Summary

Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata

Published: February 25, 2021
doi:

Summary

Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.

Abstract

Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.

Introduction

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos1. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célula) quanto trans( ligantes ligados à célula vizinha) processos de sinalização2. Além disso, os GAGs também desempenham papéis críticos como elementos estruturais em tecidos como a membrana glomerular do porão3,o glicocalyx endotelial vascular4 e a glicocalyx epitelialpulmonar 5, e em tecidos conjuntivos tais cartilagem6.

O comprimento das cadeias de polissacarídeos GAG varia substancialmente de acordo com seu contexto biológico e pode ser dinamicamente alongado, cortado e modificado por um sistema regulatório enzimático altamente complexo7. É importante ressaltar que o comprimento das cadeias de polímeros GAG contribui substancialmente para sua afinidade vinculante com ligantes e, posteriormente, para sua função biológica8,9. Por essa razão, a determinação da função de um GAG endógeno requer a valorização de seu tamanho. Infelizmente, ao contrário de proteínas e ácidos nucleicos, existem muito poucas técnicas prontamente disponíveis para detectar e medir GAGs, o que historicamente resultou em uma investigação relativamente limitada sobre os papéis biológicos desta diversificada família polissacarídeo.

Este artigo descreve como isolar e purificar GAGs da maioria dos tecidos biológicos, e, também, descreve como usar a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliar o comprimento dos polímeros isolados com um grau justo de especificidade. Em contraste com outras abordagens glicomicicas altamente complexas (e muitas vezes baseadas em espectrometria de massa), este método pode ser empregado usando equipamentos e técnicas de laboratório padrão. Essa abordagem prática pode, portanto, expandir a capacidade dos investigadores de determinar o papel biológico dos GAGs nativos e sua interação com ligantes contextualmente importantes.

Protocol

Todas as amostras biológicas analisadas neste protocolo foram obtidas a partir de camundongos, sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado. 1. Isolamento de sulfato heparano Delipidação de amostras de tecidoNOTA: A delipidação é um passo opcional para tecidos ricos em gordura. Faça uma mistura de 1:1 de metanol e diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por amostra; pedaços ma…

Representative Results

O azul alciano é usado para manchar GAGs sulfatos 10; este sinal é amplificado pelo uso de uma mancha de prata subsequente 11. A Figura 1 fornece uma demonstração visual do processo de desenvolvimento de manchas de prata. Como demonstrado, o sinal azul alciano representando GAGs separados por eletroforese é amplificado à medida que o agente em desenvolvimento penetra o gel de poliacrilamida. Normalmente, o processo de desenvolvimento redu…

Discussion

Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG 8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL e EPS)

Materials

Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge thermoFisher Scientific 13-100-675 Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP170-100 Electrophoresis grade
Actinase E Sigma Aldrich P5147 Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid) thermoFisher Scientific AC400460100
Ammonium acetate (solid) thermoFisher Scientific A639-500 Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid) thermoFisher Scientific A669S-500 certified ACS
Ammonium persulfate (solid) thermoFisher Scientific BP179-25 electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System ThermoFisher Scientific 10-451-217PKG Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid) thermoFisher Scientific A73-500 Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid) thermoFisher Scientific B392-5
Calcium acetate (solid) ThermoFisher Scientific 18-609-432 Molecular biology grade
Calcium chloride (solid) ThermoFisher Scientific AC349610250 Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) ThermoFisher Scientific 28299
Chondroitinase ABC Sigma Aldrich C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) Bio-Rad 3459901 Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) Bio-Rad 1656019 any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid) thermoFisher Scientific AC610931000 certified ACS
EDTA disodium salt (solid) thermoFisher Scientific 02-002-786 Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid) thermoFisher Scientific A35-500 Certified ACS
Glycine (solid) thermoFisher Scientific G48-500 Electrophoresis grade
Heparanase I/III Sigma Aldrich H3917 From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10) galen scientific HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6) Galen scientific HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20) galen scientific HO20
Hydrochloric acid (liquid) thermoFisher Scientific A466-250
Lyophilizer Labconco 7752020 Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid) thermoFisher Scientific A412-500 Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad 170-8170 Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP171-25 Electrophoresis grade
Phenol red (solid) thermoFisher Scientific P74-10 Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column Vivapure VS-IX01QH24 Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid) thermoFisher Scientific S181-25 certified ACS
Sodium Acetate (solid) ThermoFisher Scientific S210-500 Molecular biology grade
Sodium chloride (solid) thermoFisher Scientific S271-500 Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid) thermoFisher Scientific S392-212
Sucrose (solid) thermoFisher Scientific BP220-1 Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) thermoFisher Scientific BP150-20 Electrophoresis grade
Tris base (solid) thermoFisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff Amicon UFC500324 Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid) ThermoFisher Scientific 29700
Vacufuge Plus Eppendorf 22820001 Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume thermoFisher Scientific 569-0020 Alternative volumes and filter materials acceptable

References

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LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).

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