zur Herstellung 3.397 g Silbernitrat zu 5 mL Wasser geben. Unter Rühren tropfenweise hinzufügen, um Niederschlag zu vermeiden. | |
| Lösung entwickeln (501 ml) | Entionisiertes Wasser | 500 ml | Die Entwicklungslösung muss frisch gemacht und innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. |
| 2,5% w/v Zitronensäure | 1 ml | Um zu machen, fügen Sie 100mg zu 4 ml entionisiertem Wasser hinzu. Zitronensäure muss frisch gemacht werden. | |
| Formaldehyd | 250μL | ||
| Stop-Lösung (500 ml) | Entionisiertes Wasser | 300 ml | |
| Eisessig | 20 ml | ||
| Methanol | 90 ml | ||
Tabelle 2: Lösungen, die für die Silberfärbung von Glykosaminoglykanen erforderlich sind, die durch Polyacramid-Gelelektrophorese getrennt sind. Alle Lösungen müssen vor Gebrauch gefiltert werden (0,22 μm).
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Discussion
GAGs spielen eine zentrale Rolle in vielen verschiedenen biologischen Prozessen. Eine der Hauptfunktionen von sulfatierten GAGs (wie HS und CS) besteht darin, mit Liganden zu interagieren und an sie zu binden, was die nachgeschalteten Signalfunktionen verändern kann. Eine wichtige Determinante der GAG-Bindungsaffinität zu verwandten Liganden ist die Länge der GAG-Polymerkette 8,9,14. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Forscher die Größe der aus biologischen Proben von Interesse isolierten GAG-Ketten mit angemessener Genauigkeit definieren können. Um praktisch zu sein, sollte diese Technik mit gängigen Laborgeräten und Reagenzien durchgeführt werden können.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um GAGs aus biologischen Proben zu isolieren und zu reinigen, sie über PAGE nach Größe zu trennen und sie mit alcianblauer und silberner Färbetechnik zu visualisieren. Während es mehrere Möglichkeiten gibt, Glykosaminoglykane nach Größe zu trennen, hat unser Ansatz mehrere Stärken, die für die Anwendung dieser Technik in Life-Science-Labors spezifisch sind. Erstens ist diese Technik mit einer Nachweisgrenze von 0,5 μg sehr empfindlich bei der Detektion von GAGs von Interesse. Unserer Erfahrung nach sollten selbst Proben, die relativ geringe Konzentrationen von GAGs enthalten (d.h. BAL-Flüssigkeitsproben), mehr als genug GAG für den Nachweis mit dieser Methode liefern. Während die Ausbeute aus der Isolierung und Reinigung von BAL-Flüssigkeit je nach Technik und spezifischem GAG von Interesse variieren wird, haben wir die Erfahrung gemacht, dass 10 ml rohe BAL-Flüssigkeit genügend HS ergeben, um mit dieser Technik nachweisbar zu sein. Die Ausbeute aus festen Organen ist je nach entnommenem Gewebe wesentlich höher, aber es ist unsere Erfahrung, dass eine erste feste Probe von 10 mg ausreichend HS für den Nachweis mit dieser Technik liefert.
Es ist wichtig zu beachten, dass die endgültige Bildgebung des gefärbten PAGE-Gels je nach den bildgebungsähnlichen Technologien, die dem Endbenutzer zur Verfügung stehen, variiert. Digitale Fotos des Gels können mit einer Reihe verschiedener Systeme aufgenommen werden, darunter zahlreiche kommerziell erhältliche Geldokumentationssysteme oder eine normale kommerzielle Kamera, abhängig von der verfügbaren Ausrüstung und der erforderlichen Erkennungsempfindlichkeit (typischerweise bestimmt durch die Menge der auf das Gel geladenen Probe). Es sollte auch beachtet werden, dass die Lichtquelle, die für die digitale Abbildung dieses Gels erforderlich ist, abhängig von der Dichte der Probe und der während des Färbeprozesses erforderlichen Entwicklungszeit variieren kann. Gele, die sich schnell entwickeln und silbergefärbte Bänder erzeugen, die mit bloßem Auge gut sichtbar sind, erfordern eine UV-Transillumination für die besten Bilder, da der Großteil des Lichts von nicht umgesetztem Alcian-Blau absorbiert wird. Gele, die längere Entwicklungszeiten erfordern (z. B. solche mit sehr kleinen Probenmengen), erfordern entweder eine Epibeleuchtung oder eine Transillumination mit normalem Vollspektrumlicht, da diese am besten vom Silberfleck absorbiert werden.
Eine weitere Stärke dieser Technik ist, dass sie aufgrund ihrer Basis in der einfachen PAGE-Technologie, die allgemein verfügbare und kostengünstig erworbene Geräte und Reagenzien verwendet, besonders an Life-Sciences-Labore anpassbar ist. Während es andere Ansätze zur Quantifizierung der Länge isolierter GAG-Polymere gibt (z. B. Kapillarelektrophorese), erfordern sie typischerweise sowohl Wissen als auch Ausrüstung, die in den meisten Biowissenschaftslabors nicht allgemein verfügbar ist15,16. Die Einfachheit dieses Ansatzes und die relativ erschwingliche und verfügbare Natur der benötigten Reagenzien machen diese Technik für Biowissenschaftler, die daran interessiert sind, die GAG-Biologie im Kontext ihrer gegebenen Teilfelder zu studieren, leicht anpassbar. Darüber hinaus dient diese Technik als wesentliche Ergänzung zu massenspektrometrischen Techniken zum Nachweis von GAGs in biologischen Geweben. Während massenspektrometrische Ansätze in der Lage sind, GAGs mit hoher Empfindlichkeit zu detektieren und subtile Unterschiede in der Struktur von komplexen Proben17zu unterscheiden, ist es aufgrund der Art der Technologie nicht in der Lage, zwischen GAG-Polymeren nach Größe zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist ein PAGE-basierter Ansatz unerlässlich, um die Größe von HS-Polymeren in biologischen Proben von Interesse zu untersuchen.
Es ist wichtig zu beachten, dass es mehrere Einschränkungen für die in diesem Artikel beschriebenen Techniken gibt. Die erste und auffälligste ist, dass dieser Ansatz aufgrund der Ladung-Ladung-Wechselwirkung, die für die Alcian-Blaufärbungsreaktion von zentraler Bedeutung ist, für hochsulfatierte GAGs sehr selektiv ist und nur schwach neutralere geladene Bestandteile färbt (z. B. Hyaluronsäure18). Daher wird diese Technik wahrscheinlich ihre Ergebnisse in Richtung saurerer GAG-Anteile verzerren. Aus diesem Grund sollten ergänzende Ansätze zur Messung des GAG-Gehalts in biologischen Proben von Interesse (z. B. massenspektrometrische Techniken) zusätzlich verwendet werden, um ein vollständigeres Bild der in experimentellen Proben vorhandenen GAGs zu erhalten. Darüber hinaus haben andere für Endbenutzer, die speziell an der Messung der Größe von Hyaluronan interessiert sind, ähnliche PAGE-basierte Techniken beschrieben, die biotinyliertes Hyaluronsäure-bindendes Protein (HABP) nutzen, das an die hier beschriebene Grundtechnik angepasst werden kann19.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in diesem Artikel vorgestellte Technik verwendet werden kann, um GAGs aus biologischen Proben mit großer Empfindlichkeit und Spezifität zu isolieren, zu reinigen und nachzuweisen sowie die native Länge dieser Polysaccharidketten zu messen. Diese Informationen können für das Testen von Hypothesen über GAG-Liganden-Wechselwirkungen aufgrund der Bedeutung der GAG-Polymerlänge bei der Bestimmung der Bindungsaffinität von verwandten Liganden entscheidend sein. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile, vor allem seine relative Einfachheit und Anpassungsfähigkeit an Biowissenschaftsforschungslabors, obwohl er durch seine relative Neigung zu negativ geladenen GAG-Anteilen begrenzt ist. Trotz dieses Nachteils stellt diese Technik ein robustes Werkzeug dar, das Die Forscher ermutigen würde, die Rolle von GAGs bei organömostase und -erkrankungen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde gefördert durch F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL und EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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