Summary
Denne rapporten beskriver teknikker for å isolere og rense sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) fra biologiske prøver og en polyakrylamidgelelektroforese tilnærming til omtrentlig størrelse. GAG bidrar til vevsstruktur og påvirker signalprosesser via elektrostatisk interaksjon med proteiner. GAG polymer lengde bidrar til deres bindende affinitet for cognate ligander.
Abstract
Sulfaterte glykosaminoglykaner (GAG) som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en kritisk rolle i en rekke grunnleggende biologiske strukturer og prosesser. Som polymerer eksisterer GAG-er som en polydisperse blanding som inneholder polysakkaridkjeder som kan variere fra 4000 Da til godt over 40.000 Da. Innenfor disse kjedene finnes domener av sulfatasjon, og gir et mønster av negativ ladning som letter samspillet med positivt ladede rester av cognateproteinligander. Sulfaterte domener av GAG-er må ha tilstrekkelig lengde for å tillate disse elektrostatiske interaksjonene. For å forstå funksjonen til GAG-er i biologisk vev, må undersøkeren kunne isolere, rense og måle størrelsen på GAG-er. Denne rapporten beskriver en praktisk og allsidig polyakrylamidgelelektroforesebasert teknikk som kan utnyttes til å løse relativt små forskjeller i størrelse mellom GAG-er isolert fra en rekke biologiske vevstyper.
Introduction
Glykosaminoglykaner (GAG) er en mangfoldig familie av lineære polysakkarider som er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrar til mange grunnleggende fysiologiske prosesser1. GAG-er som heparansulfat (HS) og kondroitinsulfat (CS) kan bli sulfatert i forskjellige posisjoner langs polysakkaridkjeden, og gir geografiske domener med negativ ladning. Disse GAG-ene, når de er bundet til celleoverflateproteiner kjent som proteoglykaner, projiserer inn i det ekstracellulære rommet og binder seg til cognate-ligander, noe som muliggjør regulering av både cis- (ligand festet til samme celle) og trans- (ligand festet til nabocellen) signalprosesser2. Videre utfører GAG også kritiske roller som strukturelle elementer i vev som den glomerulære kjellermembranen3, vaskulær endotelglykokalyx4 og lungeeplytelformet glykokalyx5, og i bindevev som brusk6.
Lengden på GAG polysakkaridkjeder varierer betydelig i henhold til den biologiske konteksten og kan forlenges, spaltes og modifiseres dynamisk av et svært komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Viktigst, lengden på GAG polymerkjeder bidrar vesentlig til deres bindende affinitet for ligander og deretter til deres biologiske funksjon8,9. Av denne grunn krever bestemmelse av funksjonen til en endogen GAG verdsettelse av størrelsen. Dessverre, i motsetning til proteiner og nukleinsyrer, finnes det svært få lett tilgjengelige teknikker for å oppdage og måle GAG-er, noe som historisk har resultert i relativt begrenset undersøkelse av de biologiske rollene til denne mangfoldige polysakkaridfamilien.
Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer og renser GAG-er fra de fleste biologiske vev, og beskriver også hvordan du bruker polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) for å evaluere lengden på de isolerte polymerene med en god grad av spesifisitet. I motsetning til andre svært komplekse (og ofte massespektrometribaserte) glykomiske tilnærminger, kan denne metoden brukes ved hjelp av standard laboratorieutstyr og teknikker. Denne praktiske tilnærmingen kan derfor utvide etterforskernes evne til å bestemme den biologiske rollen til innfødte GAG-er og deres interaksjon med kontekstuelt viktige ligander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle biologiske prøver analysert i denne protokollen ble hentet fra mus, under protokoller godkjent av University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfatisolasjon
- Delipidasjon av vevsprøver
MERK: Delipidasjon er et valgfritt trinn for fettrikt vev.- Lag en 1:1 blanding av metanol og dichloromethane. Forbered ca. 500 μL per prøve; større vevsstykker kan kreve opptil 1 ml.
- Legg hver vevsprøve i en liten glassbeholder med lokk for delipidasjon.
MERK: Prøvemassen kan variere per vev av interesse og eksperimentelle behov. 50 mg eller mindre er vanligvis tilstrekkelig for tilstrekkelig GAG-utbytte, men noe optimalisering kan kreves av sluttbrukeren. - Tilsett 500 μL av metanol:dichlorometanoppløsningen til hver glassbeholder og bland. Sørg for at alle faste vevsprøver er helt nedsenket i løsningsmiddel.
MERK: Bruk serologiske pipetter eller koniske plastrør for å blande og håndtere metanol/dichloromethane-løsningen; annen plast kan oppløses. - Plasser prøver på en shaker (i sikret stativ) i en kjemisk avtrekkshette og rør forsiktig i 1 time.
- Agiter prøvene for å blande og sentrifuge ved 17.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Rør forsiktig ut den organiske løsningsmiddelfraksjonen (supernatant). Dette er lipidfraksjonen - den inneholder ikke GAG-er og kan kastes.
MERK: Prøv å ikke forstyrre vevet, da små biter kan gå tapt. Det er å foretrekke å etterlate noe av det organiske laget i prøvebeholderen, i stedet for å risikere prøvetapet. - La lokket på glassbeholderen stå åpent og la den fordampe over natten i hetten. Bytt røret for neste trinn, da disse rørene ikke vil overleve videre behandling.
- Når løsningsmiddelblandingen er fullstendig fordampet, fortsett til mekanisk oppløsning (hvis restprøve er >50 mg) eller Actinase E fordøyelse (< 50 mg).
- Mekanisk oppløsning av fast vev (valgfritt; for større vevsprøver)
MERK: De fleste mindre biter av fast vev (ca. 50 mg eller mindre) skal oppløses helt under fordøyelsestrinnet. Imidlertid vil større prøver kreve mekanisk oppløsning.- Flash-fryse prøver av interesse ved å plassere dem i et passende størrelse polypropylenrør og plassere det lukkede røret i flytende nitrogen. La prøven fryse til den er helt solid.
- Bruk en ren mørtel og pestle, slip frosne prøver i en pulverlignende konsistens.
- Gå direkte til Actinase E-fordøyelsen (trinn 1.4).
- Prøveavsalting og konsentrasjon
MERK: Dette er et valgfritt trinn og bare nødvendig for fortynnede flytende vevsprøver (f.eks. bronko-alveolar lavagevæske (BALF) eller plasma).- Samle væskeprøver i passende eksperimentelle grupper (f.eks. ved biologisk replikering eller eksperimentell gruppe)
- Plasser totalt prøvevolum i en 500 μL sentrifugalfilterkolonne med en molekylvektkutt (MWCO) på 3000 Da.
- Spinn i 30 min ved 14 000 x g ved romtemperatur. Gjenta etter behov hvis ønsket prøvevolum overskrider kapasiteten til sentrifugalfilterkolonnen.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deionisert, filtrert vann. Kast gjennomstrømningen.
- Snu filteret og spinn i 1 min ved 2000 x g i friske, passende merkede oppsamlingsrør. Frys ved -80 °C eller fortsett til neste trinn.
- Actinase E fordøyelse
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fordøye og til slutt fjerne proteinforurensninger fra prøven.- Bland prøvene 1:1 med rekombinant Actinase E til en ønsket konsentrasjon på 10 mg/ml. Tilsett riktig volum av 10x fordøyelsesbufferkonsentrat. Ønsket sluttkonsentrasjon: 0,005 M kalsiumacetat og 0,01 M natriumacetat, pH 7,5. For eksempel: 190 μL væskeprøve, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M kalsiumacetat, 0,1 M natriumacetat.
- Agitate prøver forsiktig å blande, deretter fordøye i 48-72 h ved 55 °C (opptil 7 dager for hele vev).
- Varm opp til 80 °C i 15-20 min for å varme opp inaktiv actinase E.
- Frys prøven ved -80 °C eller fortsett til trinn 1.5.
- Prøveavsalting og konsentrasjon
MERK: Hvis en lav masse av GAG av interesse forventes i den biologiske prøven, eller hvis bevaring av forbruksvarer reagenser (dvs. sentrifugalfilterkolonner) er ønskelig, kan prøver samles for å produsere et enkelt konsentrat per eksperimentell gruppe (f.eks. ved biologisk replikering eller eksperimentell gruppe).- Plasser totalt prøvevolum i en 500 μL sentrifugalfilterkolonne med en MWCO på 3000 Da.
- Spinn i 30 min ved 14 000 x g ved romtemperatur. Gjenta etter behov, hvis ønsket prøvevolum overskrider kapasiteten til sentrifugalfilterkolonnen.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deionisert, filtrert vann. Kast gjennomstrømningen.
- Snu filteret og spinn i 1 min ved 2000 x g i friske, passende merkede oppsamlingsrør (vanligvis inkludert i sentrifugalfilterkolonnene). Frys ved -80 °C eller fortsett til neste trinn.
- Uttørking
- Plasser enten de oppløste prøvene fra trinn 1.5.5 i en rotasjonsvakuumkonsentrator over natten eller lyofiliser prøvene som beskrevet nedenfor.
- Frys prøvene grundig enten over natten i -80 °C eller ved å dyppe i flytende nitrogen.
- Pierce prøve lokk med en 18 G nål og plasser i lyophilizer kammeret. Legg til papirhåndklær til pakking etter behov.
- Fest lyofilisatorkammeret til lyofilisatoren og frys tørt over natten (minst -40 °C, 0,135 Torr)
- Cation exchange-kolonne
- Resuspend uttørkede prøver i opptil 400 μL 8 M urea, 2% CHAPS-løsning (eller, hvis du samler prøver, resuspend til maksimalt (400/n) μL, hvor n = antall prøver i ønsket basseng. Bruk så lite av vaskemiddeloppløsningen som mulig.
- Likevektskolonnen (IEX) med 400 μL 8 M urea, 2 % CHAPS-løsning. Spinn i 5 min ved 2000 x g ved romtemperatur.
- Last inn 400 μL prøve-/utvalgte prøver i IEX-kolonnen. Spinn i 5 min ved 2000 x g.
- Vask 3x med 400 μL 8 M urea, 2% CHAPS-oppløsning. Spinn i 5 min på 2000 x g hver gang.
- Elute 3x med 400 μL 0,2 M NaCl. Spinn i 5 min på 2000 x g hver. Dette er lav affinitetsfraksjonen - dette kan beholdes for kvalitetskontrollformål om ønskelig.
- Elute 3x med 400 μL 2,7 M (16%) NaCl. Spinn i 5 min på 2000 x g hver. Denne fraksjonen vil inneholde de isolerte glykosaminoglykanene av interesse - hold alt sammen!
- For å avsalte hver eluted brøkdel, tilsett metanol opptil 80 vol% og inkuber ved 4 °C over natten. Spinn hver prøve i 5 min ved 2000 x g. Gjenopprett de faste rester som dette tørkes avsaltet glykosaminoglykan.
MERK: Alternativt kan du hoppe over dette trinnet og gå videre til trinn 1.8 for å avsalte eluate uten metanol.
- Prøveavsalting og konsentrasjon
- Om nødvendig eluterte bassengfraksjoner (fra 1,7,6) i passende eksperimentelle grupper (f.eks. ved biologisk replikering eller eksperimentell gruppe).
- Plasser totalt prøvevolum i en 500 μL sentrifugalfilterkolonne med en MWCO på 3000 Da.
- Spinn i 30 min ved 14 000 x g ved romtemperatur. Gjenta etter behov, hvis ønsket prøvevolum overskrider kapasiteten til sentrifugalfilterkolonnen.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deionisert, filtrert vann. Kast gjennomstrømningen. Fortsett direkte til trinn 1.9.
- Kondroitin fordøyelse
MERK: Formålet med dette trinnet er å fjerne GAG-er som ikke er av interesse for sluttbrukeren. I dette tilfellet brukes kondroitinase til å fjerne kondroitin. I vevet som brukes til å generere representative resultater (bronko-alveolar lavagevæske og hel lunge), forlater fordøyende kondroitinsulfat heparansulfat som den primære gjenværende GAG. Sluttbrukere må kanskje legge til flere fordøyelsestrinn avhengig av deres eksperimentelle mål.- Last 350 μL fordøyelsesbuffer (50 mM ammoniumacetat med 2 mM kalsiumklorid justert til pH 7,0) til sentrifugalfilterkolonnen uten å berøre membranen.
- Tilsett 5 μL rekombinant kondroitinase ABC.
- Plasser prøverøret i en ovn på 37 °C og inkuber i 1 time.
- Snu søylen og plasser den i passende merkede oppsamlingsrør. Spinn i 1 min ved 2000 x g.
- Varm opp prøver til 80 °C i 15-20 min for å inaktivere kondroitinase ABC.
- Prøveavsalting og konsentrasjon
- Om nødvendig fordøyde pool chondroitin prøver fra trinn 1.9.5 til passende eksperimentelle grupper (f.eks. ved biologisk replikering eller eksperimentell gruppe)
- Plasser det totale prøvevolumet i en 500 μL sentrifugalfilterkolonne med en MWCO på 3000 Da.
- Spinn i 30 min ved 14 000 x g ved romtemperatur. Gjenta etter behov hvis ønsket prøvevolum overskrider kapasiteten til sentrifugalfilterkolonnen.
- Vask hver kolonne 3x med 400 μL deionisert, filtrert vann. Kast gjennomstrømningen.
- Snu filteret og spinn i 1 min ved 2000 x g i friske, passende merkede oppsamlingsrør. Frys ved -80 °C eller fortsett til neste trinn.
- Uttørking
MERK: I dette trinnet er uttørking nødvendig slik at prøver kan brukes på nytt i minst mulig mengde vann og løpebuffer.- Plasser enten de kondroitinfordøyde prøvene fra trinn 1.10.5 direkte i en rotasjonsvakuumkonsentrator over natten eller lyofiliser som følger:
- Frys prøvene grundig enten over natten i -80 °C eller ved å dyppe i flytende nitrogen.
- Pierce prøve lokk med en 18 G nål og plasser i lyophilizer kammeret. Legg til papirhåndklær til pakking etter behov.
- Fest lyofilisatorkammeret til lyofilisatoren og frys tørt over natten (minst 40 °C, 0,135 Torr)
2. Polyakrylamid gelelektroforese av isolerte og rensede glykosaminoglykaner
- Klargjør løsninger som er nødvendige for polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) på forhånd (Tabell 1).
MERK: Velg prosentandelen akrylamid for å løse geloppløsning avhengig av størrelsen på glykosaminoglykanene som forventes å være i prøven. 15% anbefales for å løse større fragmenter (større enn 30 disakkaridunderenheter i lengden); 22% for mindre fragmenter (<20 disakkaridunderenheter i lengde). - Plasser tom kassett i PAGE-tanken. Kast oppløsningsgelen på følgende måte: Bland 10 ml oppløsningsgeloppløsning i 15 ml røret, bland 10 ml oppløsningsgeloppløsning, 60 μL 10 % ammoniumpersulfat (må tilberedes på nytt) og 10 μL TEMED (tilsett TEMED sist). Snu røret forsiktig 2-3x. Bruk pipette for raskt å legge til den ovennevnte 10 ml-løsningen i kassetten. Overlegg med 2 ml deionisert, filtrert vann og la den løsende gelen polymerisere i 30 min.
MERK: Følgende SIDEprotokoll er optimalisert for et vertikalt SIDE-system med en lengde på 13,3 x 8,7 cm (bredde x lengde) 1,0 mm tykke støpekassetter med et totalt volum på ca. 12 ml. Andre kassettsystemer kan brukes, men kan kreve optimalisering av sluttbrukeren. - Etter at oppløsningsgelen er fullstendig polymerisert, kast det overlagte vannet og kast stablingsgelen som følger: Bland 3 ml av stablingsgelløsningen i et 15 ml rør, 90 μL 10 % ammoniumpersulfat (må være nytilberedt), 3 μL TEMED (tilsett TEMED sist).
- Snu røret forsiktig 2-3x. Bruk en pipette for raskt å legge til stablingsgelløsningen over den størkne oppløsningsgelen; fyll kassetten til randen. Sett kammen helt inn med oppsettet. La stablingsgelen polymerisere i 30 min.
- Når gelen er polymerisert, må du kontrollere at båndstripen er fjernet fra bunnen av kassetten, og plassere kassetten tilbake i PAGE-tankenheten.
- Fyll henholdsvis øvre og nedre kamre med øvre og nedre kammerbuffer.
- Løs opp de tørkede prøvene fra trinn 1.11.4 i det minste nødvendige volumet av deionisert, filtrert vann (maksimalt 50% av volumet av brønnene i PAGE gel). Bland 1:1 med prøvelastebuffer. Legg prøvene og HS oligosakkaridet "stiger" (se tabell 1) i gelen.
- Forløp gelen i 5 min ved 100 V. Kjør deretter gelen på 200 V i 20-25 min (for en 15% polyakrylamid som løser gel), 40-50 min (for en 18% polyakrylamid som løser gel), 90-100 min (for 22% polyakrylamid som løser gel).
MERK: Noe optimalisering av 200 V-kjøretiden kan være nødvendig. Fenolrød migrerer foran heparin oligosakkarider som er 2 polymerunderenheter i lengde (dvs. graden av polymerisasjon 2 eller dp2); bromofenolblå migrerer foran dp10-dp14. Beste resultater oppnås når spenningen påføres slik at fenolrødbåndet migrerer nesten, men ikke helt, til bunnen av gelen. Juster kjøretiden tilsvarende.
3. Sølv farging protokoll
- Forbered alle løsninger som er nødvendige for sølvfarging på forhånd (Tabell 2).
MERK: Ikke berør sidegelen direkte før den er farget, utviklet og plassert i stoppløsning. Manipuler i stedet gelen ved hjelp av rene plast- eller glassverktøy. Direkte håndtering av gelen vil resultere i fingertrykkforvrengninger og andre synlige gjenstander på gelen etter farging. - Når løpet er fullført, demonter kassetten og trekk gel i en ren, middels stor beholder fylt med deionisert, filtrert vann.
MERK: For å unngå direkte håndtering av gelen, bruk pipettespiss eller annet plastobjekt for å forsiktig skrelle gelen bort fra kassetten mens den er nedsenket i vann. Gel kan være skjøre - håndtak forsiktig.- Kast vannet. Flekk gelen i alciansk blå fargingsoppløsning i 5 min.
- Kast Alcian blå flekk. Skyll/vask raskt 2-3x med deionisert, filtrert vann til det meste av den alciske blå fargingsløsningen er fjernet.
- La det avflekke i deionisert, filtrert vann over natten på rocker. Forsikre deg om at det er rikelig med deionisert, filtrert vann for å sikre at eventuell gjenværende flekk er fullstendig vasket av gelen over natten.
- Vask gel i 50% metanol (40 min totalt, bytt løsning 2-3x).
- Vask gel i deionisert, filtrert vann i 30 min. Kast vann og gjenta 3 ganger til i totalt 2 timer, og erstatt vannet hver gang.
- I en frisk, ren beholder, flekk gelen i 30 min i sølvnitratfargingsløsning.
- Skyll/vask raskt 2-3x i deionisert, filtrert vann for å fjerne sølvfargingsløsningen helt.
- Vask i 30 min i deionisert, filtrert vann. Kast vann og gjenta 2x i totalt 90 min, og erstatt vannbadet hver gang.
- Kast vann og tilsett utviklingsløsning.
- Når du har utviklet løsningen, må du nøye observere gelen og se etter utseendet på bånd. Avhengig av kvaliteten på flekken og massen av prøven lastet, kan utviklingen ta alt fra noen få sekunder til flere minutter.
- Så snart de ønskede båndene er synlige, kast straks utviklingsløsningen og vask kort med stoppløsning.
- Kast stoppoppløsningsvasken og erstatt den med frisk stoppløsning. La det suge i 1 time på en rocker eller shaker.
- Vask i deionisert, filtrert vann over natten (gelen kan imidlertid avbildes umiddelbart etter stoppoppløsningsvask).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcian blå brukes til å flekke sulfaterte GAG 10; dette signalet forsterkes ved bruk av en påfølgende sølvflekk 11. Figur 1 gir en visuell demonstrasjon av utviklingsprosessen for sølvfarging. Som demonstrert forsterkes det alciske blå signalet som representerer GAG-er atskilt av elektroforese når utviklingsmiddelet trenger inn i polyakrylamidgelen. Vanligvis vil utviklingsprosessen redusere sølv og Alcian blåfargede GAG-er på en tetthetsavhengig måte, med kantene på hvert bånd som reduseres først, mens de tettere fargingsområdene i midten vil farge sist.
I litteraturen varierer den rapporterte grensen for deteksjon av GAG-er ved hjelp av SIDE-baserte tilnærminger fra 0,5-1 μg12,13. For å bestemme grensen for deteksjon ved hjelp av vår tilnærming, ble heparan sulfat oligosakkarider av forskjellige polymerlengder (ufraksjonert heparin, dp20, dp10, dp6) lastet på en 22% polyakrylamidgel, deretter løp og farget som beskrevet ovenfor. Hver oligosakkarid ble lastet to ganger ved to forskjellige masser: 1,0 μg og 0,5 μg. Figur 2 viser at vår teknikk ganske enkelt kan oppdage 0,5 μg renset GAG. Spesielt ble ufraksjonert heparin minst lett oppdaget av de fire forskjellige oligosakkaridene som ble testet, sannsynligvis på grunn av en bredere fordeling av polymerstørrelser som tilsvarende reduserer tettheten til hvert enkelt bånd.
For å vurdere effektiviteten av GAG-rensing fra flytende biologiske prøver, ble GAG-er isolert fra to bronkoalveolar lavage (BAL) prøver. Som vist i figur 3var den første prøven merket som A som ble brukt til GAG-isolasjon, 1 ml BAL-væske høstet fra en mus 24 timer etter intratrakeal lipopolysakkarid (LPS) (3 mg/kg), administrert for å indusere alveolar epitelial HS shedding 5. 10 μg kommersielt tilgjengelig dp6 ble lagt direkte til denne BAL væsken for å tjene som en "spike in" kontroll for å vurdere tap av GAG under isolasjonsprosessen. Den andre prøven merket som B besto av 10 ml BAL væske samlet fra 3 mus som fikk intratrakeal LPS (3 mg/kg) 24 timer før, uten eksogen GAG-spike-in. Begge prøvene ble behandlet for GAG-isolasjon samtidig, og alle de 3 fraksjonene som ble hentet fra ionutvekslingskolonnen ble beholdt og viderebehandlet for å avgjøre om noen GAG-er var til stede i lavaffinitets- og vaskefraksjonene. 2 μg kommersielt kjøpte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosakkarider ble kjørt i PAGE gel sammen med disse prøvene for å gi en referanse for å kvalitativt vurdere størrelsen på HS GAGs i hver eluted brøkdel, samt en referanse for å sammenligne tetthet med 10 μg "spike in" kontroll som gjennomgikk GAG isolasjon.
For å demonstrere bruken av denne teknikken på fast vev, ble heparansulfat isolert fra et 15 mg stykke frossen mus lunge som beskrevet ovenfor. Under isolasjons- og rensingsprosessen ble den lave affinitetsfraksjonen (0,2 M NaCl) unndratt av ionutvekslingskolonnen beholdt og behandlet sammen med den høye affiniteten (2,7 M NaCl) brøkdel og kjørt på gelen (Figur 4). 2 μg kommersielt kjøpte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosakkarider ble kjørt sammen med disse prøvene for å gi en referanse for størrelse. Som det fremgår, ga hele lungehomogenatet en god mengde isolert HS, med de minste fragmentene omtrent lik dp10 i størrelse. Den relative berikelsen av Alcian blå / sølv flekk ivrig innhold GAGs i 2,7 M NaCl fraksjonen viser at heparan sulfat binder seg med høy affinitet til ionbyttekolonner og kan eluted av kolonnen med høy spesifisitet. Hele lungehomogenatet ga en god mengde isolert heparansulfat (2,7 M NaCl-fraksjon), med de minste fragmentene omtrent lik dp10 i størrelse.
Figur 1: Utviklingsprosess for sølvflekker. Alcian blå farging av ufraksjonert heparin (UFH) eller størrelsesdefinerte oligosakkarider (dp = grad av polymerisering) separert av elektroforese forsterkes av sølvfarging. Fra venstre til høyre: UFH, dp20, dp10, dp6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Følsomhet for polyakrylamidgel og sølvflekk for påvisning av heparansulfat. Heparan sulfat oligosakkarider av forskjellige lengder (ufraksjonert heparin aka UFH, dp20, dp10, dp6) var på en 22% polyakrylamidgel og løp og sølvfarget. Hvert oligosakkarid ble lastet to ganger ved to forskjellige masser: 1,0 μg (bånd lengst til venstre) og 0,5 μg (bånd lengst til høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effektivitet av GAG-rensing fra flytende biologiske prøver. GAGs isolert fra to bronchoalveolar lavage (BAL) prøver, merket her som "A" og "B", ble kjørt på en 22% polyakrylamidgel og sølvfarget. Prøve A besto av 1 ml BAL-væske høstet fra en mus 24 timer etter behandling med 3 mg/kg intratrakeal lipopolysakkarid (LPS). Ytterligere 10 μg dp6 HS ble lagt til denne prøven som en "spike in" kontroll. Prøve B besto av 10 ml samlet BAL væske samlet fra 3 mus 24 timer etter administrering av LPS. Hver prøve ble kjørt sammen med brøkdeler fra ionbyttekolonnen som ble unngått med enten fortynningsmiddel ("vask") eller lave konsentrasjoner av NaCl (0,2 M). 2 μg kommersielt kjøpte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosakkarider ble brukt som størrelsesreferanser (venstre bånd). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Måling av størrelsen på heparansulfater isolert og renset fra en sunn muse lunge. Heparinsulfatinnhold isolert og renset fra 15 mg frossen prøve av en lunge isolert fra en sunn mus og kjører på en 22% polyakrylamidgel. Heparansulfat ble unndratt fra ionbyttekolonnen med enten lave konsentrasjoner (0,2 M; lav affinitetsfraksjon) eller høye konsentrasjoner (2,7 M, 16% løsning; høy affinitetsfraksjon) av NaCl. 2 μg kommersielt kjøpte dp20, dp10 og dp6 heparan sulfat oligosakkarider ble brukt som størrelsesreferanser (venstre bånd). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| MERK: Alle løsninger må filtreres (0,22 μm) før bruk. | |||
| Løsning | Oppskrift | Komposisjon | Kommentarer |
| Løse løpebuffer for gel/nedre kammer (2 L eller 4 L) | Borsyre, MW 61,83 | 2L: 12.36 g; 4L: 24,76 g | Ønsket konsentrasjon: 0,1 M |
| Tris-base, MW 124,14 | 2L: 24.2 g; 4L: | Ønsket konsentrasjon: 0,1 M | |
| Disodium EDTA MW 336,21 eller dihydrat, MW 372,36 | 2L: henholdsvis 6,7 g eller 7,4 g; Henholdsvis 4L 13,4 g eller 14,8 g | Ønsket konsentrasjon: 0,01 M | |
| Deionisert vann | 2L eller 4L | Juster pH til 8,3 etter fullstendig oppløsning av reagenser | |
| Øvre kammer som kjører buffer (1 L) | Glysin | 93 g | Ønsket konsentrasjon: 1 M |
| Tris-base, MW 124,14 | 24,2 g | Ønsket konsentrasjon: 0,2 M | |
| Deionisert vann | 1 L | ||
| Oppløsning av gel, 22% totalt akrylamid (500ml) | Akrylamid, MW 71,08 | 100,1 g | Ønsket konsentrasjon: 20,02% m/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154,17) | 10 g | Ønsket konsentrasjon: 2% m/v | |
| Sukrose | 75 g | Ønsket konsentrasjon: 15% m/v | |
| Løse gelbuffer | 500 ml | Ta med til et totalt volum på 500 ml; vil kreve mindre enn 500 ml buffertotal | |
| Oppløsning av gel, 15% totalt akrylamid (400ml) | Akrylamid, MW 71,08 | 56,3 g | Ønsket konsentrasjon: 14,08% m/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154,17) | 3,7 g | Ønsket konsentrasjon: 2% m/v | |
| Sukrose | 20,8 g | Ønsket konsentrasjon: 15% m/v | |
| Løse gelbuffer | 400 ml | Ta med til et totalt volum på 400 ml; vil kreve mindre enn 400 ml buffertotal | |
| Stabling gel (100 ml) | Akrylamid, MW 71,08 | 4,75 g | Ønsket konsentrasjon: 4,75% m/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154,17) | 0,25 g | Ønsket konsentrasjon: 0,25% m/v | |
| Løse gelbuffer | 100 ml | Tilsett 80 ml buffer og fulloppløselige reagenser. Juster deretter pH til 76,3 med saltsyre, dropwise. Ta deretter til et totalt volum på 100 ml med å løse gelbuffer. | |
| Eksempel på lastebuffer (500 ml) | Sukrose | 250g | Ønsket konsentrasjon: 50% m/v |
| Fenol rød | 500mg | Ønsket konsentrasjon: 1mg/ml | |
| Bromophenol blå | 250mg | Ønsket konsentrasjon: 0,5mg/ml | |
| Deionisert vann | 500ml | Ta med til et totalt volum på 500 ml; vil kreve mindre enn 500 ml vann totalt | |
| Heparin avledet oligosacharide 'stige' (2ml hver) | dp6 | 0,1mg | MERK: Anbefal bruk av heparinavledede oligosakkarider 6 polymerunderenheter i lengde (også kalt polymerisasjonsgrad 6 eller dp6) for det minste båndet, dp20 for det største båndet og dp10 for midtbånd. Andre kombinasjoner kan imidlertid brukes hvis ønskelig. Ønsket konsentrasjon: 0,05 mg/ml |
| dp10 | 0,1mg | ||
| dp20 | 0,1mg | ||
| Deionisert vann | 3ml | Løs opp hvert oligosakkarid i separate rør med 1 ml hver | |
| Eksempel på innlastingsbuffer | 3ml | Tilsett 1 ml (1:1-blanding) til hver oligosakkaridoppløsning | |
Tabell 1: Løsninger som kreves for polyakrylamidgelelektroforese av rensede glykosaminoglykaner. Alle løsninger må filtreres (0,22 μm) før bruk.
| MERK: Alle løsninger må filtreres (0,22 μm) før bruk. | |||
| Løsning | Oppskrift | Komposisjon | Kommentarer |
| Alcian blå farging løsning (500ml) | Alcian blå 8GX pulver | 2,5 g | Ønsket konsentrasjon: 0,5% m/v |
| 2% v / v issyre | 500ml | ||
| Sølvflekk (200 ml) | Deionisert vann | 192,7 ml | Forbered flekkoppløsning frisk; bruk innen en uke. |
| 7,6 M natriumhydroksid | 2 ml | For å lage, tilsett 3,04 g natriumhydroksidpellets til 10 ml vann | |
| Ammoniumhydroksid | 3,3 ml | ||
| 4M sølvnitratløsning | 2 ml | For å lage, tilsett 3.397 g sølvnitrat til 5 ml vann. Tilsett dråpevis mens du rører for å unngå nedbør. | |
| Utviklende løsning (501 ml) | Deionisert vann | 500 ml | Utviklingsløsning må gjøres frisk og brukes innen 24 timer. |
| 2,5 % m/v sitronsyre | 1 ml | For å lage, tilsett 100mg til 4 ml deionisert vann. Sitronsyre må gjøres frisk. | |
| Formaldehyd | 250 μL | ||
| Stopp løsning (500 ml) | Deionisert vann | 300 ml | |
| Glasial eddiksyre | 20 ml | ||
| Metanol | 90 ml | ||
Tabell 2: Løsninger som kreves for sølvfarging av glykosaminoglykaner adskilt av polyaklamidgelelektroforese. Alle løsninger må filtreres (0,22 μm) før bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAG-er spiller en sentral rolle i mange ulike biologiske prosesser. En av hovedfunksjonene til sulfaterte GAG-er (som HS og CS) er å samhandle med og binde seg til ligander, noe som kan endre nedstrøms signalfunksjoner. En viktig determinant for GAG-bindingsaffinitet for å cognate ligander er lengden på GAG polymerkjeden 8,9,14. Derfor er det viktig for forskerne å kunne definere med rimelig presisjon størrelsen på GAG-kjeder isolert fra biologiske prøver av interesse. For å være praktisk bør denne teknikken være i stand til å bli utført ved hjelp av vanlig laboratorieutstyr og reagenser.
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere og rense GAG-er fra biologiske prøver, for å skille dem etter størrelse via PAGE, og for å visualisere dem ved hjelp av alciansk blå og sølvfargingsteknikk. Selv om det er flere måter å skille glykosaminoglykaner etter størrelse, har vår tilnærming flere styrker som er spesifikke for anvendelsen av denne teknikken i biovitenskapelige laboratorier. For det første, med en grense for påvisning på 0,5 μg, er denne teknikken svært følsom i påvisning av GAG-er av interesse. Vår erfaring er at selv prøver som inneholder relativt lave konsentrasjoner av GAG-er (dvs. BAL-væskeprøver) bør gi mer enn nok GAG til deteksjon ved hjelp av denne metoden. Mens utbyttet fra isolasjon og rensing av BAL-væske vil variere etter teknikk og spesifikk GAG av interesse, har det vært vår erfaring at 10 ml rå BAL-væske gir tilstrekkelig HS til å kunne påvises ved hjelp av denne teknikken. Utbyttet fra faste organer er vesentlig høyere, avhengig av vevet høstet, men det er vår erfaring at en innledende solid prøve på 10 mg vil gi rikelig HS for deteksjon ved hjelp av denne teknikken.
Det er viktig å merke seg at den endelige avbildningen av den fargede PAGE gel vil variere i henhold til bildeteknologiene som er tilgjengelige for sluttbrukeren. Digitale fotografier av gelen kan tas ved hjelp av en rekke forskjellige systemer, inkludert mange kommersielt tilgjengelige geldokumentasjonssystemer eller et vanlig kommersielt kamera, avhengig av tilgjengelig utstyr og følsomheten for deteksjon som kreves (vanligvis diktert av mengden prøve lastet på gelen). Det skal også bemerkes at lyskilden som kreves for å digitalt bilde denne gelen, kan variere avhengig av prøvens tetthet og mengden utviklingstid som kreves under fargingsprosessen. Geler som utvikler seg raskt og produserer sølvfargede bånd som er lett synlige for det blotte øye, vil kreve UV-transilluminasjon for de beste bildene, da flertallet av lyset vil bli absorbert av uberørt alcianblå. Geler som krever lengre utviklingstider (for eksempel de med svært små mengder prøve) vil kreve enten epi-belysning eller transilluminasjon med normalt fullspektret lys, da dette best absorberes av sølvflekken.
En ytterligere styrke ved denne teknikken er at den er spesielt tilpasningsdyktig til livsvitenskapslaboratorier, på grunn av grunnlaget i enkel PAGE-teknologi, ved hjelp av utstyr og reagenser som ofte er tilgjengelige og billig anskaffet. Selv om det finnes andre tilnærminger for å kvantifisere lengden på isolerte GAG-polymerer (f.eks. kapillær elektroforese), krever de vanligvis både kunnskap og utstyr som ikke er allment tilgjengelig i de fleste biovitenskapelige laboratorier15,16. Enkelheten i denne tilnærmingen og reagensenes relativt rimelige og tilgjengelige natur gjør denne teknikken lett tilpasningsdyktig av livsvitenskapsforskere som er interessert i å studere GAG-biologi i sammenheng med deres gitte underfelt. Videre fungerer denne teknikken som et viktig supplement til massespektrometribaserte teknikker for å oppdage GAG i biologisk vev. Mens massespektrometribaserte tilnærminger er i stand til å oppdage GAG-er med høy følsomhet og å skille subtile forskjeller i struktur fra komplekse prøver17, på grunn av teknologiens natur er det ikke i stand til å skille mellom GAG-polymerer etter størrelse. Av denne grunn er en SIDE-basert tilnærming avgjørende for å spå størrelsen på HS-polymerer i biologiske prøver av interesse.
Det er viktig å merke seg at det er flere begrensninger på teknikkene som er beskrevet i dette dokumentet. Den første og mest fremtredende er at på grunn av ladningsladningsinteraksjonen som er sentral i den alciske blå fargereaksjonen, er denne tilnærmingen svært selektiv for svært sulfaterte GAG-er og vil bare svakt flekke mer nøytralt ladede moieties (f.eks. hyaluronsyre18). Dermed vil denne teknikken sannsynligvis forene resultatene mot surere GAG-moieties. Av denne grunn bør komplementære tilnærminger for å måle GAG-innhold i biologiske prøver av interesse (f.eks. massespektrometribaserte teknikker) brukes tilleggsmessig for å gi et mer komplett bilde av GAG-ene som finnes i eksperimentelle prøver. Videre, for sluttbrukere som er spesielt interessert i å måle størrelsen på hyaluronan, har andre beskrevet lignende SIDE-baserte teknikker som utnytter biotinylert hyaluronsyrebindingsprotein (HABP) som kan tilpasses den grunnleggende teknikken beskrevet her19.
Oppsummert kan teknikken som presenteres i denne artikkelen brukes til å isolere, rense og oppdage GAG-er fra biologiske prøver med stor følsomhet og spesifisitet, samt å måle den opprinnelige lengden på disse polysakkaridkjedene. Denne informasjonen kan være avgjørende for å teste hypoteser om GAG-ligand interaksjoner på grunn av betydningen av GAG polymer lengde i å bestemme cognate ligand binding affinitet. Denne tilnærmingen har flere fordeler, spesielt den relative enkelheten og tilpasningsevnen til forskningslaboratorier for biovitenskap, selv om den er begrenset av den relative skjevheten mot negativt ladede GAG-moieties. Til tross for denne ulempen representerer denne teknikken et robust verktøy som vil oppmuntre etterforskere til å studere GAGs rolle i organ homeostase og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
