Summary
Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.
Abstract
Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.
Introduction
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos1. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célula) quanto trans( ligantes ligados à célula vizinha) processos de sinalização2. Além disso, os GAGs também desempenham papéis críticos como elementos estruturais em tecidos como a membrana glomerular do porão3,o glicocalyx endotelial vascular4 e a glicocalyx epitelialpulmonar 5, e em tecidos conjuntivos tais cartilagem6.
O comprimento das cadeias de polissacarídeos GAG varia substancialmente de acordo com seu contexto biológico e pode ser dinamicamente alongado, cortado e modificado por um sistema regulatório enzimático altamente complexo7. É importante ressaltar que o comprimento das cadeias de polímeros GAG contribui substancialmente para sua afinidade vinculante com ligantes e, posteriormente, para sua função biológica8,9. Por essa razão, a determinação da função de um GAG endógeno requer a valorização de seu tamanho. Infelizmente, ao contrário de proteínas e ácidos nucleicos, existem muito poucas técnicas prontamente disponíveis para detectar e medir GAGs, o que historicamente resultou em uma investigação relativamente limitada sobre os papéis biológicos desta diversificada família polissacarídeo.
Este artigo descreve como isolar e purificar GAGs da maioria dos tecidos biológicos, e, também, descreve como usar a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliar o comprimento dos polímeros isolados com um grau justo de especificidade. Em contraste com outras abordagens glicomicicas altamente complexas (e muitas vezes baseadas em espectrometria de massa), este método pode ser empregado usando equipamentos e técnicas de laboratório padrão. Essa abordagem prática pode, portanto, expandir a capacidade dos investigadores de determinar o papel biológico dos GAGs nativos e sua interação com ligantes contextualmente importantes.
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Protocol
Todas as amostras biológicas analisadas neste protocolo foram obtidas a partir de camundongos, sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado.
1. Isolamento de sulfato heparano
- Delipidação de amostras de tecido
NOTA: A delipidação é um passo opcional para tecidos ricos em gordura.- Faça uma mistura de 1:1 de metanol e diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por amostra; pedaços maiores de tecido podem exigir até 1 mL.
- Coloque cada amostra de tecido em um pequeno recipiente de vidro com uma tampa para delipidação.
NOTA: A massa amostral pode variar de acordo com o tecido de interesse e necessidades experimentais. 50 mg ou menos é normalmente suficiente para o rendimento adequado do GAG, mas alguma otimização pode ser necessária pelo usuário final. - Adicione 500 μL da solução de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidro e misture. Certifique-se de que todas as amostras de tecido sólido estão completamente submersas em solvente.
NOTA: Use pipetas sorológicas ou tubos cônicos plásticos para misturar e manusear a solução de metanol/diclorometano; outros plásticos podem dissolver. - Coloque amostras em um agitador (em rack seguro) em um capô de fumaça química e agitar suavemente por 1h.
- Agitar as amostras para misturar e centrífugas a 17.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Pipeta cuidadosamente a fração de solvente orgânico (supernasteante). Esta é a fração lipídica - não contém GAGs e pode ser descartada.
NOTA: Tente não perturbar o tecido, pois pequenos pedaços podem ser perdidos. É preferível deixar parte da camada orgânica no recipiente de amostra, em vez de arriscar a perda da amostra. - Deixe a tampa do recipiente de vidro aberta e deixe-a evaporar durante a noite no capô. Troque o tubo para o próximo passo, pois esses tubos não sobreviverão a mais processamento.
- Uma vez que a mistura de solventes tenha evaporado completamente, proceda à desintegração mecânica (se a amostra residual for >50 mg) ou digestão Actinase E (< 50 mgs).
- Desintegração mecânica do tecido sólido (opcional; para amostras de tecido maior)
NOTA: A maioria dos pedaços menores de tecido sólido (aproximadamente 50 mg ou menos) deve dissolver-se completamente durante a etapa de digestão. No entanto, amostras maiores exigirão desintegração mecânica.- Amostras de interesse congelantes piscando colocando-as em um tubo de polipropileno de tamanho apropriado e colocando o tubo fechado em nitrogênio líquido. Deixe a amostra congelar até ficar completamente sólida.
- Usando uma argamassa limpa e pilão, triture amostras congeladas em uma consistência em pó.
- Prossiga diretamente para digestão Actinase E (Passo 1.4).
- Desalting e concentração de amostras
NOTA: Este é um passo opcional e apenas necessário para amostras de tecido líquido diluído (por exemplo, bronco-alveolar fluido de lavage (BALF) ou plasma).- Biolou amostras líquidas em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
- Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.
- Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
- Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
- Inverta o filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
- Digestão Actinase E
NOTA: Esta etapa é necessária para digerir e, finalmente, remover contaminantes proteicos da sua amostra.- Misture amostras 1:1 com Actinase E recombinante para uma concentração desejada de 10 mg/mL. Adicione o volume apropriado do concentrado tampão de digestão de 10x. Concentração final desejada: acetato de cálcio de 0,005 M e acetato de sódio de 0,01 M, pH 7,5. Por exemplo: 190 μL de amostra líquida, 190 μL de 20 mg/mL Actinase E, 20 μL de acetato de cálcio de 0,05 M, acetato de sódio de 0,1 M.
- Agitar amostras suavemente para misturar, em seguida, digerir por 48-72 h a 55 °C (até 7 dias para tecido inteiro).
- Aqueça a 80 °C por 15-20 min para aquecer a ativação Actinase E.
- Congele a amostra a -80 °C ou continue a passo 1,5.
- Desalting e concentração de amostras
NOTA: Se uma baixa massa de interesse da GAG for antecipada na amostra biológica, ou se a conservação de reagentes consumíveis (ou seja, colunas de filtro centrífugo) é desejável, as amostras podem ser agrupadas para produzir um único concentrado por grupo experimental (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental).- Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
- Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
- Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
- Inadvertida filtro e giro por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados (geralmente incluídos com as colunas do filtro centrífuga). Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
- Dessecação
- Coloque as amostras dissolvidas da etapa 1.5.5 em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize as amostras conforme detalhado abaixo.
- Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
- Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
- Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar durante a noite (pelo menos -40 °C, 0,135 Torr)
- Coluna de troca de cation
- Amostras dessecadas de ressuspend em até 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2% (ou, se agrupando amostras, resuspend a um máximo de (400/n) μL, onde n = o número de amostras na piscina desejada. Use o mínimo possível da solução de detergente.
- Equilibre a coluna de troca de cation (IEX) com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
- Carregar 400 μL de amostras/amostras agrupadas na coluna IEX. Gire por 5 min a 2.000 x g.
- Lave 3x com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g todas as vezes.
- Elute 3x com 400 μL de 0,2 M NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta é a fração de baixa afinidade - esta pode ser retida para fins de controle de qualidade, se desejar.
- Elute 3x com 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta fração conterá os glicosaminoglicanos isolados de interesse - guarde tudo!
- Para desalar cada fração elucidada, adicione metanol até 80 vol% e incubar a 4 °C durante a noite. Gire cada amostra por 5 min a 2.000 x g. Recupere o resíduo sólido, pois este é glicosaminogligliglicano seco.
NOTA: Alternativamente, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.8 para desaderar o elunato sem metanol.
- Desalting e concentração de amostras
- Se necessário, o pool eluia frações (de 1,7.6) em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por réplica biológica ou grupo experimental).
- Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
- Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
- Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através. Prossiga diretamente para a etapa 1.9.
- Digestão de condroitina
NOTA: O objetivo desta etapa é remover GAGs não de interesse do usuário final. Neste caso, a condroitina é usada para remover a condroitina. Nos tecidos utilizados para a geração de Resultados Representativos (fluido de lavage bronco-alveolar e pulmão inteiro), a digestão do sulfato de condroitina deixa o sulfato heparan como a GAG residual primária. Os usuários finais podem precisar adicionar etapas adicionais de digestão, dependendo de seus objetivos experimentais.- Carregar 350 μL de tampão de digestão (acetato de amônio de 50 mM com cloreto de cálcio de 2 mM ajustado ao pH 7.0) à coluna do filtro centrífuga sem tocar na membrana.
- Adicione 5 μL de condroitinase recombinante ABC.
- Coloque o tubo de amostras em um forno de 37 °C e incubar por 1h.
- Vire a coluna e coloque em tubos de coleta devidamente rotulados. Gire por 1 min a 2000 x g.
- Amostras de calor a 80 °C por 15-20 min para inativar condroitinase ABC.
- Desalting e concentração de amostras
- Se necessário, a condroitina da piscina digeriu amostras da etapa 1.9.5 em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
- Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
- Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
- Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
- Inadvertidamente filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e devidamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
- Dessecação
NOTA: Nesta etapa, é necessário dessecação para que as amostras possam ser resuspendidas na menor quantidade possível de água e tampão de corrente.- Coloque as amostras digeridas da condroitina a partir da etapa 1.10.5 diretamente em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize da seguinte forma:
- Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
- Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
- Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar seco durante a noite (pelo menos 40 °C, 0,135 Torr)
2. Eletroforese de gel de poliacrilamida de glicosaminoglycanos isolados e purificados
- Prepare as soluções necessárias para a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) com antecedência(Tabela 1).
NOTA: Selecione a acrilamida por cento da solução de gel de resolução, dependendo do tamanho dos glicosaminoglicanos esperados para estar na amostra. Recomenda-se 15% para a resolução de fragmentos maiores (maiores que 30 subunidades descaramento em comprimento); 22% para fragmentos menores (<20 subunidades descaramento em comprimento). - Coloque o vazio no tanque PAGE. Molde o gel de resolução da seguinte forma: Em tubo de 15 mL, misture 10 mL de solução de gel de resolução, 60 μL de 10% de persulfeto de amônio (deve ser preparado recentemente) e 10 μL de TEMED (adicionar TEMED por último). Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use a pipeta para adicionar rapidamente a solução acima de 10 mL ao. Sobreposição com 2 mL de água desionizada e filtrada e permitir que o gel de resolução polimerize por 30 minutos.
NOTA: O protocolo PAGE a seguir foi otimizado para um sistema PAGE vertical usando de fundição de 13,3 x 8,7cm (largura x comprimento) de 1,0 mm de espessura com um volume total de aproximadamente 12mL. Outros sistemas de podem ser usados, mas podem exigir otimização pelo usuário final. - Após o gel de resolução ter polimerizado totalmente, descarte a água sobreposta e lance o gel de empilhamento da seguinte forma: em um tubo de 15 mL, misture 3 mL da solução de gel de empilhamento, 90 μL de persulfito de amônio de 10% (deve ser preparado recentemente), 3 μL de TEMED (adicionar por último TEMED).
- Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado; preencher para borda. Insira totalmente o pente incluído com a configuração. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 minutos.
- Uma vez que o gel tenha polimerizado, certifique-se de que a tira de fita seja removida da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE.
- Encha as câmaras superior e inferior com tampão de câmara superior e inferior, respectivamente.
- Dissolva as amostras secas da etapa 1.11.4 no volume mínimo necessário de água desionizada e filtrada (no máximo, 50% do volume dos poços no gel PAGE). Misture 1:1 com o tampão de carga da amostra. Carregue as amostras e as "escadas" de oligossacarídeo hs (ver Tabela 1) no gel.
- Pré-executar o gel por 5 min a 100 V. Em seguida, execute o gel a 200 V por 20-25 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 15%) ), 40-50 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 18%)
NOTA: Alguma otimização do tempo de execução de 200 V pode ser necessária. O vermelho fenol migra à frente de oligossacarídeos de heparina que são 2 subunidades de polímeros em comprimento (ou seja, grau de polimerização 2, ou dp2); o azul bromofenol migra antes do dp10-dp14. Os melhores resultados são obtidos quando a tensão é aplicada de tal forma que a faixa vermelha fenol migra quase, mas não completamente, para o fundo do gel. Ajuste o tempo de execução de acordo.
3. Protocolo de coloração de prata
- Prepare todas as soluções necessárias para a coloração de prata com antecedência(Tabela 2).
NOTA: Não toque diretamente no gel PAGE até que ele tenha sido manchado, desenvolvido e colocado em solução stop. Em vez disso, manipule o gel usando ferramentas de plástico ou vidro limpas. O manuseio direto do gel resultará em distorções de impressão digital e outros artefatos visíveis no gel após a coloração. - Uma vez concluída a execução, desmonte o e o extrato de gel em um recipiente limpo, médio-grande, cheio de água desionizada e filtrada.
NOTA: Para evitar manusear diretamente o gel, use a ponta da pipeta ou outro objeto plástico para retirar suavemente o gel da fita enquanto estiver submerso na água. O gel pode ser frágil - manuseie com cuidado.- Descarte a água. Manche o gel na solução de coloração azul alciano por 5 min.
- Descarte a mancha azul alciana. Enxágüe/lave rapidamente 2-3x com água filtrada desionizada até que a maior parte da solução de coloração azul alciano tenha sido removida.
- Deixe des colorigar em água desionizada e filtrada durante a noite no roqueiro. Certifique-se de que há um grande volume de água filtrada e desionizada para garantir que qualquer mancha residual seja totalmente lavada do gel durante a noite.
- Lave gel em 50% de metanol (40 min total, mude a solução 2-3x).
- Lave gel em água desionizada e filtrada por 30 minutos. Descarte a água e repita mais 3 vezes para um total de 2h, substituindo a água cada vez.
- Em um recipiente fresco e limpo, manche o gel por 30 min em solução de coloração de nitrato de prata.
- Enxágüe/lave rapidamente 2-3x em água filtrada desionizada para remover totalmente a solução de coloração de prata.
- Lave por 30 minutos em água desionizada e filtrada. Descarte a água e repita 2x por um total de 90 minutos, substituindo o banho de água cada vez.
- Descarte a água e adicione a solução de desenvolvimento.
- Uma vez adicionada a solução em desenvolvimento, observe cuidadosamente o gel e observe o aparecimento de bandas. Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos.
- Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução de desenvolvimento e lave brevemente com a solução stop.
- Descarte a solução stop lavar e substitua por uma solução de parada fresca. Deixe de molho por 1h em um roqueiro ou agitador.
- Lave em água desionizada e filtrada durante a noite (no entanto, o gel pode ser imageado imediatamente após a lavagem da solução stop).
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Representative Results
O azul alciano é usado para manchar GAGs sulfatos 10; este sinal é amplificado pelo uso de uma mancha de prata subsequente 11. A Figura 1 fornece uma demonstração visual do processo de desenvolvimento de manchas de prata. Como demonstrado, o sinal azul alciano representando GAGs separados por eletroforese é amplificado à medida que o agente em desenvolvimento penetra o gel de poliacrilamida. Normalmente, o processo de desenvolvimento reduzirá os GAGs manchados de prata e azul alciano de forma dependente de densidade, com as bordas de cada banda reduzindo primeiro, enquanto as regiões mais densamente manchadas no centro serão manchadas por último.
Na literatura, o limite relatado de detecção de GAGs utilizando abordagens baseadas em PAGE varia de 0,5-1 μg12,13. Para determinar o limite de detecção usando nossa abordagem, oligosacarídeos de sulfato heparan de diferentes comprimentos de polímero (heparina não fraturada, dp20, dp10, dp6) foram carregados em um gel de poliacrilamida de 22%, depois correu e manchados conforme descrito acima. Cada oligosacarídeo foi carregado duas vezes em duas massas diferentes: 1,0 μg e 0,5 μg. A Figura 2 demonstra que nossa técnica pode detectar facilmente 0,5 μg de GAG purificado. Notavelmente, a heparina não fratizada foi menos facilmente detectada dos quatro oligossacarídeos diferentes testados, provavelmente devido a uma distribuição mais ampla de tamanhos de polímeros que reduz correspondentemente a densidade de cada banda individual.
Para avaliar a eficiência da purificação da GAG a partir de amostras biológicas líquidas, os GAGs foram isolados de duas amostras de lavagem broncoalveolar (BAL). Como mostrado na Figura 3, a primeira amostra marcada como A usada para o isolamento gag foi 1 mL de fluido BAL colhido de um rato 24 h após lipopoliscarida intratraqueal (LPS) (3 mg/kg), administrado para induzir o derramamento epitelial alveolar HS 5. 10 μg de dp6 comercialmente disponível foi adicionado diretamente a este fluido BAL para servir como um controle "spike in" para avaliar a perda de GAGs durante o processo de isolamento. A segunda amostra marcada como B consistiu em 10 mL de fluido BAL agrupado de 3 camundongos que receberam LPS intratracheal (3 mg/kg) 24 h antes, sem espeto de GAG exogenou. Ambas as amostras foram processadas para isolamento gag simultaneamente, e todas as 3 frações eluidas da coluna de troca de íons foram retidas e processadas posteriormente, a fim de determinar se algum GAGs estava presente nas frações de baixa afinidade e lavagem. 2 μg de dp20, dp10 e dp6 heparan sulfate oligossacarídeos foram executados no gel PAGE ao lado dessas amostras para fornecer uma referência pela qual avaliar qualitativamente o tamanho dos GAGs de HS em cada fração eluida, bem como uma referência para comparar a densidade com o controle de 10 μg "spike in" que sofreu isolamento gag.
Para demonstrar o uso desta técnica em tecido sólido, o sulfato heparan foi isolado de um pedaço de 15 mg de pulmão de rato congelado como descrito acima. Durante o processo de isolamento e purificação, a fração de baixa afinidade (0,2 M NaCl) eluipulada da coluna de troca de íons foi retida e processada juntamente com a fração de alta afinidade (2,7 M NaCl) e executada no gel(Figura 4). 2 μg de dp20, dp10 e dp6 hefan sulfate oligosacarídeos foram executados ao lado dessas amostras para fornecer uma referência para o tamanho. Como se pode ver, toda a homogeneidade pulmonar produziu uma grande quantidade de HS isolado, com os menores fragmentos aproximadamente igualando dp10 em tamanho. O enriquecimento relativo dos gaGs de conteúdo ávido de mancha azul/prata alcianos na fração de 2,7 M NaCl demonstra que o sulfato heparan se liga com alta afinidade às colunas de troca de íons e pode ser elucido da coluna com alta especificidade. Toda a homogeneidade pulmonar rendeu uma grande quantidade de sulfato de heparan isolado (fração de 2,7 M NaCl), com os menores fragmentos aproximadamente igualando dp10 em tamanho.
Figura 1: Processo de desenvolvimento de manchas de prata. A coloração azul alciana de heparina não fracionada (UFH) ou oligossacarídeos definidos em tamanho (dp = grau de polimerização) separado por eletroforese é amplificada pela coloração de prata. Da esquerda para a direita: UFH, dp20, dp10, dp6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sensibilidade do gel de poliacrilamida e mancha de prata para a detecção de sulfato de heparan. Oligossacarídeos de sulfato de heparan de diferentes comprimentos (heparina não fractada também conhecida como UFH, dp20, dp10, dp6) estavam em um gel de poliacrilamida de 22% e ran e silver manchado. Cada oligosassacarídeo foi carregado duas vezes em duas massas diferentes: 1,0 μg (bandas mais à esquerda) e 0,5 μg (bandas mais à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Eficiência da purificação da GAG a partir de amostras biológicas líquidas. Os GAGs isolados de duas amostras de lavagem broncoalveolar (BAL), rotulados aqui como "A" e "B", eram executados em um gel de poliacrilamida de 22% e manchados de prata. A amostra A consistiu em 1mL de fluido BAL colhido de um rato 24 h após o tratamento com lipopolícarida intratraqueal de 3 mg/kg (LPS). Foram adicionados 10 μg adicionais de DP6 HS a esta amostra como um controle de "pico de" A amostra B consistiu em 10 mL de fluido BAL agrupado coletado de 3 camundongos 24 h após a administração de LPS. Cada amostra foi executada ao lado de frações da coluna de troca de íons elucidadas com diluentes ("lavagem") ou baixas concentrações de NaCl (0,2 M). 2 μg de dp20, dp10 e dp6 hefate oligosacarídeos foram utilizados como referências de tamanho (bandas mais à esquerda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medir o tamanho de sulfatos heparenses isolados e purificados de um pulmão de camundongo saudável. Teor de sulfato de heparina isolado e purificado a partir de 15 mg de amostra congelada de um pulmão isolado de um rato saudável e executado em um gel de poliacrilamida de 22%. O sulfato heparano foi elucido da coluna de troca de íons com baixas concentrações (0,2 M; fração de baixa afinidade) ou altas concentrações (2,7 M, solução de 16%; fração de alta afinidade) de NaCl. 2 μg de dp20, dp10 e dp6 hefate oligosacarídeos foram utilizados como referências de tamanho (bandas mais à esquerda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| NOTA: Todas as soluções devem ser filtradas (0,22μm) antes de serem utilização. | |||
| Solução | Receita | Composição | Comentários |
| Resolução do amortecedor de execução de gel/câmara inferior (2 L ou 4 L) | Ácido bórico, MW 61.83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Concentração desejada: 0,1 M |
| Base tris, MW 124.14 | 2L: 24,2 g; 4L: | Concentração desejada: 0,1 M | |
| Disódium EDTA MW 336,21 ou dihidrato, MW 372,36 | 2L: 6,7 g ou 7,4 g, respectivamente; 4L 13,4 g ou 14,8 g, respectivamente | Concentração desejada: 0,01 M | |
| Água desionizada | 2L ou 4L | Ajuste o pH para 8.3 após dissolver totalmente os reagentes | |
| Tampão de execução da câmara superior (1 L) | Glicina | 93 g | Concentração desejada: 1 M |
| Base tris, MW 124.14 | 24,2 g | Concentração desejada: 0,2 M | |
| Água desionizada | 1 L | ||
| Resolução de gel, 22% de acrilamida total (500mL) | Acrilamida, MW 71.08 | 100,1 g | Concentração desejada: 20,02% c/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 10 g | Concentração desejada: 2% c/v | |
| Sacarose | 75 g | Concentração desejada: 15% c/v | |
| Resolução do buffer de gel | 500 mL | Trazer para um volume total de 500mL; exigirá menos de 500mL de buffer total | |
| Resolvendo gel, 15% de acrilamida total (400mL) | Acrilamida, MW 71.08 | 56,3 g | Concentração desejada: 14,08% w/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Concentração desejada: 2% c/v | |
| Sacarose | 20,8 g | Concentração desejada: 15% c/v | |
| Resolução do buffer de gel | 400 mL | Trazer para um volume total de 400mL; exigirá menos de 400mL de buffer total | |
| Gel de empilhamento (100 mL) | Acrilamida, MW 71.08 | 4,75 g | Concentração desejada: 4,75% c/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Concentração desejada: 0,25% c/v | |
| Resolução do buffer de gel | 100 mL | Adicione tampão de 80mL e reagentes completos dissolvidos. Em seguida, ajuste o pH para 76,3 com ácido clorídrico, sem saída. Em seguida, traga para um volume total de 100 mL com a resolução de tampão de gel. | |
| Tampão de carregamento de amostras (500 mL) | Sacarose | 250g | Concentração desejada: 50% c/v |
| Phenol vermelho | 500mg | Concentração desejada: 1mg/mL | |
| Azul bromofenol | 250mg | Concentração desejada: 0,5mg/mL | |
| Água desionizada | 500mL | Trazer para um volume total de 500mL; exigirá menos de 500mL de água total | |
| Escada 'escada' derivada de oligocarídeo de heparina (2mL cada) | dp6 | 0,1mg | NOTA: Recomendo o uso de oligossacarídeos derivados de heparina 6 subunidades de polímero em comprimento (também conhecido como grau de polimerização 6, ou dp6) para a menor banda, dp20 para a maior banda, e dp10 para banda média. No entanto, outras combinações podem ser usadas se desejarem. Concentração desejada: 0,05 mg/mL |
| dp10 | 0,1mg | ||
| dp20 | 0,1mg | ||
| Água desionizada | 3mL | Dissolva cada oligosacarídeo em tubos separados com 1mL cada | |
| Tampão de carregamento de amostras | 3mL | Adicione 1mL (mistura 1:1) a cada solução de oligossacarídeo | |
Tabela 1: Soluções necessárias para eletroforese de gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos purificados. Todas as soluções devem ser filtradas (0,22 μm) antes de serem utilização.
| NOTA: Todas as soluções devem ser filtradas (0,22μm) antes de serem utilização. | |||
| Solução | Receita | Composição | Comentários |
| Solução de coloração azul alciana (500mL) | Pó azul alciano 8GX | 2,5g | Concentração desejada: 0,5% c/v |
| Ácido acético glacial v/v de 2% v/v | 500mL | ||
| Mancha de prata (200 mL) | Água desionizada | 192,7 mL | Preparar a solução de manchas fresca; usar dentro de uma semana. |
| Hidróxido de sódio de 7,6M | 2 mL | Para fazer, adicione 3,04 g de pelotas de hidróxido de sódio a 10 mL de água | |
| Hidróxido de amônio | 3,3 mL | ||
| Solução de nitrato de prata 4M | 2 mL | Para fazer, adicione 3,397 g de nitrato de prata a 5 mL de água. Adicione dropwise enquanto mexe para evitar precipitação. | |
| Solução de desenvolvimento (501 mL) | Água desionizada | 500 mL | A solução de desenvolvimento deve ser feita fresca e utilizada dentro de 24 horas. |
| Ácido cítrico de 2,5% | 1 mL | Para fazer, adicione 100mg a 4 mL de água deionizada. O ácido cítrico deve ser fresco. | |
| Formaldeído | 250μL | ||
| Solução stop (500 mL) | Água desionizada | 300 mL | |
| Ácido acético glacial | 20 mL | ||
| Metanol | 90 mL | ||
Tabela 2: Soluções necessárias para a coloração de prata de glicosaminoglículos separados por eletroforese de gel de poliacrlamida. Todas as soluções devem ser filtradas (0,22 μm) antes de serem utilização.
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Discussion
Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG 8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam definir com precisão razoável o tamanho das cadeias de GAG isoladas de amostras biológicas de interesse. Para ser prático, essa técnica deve ser capaz de ser realizada utilizando equipamentos e reagentes de laboratório comuns.
Este protocolo descreve um método para isolar e purificar GAGs de amostras biológicas, separá-los por tamanho via PAGE, e visualizá-los usando a técnica de coloração azul e prata alciana. Embora existam várias maneiras de separar os glicosaminoglicanos por tamanho, nossa abordagem tem vários pontos fortes específicos para a aplicação dessa técnica em laboratórios de ciências da vida. Em primeiro lugar, com um limite de detecção de 0,5 μg, esta técnica é altamente sensível na detecção de GAGs de interesse. Em nossa experiência, mesmo amostras que contenham concentrações relativamente baixas de GAGs (ou seja, amostras de fluido BAL) devem produzir mais do que suficiente gag para detecção usando este método. Embora o rendimento do isolamento e purificação do fluido BAL varie de acordo com a técnica e a mordaça específica de interesse, tem sido nossa experiência que 10 mL de fluido BAL bruto produz HS suficiente para ser detectável usando esta técnica. O rendimento de órgãos sólidos é substancialmente maior, dependendo do tecido colhido, mas é nossa experiência que uma amostra sólida inicial de 10 mgs produzirá amplo HS para detecção usando esta técnica.
É importante notar que a imagem final do gel PAGE manchado irá variar de acordo com as tecnologias de imagem disponíveis para o usuário final. Fotografias digitais do gel podem ser tiradas usando uma série de sistemas diferentes, incluindo numerosos sistemas de documentação de gel disponíveis comercialmente ou uma câmera comercial regular, dependendo do equipamento disponível e da sensibilidade da detecção necessária (tipicamente ditada pela quantidade de amostra carregada no gel). Deve-se notar também que a fonte de luz necessária para a imagem digital deste gel pode variar dependendo da densidade da amostra e do tempo de desenvolvimento necessário durante o processo de coloração. Géis que se desenvolvem rapidamente e produzem bandas manchadas de prata facilmente visíveis a olho nu exigirão transilluminação UV para as melhores imagens, já que a maioria da luz será absorvida por azul alciano não redigido. Géis que requerem tempos de desenvolvimento mais longos (como aqueles com quantidades muito pequenas de amostra) exigirão epi-iluminação ou transilluminação com luz de espectro completo normal, pois este será melhor absorvido pela mancha de prata.
Outra força dessa técnica é que ela é particularmente adaptável aos laboratórios de ciências da vida, devido à sua base na tecnologia PAGE simples, utilizando equipamentos e reagentes comumente disponíveis e adquiridos de forma barata. Embora existam outras abordagens para quantificar o comprimento de polímeros gag isolados (por exemplo, eletroforese capilar), eles normalmente requerem conhecimento e equipamentos que não são comumente disponíveis na maioria dos laboratórios de ciências da vida15,16. A simplicidade dessa abordagem e a natureza relativamente acessível e disponível dos reagentes necessários torna essa técnica prontamente adaptável por pesquisadores de ciências da vida interessados em estudar biologia gag no contexto de seus subcampos dados. Além disso, essa técnica serve como um complemento essencial às técnicas baseadas em espectrometria de massa de detecção de GAGs em tecidos biológicos. Embora as abordagens baseadas em espectrometria de massa sejam capazes de detectar GAGs com alta sensibilidade e discernir diferenças sutis na estrutura a partir de amostras complexas17,devido à natureza da tecnologia não é capaz de distinguir entre polímeros GAG por tamanho. Por essa razão, uma abordagem baseada em PAGE é essencial para divinir o tamanho dos polímeros HS em amostras biológicas de interesse.
É importante ressaltar que existem várias limitações às técnicas descritas neste artigo. A primeira e mais destacada é que, devido à interação carga-carga que são centrais para a reação de coloração azul alciana, esta abordagem é altamente seletiva para GAGs altamente sulfatos e só manchará fracamente moieties mais carregados de forma neutra (por exemplo, ácido hialurônico18). Assim, é provável que essa técnica viés seus resultados para moieties gag mais ácidos. Por essa razão, abordagens complementares para medir o conteúdo de GAG em amostras biológicas de interesse (por exemplo, técnicas baseadas em espectrometria de massa) devem ser utilizadas de forma adjuntiva para fornecer uma imagem mais completa dos GAGs presentes em amostras experimentais. Além disso, para usuários finais especificamente interessados em medir o tamanho do hialuronan, outros descreveram técnicas baseadas em PAGE semelhantes que aproveitam a proteína de ligação de ácido hialurônico biotinilado (HABP) que pode ser adaptável à técnica básica descrita aqui19.
Em resumo, a técnica apresentada neste artigo pode ser usada para isolar, purificar e detectar GAGs de amostras biológicas com grande sensibilidade e especificidade, bem como para medir o comprimento nativo dessas cadeias de polissacarídeos. Essas informações podem ser fundamentais para testar hipóteses sobre interações GAG-ligand devido à importância do comprimento do polímero GAG na determinação da afinidade de ligadura cognato. Essa abordagem tem várias vantagens, mais notavelmente sua relativa simplicidade e adaptabilidade aos laboratórios de pesquisa em ciências da vida, embora seja limitada por seu viés relativo em relação aos moieties gag carregados negativamente. Apesar dessa desvantagem, essa técnica representa uma ferramenta robusta que incentivaria os pesquisadores a estudar o papel dos GAGs na homeostase e na doença dos órgãos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL e EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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