Summary
Denna rapport beskriver tekniker för att isolera och rena sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) från biologiska prover och en polyakrylamid gel elektrofores strategi för att approximera deras storlek. GAGs bidrar till vävnadsstruktur och påverkar signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer längd bidrar till deras bindande affinitet för konjak ligands.
Abstract
Sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) såsom heparansulfat (HS) och kondroitinsulfat (CS) är allestädes närvarande i levande organismer och spelar en avgörande roll i en mängd grundläggande biologiska strukturer och processer. Som polymerer finns GAGs som en polydisperseblandning som innehåller polysackaridkedjor som kan variera från 4000 Da till väl över 40 000 Da. Inom dessa kedjor finns domäner av sulfation, vilket ger ett mönster av negativ laddning som underlättar interaktion med positivt laddade rester av konjakprotein ligands. Sulferade områden av gags måste vara tillräckligt långa för att möjliggöra dessa elektrostatiska interaktioner. För att förstå gags funktion i biologiska vävnader måste prövaren kunna isolera, rena och mäta storleken på GAGs. Denna rapport beskriver en praktisk och mångsidig polyakrylamid gel elektrofores-baserade teknik som kan utnyttjas för att lösa relativt små skillnader i storlek mellan GAGs isolerade från en mängd olika biologiska vävnadstyper.
Introduction
Glykosaminoglykaner (GAGs) är en mångfaldig familj linjära polysackarider som är ett allestädes närvarande element i levande organismer och bidrar till många grundläggande fysiologiska processer1. GAGs såsom heparan sulfat (HS) och kondroitin sulfat (CS) kan sulferas i distinkta positioner längs polysackaridkedjan, vilket ger geografiska domäner av negativ laddning. Dessa GAGs, när de är bundna till cell-ytproteiner som kallas proteoglykaner, projicerar i det extracellulära utrymmet och binder till konjak ligands, vilket möjliggör reglering av både cis- (ligand fäst vid samma cell) och trans- (ligand fäst vid angränsande cell) signaleringsprocesser2. Vidare utför GAGs också kritiska roller som strukturella element i vävnader som glomerulärtkällarmembran 3, vaskulär endotel glycocalyx4 och pulmonell epitelial glykocalyx5, och i bindväv sådan brosk6.
Längden på GAG-polysackaridkedjor varierar avsevärt beroende på dess biologiska sammanhang och kan dynamiskt förlängas, klyvas och modifieras av ett mycket komplext enzymatiskt regleringssystem7. Viktigt är att längden på GAG-polymerkedjor bidrar väsentligt till deras bindande affinitet för ligands och därefter till deras biologiska funktion8,9. Av denna anledning kräver bestämning av funktionen hos en endogen GAG uppskattning av dess storlek. Till skillnad från proteiner och nukleinsyror finns det tyvärr mycket få lättillgängliga tekniker för att upptäcka och mäta god redovisningssed, vilket historiskt sett har resulterat i en relativt begränsad undersökning av de biologiska rollerna för denna mångskiftande polysackaridfamilj.
Denna artikel beskriver hur man isolerar och renar GAGs från de flesta biologiska vävnader, och beskriver också hur man använder polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) för att utvärdera längden på de isolerade polymererna med en rimlig grad av specificitet. I motsats till andra, mycket komplexa (och ofta masspektrometribaserade) glykemiska metoder kan denna metod användas med hjälp av standard laboratorieutrustning och tekniker. Detta praktiska tillvägagångssätt kan därför utöka utredarnas förmåga att bestämma den biologiska rollen för inhemska god redovisningssed och deras interaktion med kontextuellt viktiga ligands.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla biologiska prover som analyserades i detta protokoll erhölls från möss, enligt protokoll som godkänts av University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparan sulfat isolering
- Delipidation av vävnadsprover
OBS: Delipidation är ett valfritt steg för fettrika vävnader.- Gör en 1:1 blandning av metanol och diklormetan. Bered cirka 500 μL per prov; större vävnadsbitar kan kräva upp till 1 ml.
- Placera varje vävnadsprov i en liten glasbehållare med lock för delipidation.
OBS: Provmassan kan variera beroende på vävnad av intresse och experimentella behov. 50 mg eller mindre är vanligtvis tillräckligt för tillräcklig GAG-avkastning, men viss optimering kan krävas av slutanvändaren. - Tillsätt 500 μL metanol:diklormetanlösning till varje glasbehållare och blanda. Se till att alla fasta vävnadsprover är helt nedsänkta i lösningsmedel.
OBS: Använd serologiska pipetter eller koniska plaströr för att blanda och hantera metanol/diklormetanlösningen. annan plast kan lösas upp. - Placera proverna på en skakapparat (i säkrat rack) i en kemisk rökhuv och rör om försiktigt i 1 timme.
- Omrör proverna så att de blandas och centrifugeras vid 17 000 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Pipett ut den organiska lösningsmedelsfraktionen (supernatant). Detta är lipidfraktionen - den innehåller inte GAGs och kan kasseras.
OBS: Försök att inte störa vävnaden eftersom små bitar kan gå förlorade. Det är att föredra att lämna en del av det organiska skiktet i provbehållaren, snarare än att riskera provförlusten. - Lämna glasbehållarens lock öppet och låt det avdunsta över natten i huven. Byt rör för nästa steg eftersom dessa rör inte kommer att överleva ytterligare bearbetning.
- När lösningsmedelsblandningen har avdunstat helt, fortsätt till mekanisk sönderfall (om restprovet är >50 mg) eller Actinase E-rötning (< 50 mg).
- Mekanisk sönderdelning av fast vävnad (frivillig uppgift; för större vävnadsprover)
OBS: De flesta mindre bitar av fast vävnad (cirka 50 mg eller mindre) bör lösas upp helt under matsmältningssteget. Större prover kommer dock att kräva mekanisk sönderfall.- Blixtfrysa prover av intresse genom att placera dem i ett polypropylenrör av lämplig storlek och placera det slutna röret i flytande kväve. Låt provet frysa tills det är helt fast.
- Använd en ren mortel och mortel, slipa frysta prover till en pulverliknande konsistens.
- Fortsätt direkt till Actinase E-matsmältningen (steg 1.4).
- Provsaltning och koncentration
OBS: Detta är ett valfritt steg och krävs endast för utspädda vätskevävnadsprover (t.ex. bronchoalveolär lavagevätska (BALF) eller plasma).- Samla flytande prover i lämpliga försöksgrupper (t.ex. genom biologisk replikat eller experimentell grupp)
- Placera den totala provvolymen i en 500 μL centrifugalfilterkolonn med en molekylviktsskärning (MWCO) på 3 000 Da.
- Snurra i 30 min vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Upprepa vid behov om önskad provvolym överstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Tvätta varje kolonn 3x med 400 μL avjoniserat, filtrerat vatten. Kassera flödet.
- Vänd filtret och snurra i 1 min vid 2 000 x g i färska, lämpligt märkta uppsamlingsrör. Frys vid -80 °C eller fortsätt till nästa steg.
- Actinase E matsmältning
OBS: Detta steg krävs för att smälta och i slutändan ta bort proteinkontaminanter från ditt prov.- Blanda proverna 1:1 med rekombinanta Actinase E till önskad koncentration på 10 mg/ml. Tillsätt lämplig volym på 10x matsmältningsbuffertkoncentrat. Önskad slutlig koncentration: 0,005 M kalciumacetat och 0,01 M natriumacetat, pH 7,5. Till exempel: 190 μL flytande prov, 190 μL 20 mg/ml Aktinas E, 20 μL 0,05 M kalciumacetat, 0,1 M natriumacetat.
- Agitera prover försiktigt för att blanda och smält sedan i 48-72 h vid 55 °C (upp till 7 dagar för hel vävnad).
- Värm till 80 °C i 15-20 min för att värma inaktivera Actinase E.
- Frys provet vid -80 °C eller fortsätt att steg 1.5.
- Provsaltning och koncentration
OBS: Om en låg massa av GAG av intresse förväntas i det biologiska provet, eller om bevarande av förbrukningsbara reagenser (dvs. centrifugalfilterkolonner) är önskvärt, kan prover slås samman för att producera ett enda koncentrat per försöksgrupp (t.ex. genom biologisk replikat eller experimentell grupp).- Placera den totala provvolymen i en 500 μL centrifugalfilterkolonn med en MWCO på 3 000 Da.
- Snurra i 30 min vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Upprepa vid behov om önskad provvolym överstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Tvätta varje kolonn 3x med 400 μL avjoniserat, filtrerat vatten. Kassera flödet.
- Invertera filter och snurra i 1 min vid 2 000 x g i färska, lämpligt märkta uppsamlingsrör (ingår vanligtvis i centrifugalfilterpelarna). Frys vid -80 °C eller fortsätt till nästa steg.
- Torkning
- Placera antingen de upplösta proverna från steg 1.5.5 i en rotationsvakuumkoncentrator över natten eller frys proverna enligt nedan.
- Frys proverna noggrant antingen över natten i -80 °C eller genom att doppa i flytande kväve.
- Genomborra provlocken med en 18 G nål och placera i lyofilikammaren. Tillsätt pappershanddukar för packning efter behov.
- Fäst fryskammaren på frysmedlet och frys torrt över natten (minst -40 °C, 0,135 Torr)
- Kolumn för katjonutbyte
- Återanvända uttorkade prover i upp till 400 μL 8 M urea, 2% CHAPS-lösning (eller, om man slår samman prover, återanvänd till ett max av (400/n) μL, där n = antalet prover i önskad pool. Använd så lite av tvättmedelslösningen som möjligt.
- Balansera katjonutbyteskolonnen (IEX) med 400 μL 8 M urea, 2% CHAPS-lösning. Snurra i 5 min vid 2 000 x g vid rumstemperatur.
- Ladda 400 μL prov/poolade prover i IEX-kolumnen. Snurra i 5 min vid 2 000 x g.
- Tvätta 3x med 400 μL 8 M urea, 2% CHAPS-lösning. Snurra i 5 min vid 2 000 x g varje gång.
- Elute 3x med 400 μL på 0,2 M NaCl. Snurra i 5 min vid 2 000 x g vardera. Detta är den låg affinitetsfraktion - detta kan behållas för kvalitetskontrolländamål om så önskas.
- Elute 3x med 400 μL på 2,7 M (16%) NaCl. Snurra i 5 min vid 2 000 x g vardera. Denna fraktion kommer att innehålla de isolerade glykosaminoglykanerna av intresse - behåll allt!
- För att avsalta varje eluterad fraktion, tillsätt metanol upp till 80 volymprocent och inkubera vid 4 °C över natten. Snurra varje prov i 5 min vid 2 000 x g. Återvinn de fasta resterna eftersom detta är torkad de-saltad glykosaminoglykan.
OBS: Alternativt, hoppa över detta steg och fortsätt till steg 1.8 för att avsalta eluatet utan metanol.
- Provsaltning och koncentration
- Vid behov, poola eluterade fraktioner (från 1,7,6) till lämpliga försöksgrupper (t.ex. genom biologisk replikat eller experimentell grupp).
- Placera den totala provvolymen i en 500 μL centrifugalfilterkolonn med en MWCO på 3 000 Da.
- Snurra i 30 min vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Upprepa vid behov om önskad provvolym överstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Tvätta varje kolonn 3x med 400 μL avjoniserat, filtrerat vatten. Kassera flödet. Fortsätt direkt till steg 1.9.
- Kolndroitin matsmältning
Obs: Syftet med detta steg är att ta bort gags som inte är av intresse för slutanvändaren. I detta fall används chondroitinase för att ta bort kondroitin. I de vävnader som används för att generera representativa resultat (broncho-alveolar lavagevätska och hela lungan), rötning chondroitin sulfat lämnar heparan sulfat som den primära rest GAG. Slutanvändare kan behöva lägga till ytterligare matsmältningssteg beroende på deras experimentella mål.- Ladda 350 μL rötbuffert (50 mM ammoniumacetat med 2 mM kalciumklorid justerat till pH 7.0) till centrifugalfilterkolonnen utan att röra membranet.
- Tillsätt 5 μL rekombinant kondroitinas ABC.
- Placera provröret i en ugn på 37 °C och inkubera i 1 timme.
- Vänd kolonnen och placera den i lämpligt märkta uppsamlingsrör. Snurra i 1 min vid 2000 x g.
- Värm proverna till 80 °C i 15-20 min för att inaktivera chondroitinase ABC.
- Provsaltning och koncentration
- Vid behov smälte poolkondroitinprover från steg 1.9.5 till lämpliga försöksgrupper (t.ex. genom biologisk replikat eller experimentell grupp)
- Placera den totala provvolymen i en 500 μL centrifugalfilterkolonn med en MWCO på 3 000 Da.
- Snurra i 30 min vid 14 000 x g vid rumstemperatur. Upprepa vid behov om önskad provvolym överstiger centrifugalfilterkolonnens kapacitet.
- Tvätta varje kolonn 3x med 400 μL avjoniserat, filtrerat vatten. Kassera flödet.
- Invertera filtret och snurra i 1 min vid 2 000 x g i färska, lämpligt märkta uppsamlingsrör. Frys vid -80 °C eller fortsätt till nästa steg.
- Torkning
OBS: I det här steget är uttorkning nödvändig så att proverna kan återanvändas i minsta möjliga mängd vatten och löpbuffert.- Placera antingen chondroitin smältprover från steg 1.10.5 direkt i en rotationsvakuumkoncentrator över natten eller lyofiliisera enligt följande:
- Frys proverna noggrant antingen över natten i -80 °C eller genom att doppa i flytande kväve.
- Genomborra provlocken med en 18 G nål och placera i lyofilikammaren. Tillsätt pappershanddukar för packning efter behov.
- Fäst frysskyddskammaren på frysmedlet och frys torrt över natten (minst 40 °C, 0,135 Torr)
2. Polyakrylamidgelelektrofores av isolerade och renade glykosaminoglykaner
- Förbered lösningar som är nödvändiga för elektrofores av polyakrylamidgel (PAGE) i förväg (tabell 1).
OBS: Välj den procent akrylamid som löse gellösning beroende på storleken på de glykosaminoglykaner som förväntas finnas i provet. 15% rekommenderas för att lösa större fragment (större än 30 disackaridunderenheter i längd); 22% för mindre fragment (<20 disackaridunderenheter i längd). - Placera den tomma kassetten i PAGE-tanken. Gjuta den lösande gelen enligt följande: Blanda 10 ml lösningsgel i 15 ml, 60 μL 10 % ammoniumpersulfat (måste beredas ny) och 10 μL TEMED (tillsätt TEMED sist). Vänd försiktigt röret 2-3x. Använd pipetten för att snabbt lägga till ovanstående 10 ml-lösning i kassetten. Överlägg med 2 ml avjoniserat, filtrerat vatten och låt den lösande gelén polymerisera i 30 min.
OBS: Följande SID-protokoll har optimerats för ett vertikalt SID-system med 13,3 x 8,7 cm (bredd x längd) 1,0 mm tjocka gjutkassetter med en total volym på cirka 12 mL. Andra kassettsystem kan användas men kan kräva optimering av slutanvändaren. - När den lösande gelén har polymeriserats helt, kassera det överlagda vattnet och gjuta staplingsgelen enligt följande: blanda 3 ml av staplingsgellösningen i ett 15 ml-rör, 90 μL 10 % ammoniumpersulfat (måste beredas ny), 3 μL TEMED (tillsätt TEMED sist).
- Vänd försiktigt röret 2-3x. Använd en pipett för att snabbt lägga till staplingsgellösningen över den stelnade lösningsgelen; fyll kassett till brädde. Sätt in kammen som medföljer uppsättningen helt. Låt staplingsgelen polymerisera i 30 min.
- När gelén har polymeriserats, se till att tejpremsan avlägsnas från botten av kassetten och placera kassetten tillbaka i PAGE-tankens enhet.
- Fyll de övre respektive nedre kamrarna med övre respektive nedre kammarbuffert.
- Lös upp de torkade proverna från steg 1.11.4 i den minsta nödvändiga volymen av avjoniserat, filtrerat vatten (högst 50 % av volymen av brunnarna i PAGE-gelén). Blanda 1:1 med provinläsningsbuffert. Ladda proverna och HS-oligosackariden "stegar" (se tabell 1)i gelén.
- Förkör gelén i 5 min vid 100 V. Kör sedan gelén på 200 V i 20-25 min (för en 15% polyakrylamidlösningsgel), 40-50 min (för en 18% polyakrylamidlösningsgel), 90-100 min (för 22% polyakrylamidlösningsgel).
OBS: Viss optimering av körtiden på 200 V kan vara nödvändig. Fenolröd migrerar före heparin oligosaccharides som är 2 polymerunderenheter i längd (dvs. grad av polymerisation 2 eller dp2); bromophenol blå migrerar före dp10-dp14. Bästa resultat erhålls när spänningen appliceras så att fenolrött band migrerar nästan, men inte riktigt, till botten av gelén. Justera körtiden i enlighet därmed.
3. Protokoll för silverfärgning
- Förbered alla lösningar som behövs för silverfärgning i förväg (tabell 2).
OBS: Rör inte SID-gelén direkt förrän den har färgats, utvecklats och placerats i stopplösning. Manipulera istället gelén med rena plast- eller glasverktyg. Direkt hantering av gelén resulterar i fingertrycksförvrängningar och andra synliga artefakter på gelén efter färgning. - När körningen är klar demonterar du kassetten och extraherar gelen i en ren, medelstor behållare fylld med avjoniserat, filtrerat vatten.
OBS: För att undvika direkt hantering av gelén, använd pipettspets eller annat plastföremål för att försiktigt skala bort gelén från kassetten medan den är nedsänkt i vatten. Gel kan vara bräcklig - hantera försiktigt.- Kassera vattnet. Färga gelén i alciansk blå färglösning i 5 min.
- Kassera alcisk blå fläck. Skölj/tvätta snabbt 2-3x med avjoniserat, filtrerat vatten tills det mesta av den alciska blå färgningslösningen har tagits bort.
- Låt avfärga i avjoniserat, filtrerat vatten över natten på vippen. Se till att det finns gott om avjoniserat, filtrerat vatten för att säkerställa att eventuella kvarvarande fläckar tvättas helt av gelén över natten.
- Tvätta gel i 50% metanol (40 min totalt, byt lösning 2-3x).
- Tvätta gel i avjoniserat, filtrerat vatten i 30 min. Kassera vatten och upprepa 3 gånger till för totalt 2 timmar och byt ut vattnet varje gång.
- I en färsk, ren behållare, färga gelén i 30 min i silvernitratfärgningslösning.
- Skölj/tvätta snabbt 2-3x i avjoniserat, filtrerat vatten för att helt ta bort silverfärgningslösningen.
- Tvätta i 30 min i avjoniserat, filtrerat vatten. Kassera vatten och upprepa 2x i totalt 90 minuter och byt ut vattenbadet varje gång.
- Kassera vatten och tillsätt utvecklingslösning.
- När du har tillsatt lösningen, observera försiktigt gelén och titta på utseendet på band. Beroende på fläckens kvalitet och massan på det laddade provet kan utvecklingen ta allt från några sekunder till flera minuter.
- Så snart de önskade banden är synliga, kassera omedelbart utvecklingslösningen och tvätta kort med stopplösning.
- Kassera stopplösningstvätten och byt ut den mot en ny stopplösning. Låt suga i 1 timme på en vipp eller shaker.
- Tvätta i avjoniserat, filtrerat vatten över natten (dock kan gelén avbildas omedelbart efter stopplösningstvätt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcian blå används för att färga sulferade GAGs 10; denna signal förstärks med hjälp av en efterföljande silverfläck 11. Figur 1 ger en visuell demonstration av silverfärgningsprocessen. Som visats förstärks den alciensblå signalen som representerar GAGs åtskilda av elektrofores när utvecklingsmedlet tränger in i polyakrylamidgelen. Vanligtvis kommer utvecklingsprocessen att minska silver och alciansk blåfärgade GAGs på ett densitetsberoende sätt, med kanterna på varje band som minskar först medan de mer tätt färgningsregionerna i mitten kommer att fläcka sist.
I litteraturen varierar den rapporterade gränsen för upptäckt av GAGs med hjälp av PAGE-baserade metoder från 0,5-1 μg12,13. För att bestämma detektionsgränsen med vårt tillvägagångssätt laddades heparansulfat oligosaackarider av olika polymerlängder (ofraktionerad heparin, dp20, dp10, dp6) på en 22% polyakrylamidgel och sprang sedan och färgade enligt beskrivningen ovan. Varje oligosackarid laddades två gånger vid två olika massor: 1,0 μg och 0,5 μg. Figur 2 visar att vår teknik ganska lätt kan upptäcka 0,5 μg renat GAG. Noterbart var att ofraktionerad heparin minst lätt upptäcktes av de fyra olika oligosaackarider som testats, sannolikt på grund av en bredare fördelning av polymerstorlekar som på motsvarande sätt minskar densiteten för varje enskilt band.
För att bedöma effektiviteten av GAG rening från flytande biologiska prover isolerades GAGs från två bronchoalveolar lavage (BAL) prover. Som visas i figur 3var det första provet märkt som A som används för GAG-isolering 1 ml BAL-vätska skördat från en mus 24 timmar efter intratrakeal lipopolysackarid (LPS) (3 mg/kg), administrerat för att inducera alveolär epitelial HS-utsöndring 5. 10 μg kommersiellt tillgänglig dp6 tillsattes direkt till denna BAL-vätska för att fungera som en "spik i" kontroll för att bedöma förlust av god redovisningssed under isoleringsprocessen. Det andra provet märkt som B bestod av 10 ml BAL-vätska som poolats från 3 möss som fick intratrakeal LPS (3 mg/kg) 24 timmar tidigare, utan exogen GAG-spikning. Båda proverna bearbetades för GAG isolering samtidigt, och alla 3 fraktioner som framkallades från jon utbyte kolumnen behölls och vidare bearbetas för att avgöra om några GAGs var närvarande i låg affinitet och tvätta fraktioner. 2 μg kommersiellt inköpta dp20-, dp10- och dp6 heparansulfatoligosackarider i PAGE-gelen tillsammans med dessa prover för att ge en referens för att kvalitativt bedöma storleken på HS GAGs i varje eluterad fraktion, samt en hänvisning för att jämföra densiteten med den 10 μg "spik i" kontroll som genomgick GAG-isolering.
För att visa användningen av denna teknik på fast vävnad isolerades heparan sulfat från en 15 mg bit frusen mus lunga som beskrivs ovan. Under isolerings- och reningsprocessen eluterades den låga affinitetsfraktionen (0,2 M NaCl) från jonutbyteskolonnen och bearbetades tillsammans med den höga affiniteten (2,7 M NaCl) fraktionen och körs på gelén (figur 4). 2 μg kommersiellt inköpta dp20-, dp10- och dp6 heparansulfatoligosackarider togs tillsammans med dessa prover för att ge en referens för storlek. Som kan ses gav hela lunghom homogenatet en stor mängd isolerade HS, med de minsta fragmenten ungefär lika med dp10 i storlek. Den relativa anrikningen av Alcian blue/silver stain avid content GAGs i 2,7 M NaCl fraktionen visar att heparan sulfat binder med hög affinitet till jon utbyte kolumner och kan eluted av kolumnen med hög specificitet. Hela lung homogenatet gav en stor mängd isolerade heparan sulfat (2,7 M NaCl fraktion), med de minsta fragmenten ungefär lika med dp10 i storlek.
Figur 1:Utvecklingsprocessen för silverfläckar. Alcian blå färgning av unfractionated heparin (UFH) eller storleksdefinierade oligosaccharides (dp = grad av polymerisation) separeras av elektrofores förstärks av silver färgning. Från vänster till höger: UFH, dp20, dp10, dp6. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Känslighet för polyakrylamidgel och silverfläck för detektion för heparansulfat. Heparan sulfat oligosaccharides av olika längder (unfractionated heparin aka UFH, dp20, dp10, dp6) var på en 22% polyakrylamid gel och sprang och silver färgas. Varje oligosackarid laddades två gånger vid två olika massor: 1,0 μg (vänster band) och 0,5 μg (de mest höger band). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Effektiviteten av GAG-rening från flytande biologiska prover. GAGs isolerade från två bronchoalveolar lavage (BAL) prover, märkt här som "A" och "B", sprangs på en 22% polyakrylamid gel och silver färgas. Prov A bestod av 1mL BAL-vätska skördad från en mus 24 timmar efter behandling med 3 mg/kg intratrakeal lipopolysackarid (LPS). Ytterligare 10 μg dp6 HS tillsattes i detta prov som en "spik i" kontroll. Prov B bestod av 10 ml poolad BAL-vätska som samlats in från 3 möss 24 timmar efter administrering av LPS. Varje prov togs tillsammans med fraktioner från jonutbyteskolonnen som framkallades med antingen spädning ("tvätt") eller låga koncentrationer av NaCl (0,2 M). 2 μg kommersiellt köpta dp20-, dp10- och dp6 heparansulfatoligosackarider användes som storleksreferenser (vänster band). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Mätning av storleken på heparansulfater isolerad och renad från en frisk muslunga. Heparin sulfat innehåll isoleras och renas från 15 mg fryst prov av en lunga isolerad från en frisk mus och kör på en 22% polyakrylamid gel. Heparan sulfat eluteds från jon utbyte kolumnen med antingen låga koncentrationer (0,2 M; låg affinitet fraktion) eller höga koncentrationer (2,7 M, 16% lösning; hög affinitet fraktion) av NaCl. 2 μg kommersiellt köpta dp20-, dp10- och dp6 heparansulfatoligosackarider användes som storleksreferenser (vänster band). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| OBS: Alla lösningar måste filtreras (0,22 μm) före användning. | |||
| Lösning | Recept | Sammansättning | Kommentarer |
| Lösa gel/nedre kammarens löpbuffert (2 L eller 4 L) | Borsyra, MW 61,83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Önskad koncentration: 0,1 M |
| Tris bas, MW 124.14 | 2L: 24,2 g; 4L: | Önskad koncentration: 0,1 M | |
| Disodium EDTA MW 336,21 eller dihydrat, MW 372,36 | 2L: 6,7 g respektive 7,4 g. 4L 13,4 g respektive 14,8 g | Önskad koncentration: 0,01 M | |
| Avjoniserat vatten | 2L eller 4L | Justera pH till 8,3 efter helt upplösande reagenser | |
| Övre kammarens löpbuffert (1 L) | Glycin | 93 g | Önskad koncentration: 1 M |
| Tris bas, MW 124.14 | 24,2 g | Önskad koncentration: 0,2 M | |
| Avjoniserat vatten | 1 L (på 1 L) | ||
| Lösning gel, 22% total akrylamid (500mL) | Akrylamid, MW 71,08 | 100,1 g | Önskad koncentration: 20.02% w/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154.17) | 10 g | Önskad koncentration: 2% w/v | |
| Sackaros | 75 g | Önskad koncentration: 15% w/v | |
| Lösa gelbuffert | 500 ml | Ta till en total volym på 500mL; kommer att kräva mindre än 500 mL buffertsumma | |
| Lösning gel, 15% total akrylamid (400mL) | Akrylamid, MW 71,08 | 56,3 g | Önskad koncentration: 14,08% w/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Önskad koncentration: 2% w/v | |
| Sackaros | 20,8 g | Önskad koncentration: 15% w/v | |
| Lösa gelbuffert | 400 ml | Ta till en total volym på 400mL; kommer att kräva mindre än 400 mL buffertsumma | |
| Staplingsgel (100 ml) | Akrylamid, MW 71,08 | 4,75 g | Önskad koncentration: 4,75% w/v |
| N,N'-metylen-bis-akrylamid (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Önskad koncentration: 0,25% w/v | |
| Lösa gelbuffert | 100 ml | Tillsätt 80mL buffert och lös upp reagenser. Justera sedan pH till 76,3 med saltsyra, droppe. Ta sedan till en total volym på 100 ml med lös gelbuffert. | |
| Provbelastningsbuffert (500 ml) | Sackaros | 250g | Önskad koncentration: 50% w/v |
| Fenol röd | 500mg | Önskad koncentration: 1mg/ml | |
| Bromophenol blå | 250mg | Önskad koncentration: 0,5 mg/ml | |
| Avjoniserat vatten | 500mL | Ta till en total volym på 500mL; kommer att kräva mindre än 500 mL vatten totalt | |
| Heparin härledd oligosakarid "stege" (2mL vardera) | dp6 (på 7)10 | 0.1mg | OBS: Rekommendera att använda heparin härledda oligosaccharides 6 polymerunderenheter i längd (aka grad av polymerisation 6, eller dp6) för det minsta bandet, dp20 för det största bandet och dp10 för mellanband. Andra kombinationer kan dock användas om så önskas. Önskad koncentration: 0,05 mg/ml |
| dp10 (på dp10) | 0.1mg | ||
| dp20 (på dp20) | 0.1mg | ||
| Avjoniserat vatten | 3mL | Lös upp varje oligosackarid i separata rör med 1 mL vardera | |
| Exempel på inläsningsbuffert | 3mL | Tillsätt 1 mL (1:1 blandning) till varje oligosackaridlösning | |
Tabell 1: Lösningar som krävs för polyakrylamidgelelektrofores av renade glykosaminoglykaner. Alla lösningar måste filtreras (0,22 μm) före användning.
| OBS: Alla lösningar måste filtreras (0,22 μm) före användning. | |||
| Lösning | Recept | Sammansättning | Kommentarer |
| Alcian blå färgningslösning (500mL) | Alcianblå 8GX pulver | 2,5 g | Önskad koncentration: 0,5% w/v |
| 2% v/v glacial ättiksyra | 500mL | ||
| Silverfläck (200 ml) | Avjoniserat vatten | 192,7 ml | Förbered fläcklösningen fräsch; användning inom en vecka. |
| 7.6M natriumhydroxid | 2 ml | För att göra, tillsätt 3,04 g natriumhydroxidpellets till 10 ml vatten | |
| Ammoniumhydroxid | 3,3 ml | ||
| 4M silvernitratlösning | 2 ml | För att göra, tillsätt 3.397 g silvernitrat till 5 ml vatten. Tillsätt droppevis under omrörning för att undvika nederbörd. | |
| Utveckla lösning (501 ml) | Avjoniserat vatten | 500 ml | Utvecklingslösningen måste göras färsk och användas inom 24 timmar. |
| 2,5% w/v citronsyra | 1 ml | För att göra, tillsätt 100mg till 4 mL avjoniserat vatten. Citronsyra måste göras färsk. | |
| Formaldehyd | 250 μL | ||
| Stopplösning (500 ml) | Avjoniserat vatten | 300 ml | |
| Glacial ättiksyra | 20 ml | ||
| Metanol | 90 ml | ||
Tabell 2: Lösningar som krävs för silverfärgning av glykosaminoglykaner åtskilda av polyakrlamidgelelektrofores. Alla lösningar måste filtreras (0,22 μm) före användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
God redovisningssed spelar en central roll i många olika biologiska processer. En av de viktigaste funktionerna hos sulferade GAGs (som HS och CS) är att interagera med och binda till ligands, vilket kan ändra nedströms signalfunktioner. En viktig determinant för GAG-bindande affinitet till konjak ligands är längden på GAG-polymerkedjan 8,9,14. Därför är det viktigt att forskare med rimlig precision kan definiera storleken på GAG-kedjor som isolerats från biologiska prover av intresse. För att vara praktisk bör denna teknik kunna utföras med hjälp av gemensam laboratorieutrustning och reagenser.
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera och rena GAGs från biologiska prover, att separera dem efter storlek via PAGE, och att visualisera dem med hjälp av alcian blå och silver färgning teknik. Medan det finns flera sätt att separera glykosaminoglykaner efter storlek, har vårt tillvägagångssätt flera styrkor som är specifika för tillämpningen av denna teknik i life science-laboratorier. För det första, med en detektionsgräns på 0,5 μg, är denna teknik mycket känslig för att upptäcka god redovisningssed av intresse. Enligt vår erfarenhet bör även prover som innehåller relativt låga koncentrationer av GAGs (dvs. BAL-vätskeprover) ge mer än tillräckligt med GAG för detektion med denna metod. Även om utbytet från isolering och rening av BAL-vätska kommer att variera beroende på teknik och specifika GAG av intresse, har det varit vår erfarenhet att 10 ml rå BAL-vätska ger tillräckligt med HS för att kunna upptäckas med denna teknik. Utbytet från fasta organ är betydligt högre, beroende på den skördade vävnaden, men det är vår erfarenhet att ett första fast prov på 10 mg kommer att ge gott om HS för detektion med denna teknik.
Det är viktigt att notera att den slutliga avbildningen av den färgade PAGE-gelén kommer att variera beroende på den bildteknik som är tillgänglig för slutanvändaren. Digitala fotografier av gelén kan tas med hjälp av ett antal olika system, inklusive många kommersiellt tillgängliga geldokumentationssystem eller en vanlig kommersiell kamera, beroende på tillgänglig utrustning och känsligheten för detektion som krävs (vanligtvis dikteras av mängden prov som laddas på gelén). Det bör också noteras att den ljuskälla som krävs för att digitalt avbilda denna gel kan variera beroende på provets densitet och den mängd utvecklingstid som krävs under färgningsprocessen. Geler som utvecklas snabbt och producerar silverfärgade band som är lätt synliga för blotta ögat kommer att kräva UV-transillumination för de bästa bilderna, eftersom majoriteten av ljuset kommer att absorberas av oredovisad alcisk blå. Geler som kräver längre utvecklingstider (t.ex. de med mycket små mängder prov) kommer att kräva antingen epi-belysning eller transillumination med normalt fullt spektrumljus, eftersom detta bäst absorberas av silverfläcken.
En annan styrka med denna teknik är att den är särskilt anpassningsbar till life science-laboratorier, på grund av dess grund i enkel PAGE-teknik, med hjälp av utrustning och reagenser som är allmänt tillgängliga och billigt förvärvade. Medan det finns andra metoder för att kvantifiera längden på isolerade GAG-polymerer (t.ex. kapillärelektrofores), kräver de vanligtvis både kunskap och utrustning som inte är allmänt tillgänglig i de flesta biovetenskapligalaboratorier 15,16. Enkelheten i detta tillvägagångssätt och den relativt överkomliga och tillgängliga karaktären hos de reagenser som krävs gör denna teknik lätt anpassningsbar av biovetenskapsforskare som är intresserade av att studera GAG-biologi i samband med deras givna delfält. Dessutom fungerar denna teknik som ett viktigt komplement till masspektrometribaserade tekniker för att upptäcka god redovisningssed i biologiska vävnader. Medan masspektrometribaserade metoder kan upptäcka GAGs med hög känslighet och urskilja subtila skillnader i struktur från komplexaprover 17, på grund av teknikens natur kan den inte skilja mellan GAG-polymerer efter storlek. Av denna anledning är ett PAGE-baserat tillvägagångssätt avgörande för att minska storleken på HS-polymerer i biologiska prover av intresse.
Det är viktigt att notera att det finns flera begränsningar för de tekniker som beskrivs i detta dokument. Den första och mest framträdande är att på grund av laddnings-laddningsinteraktionen som är centrala för alciansk blå färgningsreaktion är detta tillvägagångssätt mycket selektivt för högt sulferade GAGs och kommer endast svagt att fläcka mer neutralt laddade moieties (t.ex. hyaluronsyra18). Således kommer denna teknik sannolikt att vinkla sina resultat mot mer sura GAG-moieties. Av denna anledning bör kompletterande metoder för att mäta GAG-halten i biologiska urval av intresse (t.ex. masspektrometribaserade tekniker) användas i tillägg för att ge en mer fullständig bild av de allmänna redovisningsprinciper som finns i försöksprov. För slutanvändare som är särskilt intresserade av att mäta hyauronans storlek har andra dessutom beskrivit liknande PAGE-baserade tekniker som utnyttjar biotinylerat hyaluronsyrabindande protein (HABP) som kan anpassas till den grundläggande teknik som beskrivs här19.
Sammanfattningsvis kan tekniken som presenteras i denna artikel användas för att isolera, rena och upptäcka GAGs från biologiska prover med stor känslighet och specificitet samt för att mäta den ursprungliga längden på dessa polysackaridkedjor. Denna information kan vara avgörande för att testa hypoteser om GAG-ligand interaktioner på grund av vikten av GAG polymer längd vid bestämning av konjak ligand bindande affinitet. Detta tillvägagångssätt har flera fördelar, särskilt dess relativa enkelhet och anpassningsförmåga till biovetenskapliga forskningslaboratorier, även om det begränsas av dess relativa partiskhet mot negativt laddade GAG-moieties. Trots denna nackdel representerar denna teknik ett robust verktyg som skulle uppmuntra utredare att studera gags roll i organhomeostas och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL och EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
