Summary
Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.
Abstract
Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.
Introduction
Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos1. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a la misma célula) y trans- (ligando unido a la célula vecina)2. Además, los GAG también desempeñan funciones críticas como elementos estructurales en tejidos como la membrana basal glomerular3,el glicocáliz endotelial vascular4 y el glicocáliz epitelial pulmonar5,y en tejidos conectivos como el cartílago6.
La longitud de las cadenas de polisacáridos GAG varía sustancialmente según su contexto biológico y puede ser dinámicamente alargada, escindida y modificada por un sistema regulador enzimático altamente complejo7. Es importante destacar que la longitud de las cadenas de polímeros GAG contribuye sustancialmente a su afinidad de unión por los ligandos y, posteriormente, a su función biológica8,9. Por esta razón, la determinación de la función de un GAG endógeno requiere la apreciación de su tamaño. Desafortunadamente, a diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, existen muy pocas técnicas fácilmente disponibles para detectar y medir los GAG, lo que históricamente ha resultado en una investigación relativamente limitada sobre los roles biológicos de esta diversa familia de polisacáridos.
Este artículo describe cómo aislar y purificar los GAG de la mayoría de los tejidos biológicos y, también, describe cómo usar la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para evaluar la longitud de los polímeros aislados con un buen grado de especificidad. A diferencia de otros enfoques glucómicos altamente complejos (y a menudo basados en espectrometría de masas), este método se puede emplear utilizando equipos y técnicas de laboratorio estándar. Este enfoque práctico puede, por lo tanto, ampliar la capacidad de los investigadores para determinar el papel biológico de los GAG nativos y su interacción con ligandos contextualmente importantes.
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Protocol
Todas las muestras biológicas analizadas en este protocolo se obtuvieron de ratones, bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado.
1. Aislamiento de sulfato de heparán
- Delipidación de muestras de tejido
NOTA: La delipidación es un paso opcional para los tejidos ricos en grasa.- Haga una mezcla 1:1 de metanol y diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por muestra; las piezas más grandes de tejido pueden requerir hasta 1 ml.
- Coloque cada muestra de tejido en un recipiente de vidrio pequeño con una tapa para la delipidación.
NOTA: La masa de la muestra puede variar según el tejido de interés y las necesidades experimentales. 50 mg o menos suele ser suficiente para un rendimiento GAG adecuado, pero el usuario final puede requerir cierta optimización. - Añadir 500 μL de la solución de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidrio y mezclar. Asegúrese de que todas las muestras de tejido sólido estén completamente sumergidas en disolvente.
NOTA: Use pipetas serológicas o tubos cónicos de plástico para mezclar y manipular la solución de metanol/diclorometano; otros plásticos pueden disolverse. - Coloque las muestras en un agitador (en un estante seguro) en una campana de humos químicos y agite suavemente durante 1 h.
- Agitar las muestras para mezclar y centrifugar a 17.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Pipetee cuidadosamente la fracción de disolvente orgánico (sobrenadante). Esta es la fracción lipídica: no contiene GAG y se puede descartar.
NOTA: Trate de no perturbar el tejido, ya que se podrían perder piezas pequeñas. Es preferible dejar parte de la capa orgánica en el recipiente de la muestra, en lugar de arriesgarse a la pérdida de la muestra. - Deje la tapa del recipiente de vidrio abierta y deje que se evapore durante la noche en la campana. Cambie el tubo para el siguiente paso, ya que esos tubos no sobrevivirán al procesamiento posterior.
- Una vez que la mezcla de disolvente se haya evaporado por completo, proceda a la desintegración mecánica (si la muestra residual es >50 mg) o a la digestión de actinasa E (< 50 mg).
- Desintegración mecánica de tejido sólido (opcional; para muestras de tejido más grandes)
NOTA: La mayoría de las piezas más pequeñas de tejido sólido (aproximadamente 50 mg o menos) deben disolverse completamente durante la etapa de digestión. Sin embargo, las muestras más grandes requerirán desintegración mecánica.- Congelación rápida de muestras de interés colocándolas en un tubo de polipropileno de tamaño adecuado y colocando el tubo cerrado en nitrógeno líquido. Deje que la muestra se congele hasta que esté completamente sólida.
- Usando un mortero y un mortero limpios, muele las muestras congeladas en una consistencia similar al polvo.
- Proceda directamente a la digestión de la Actinasa E (Paso 1.4).
- Desalúdrico y concentración de muestras
NOTA: Este es un paso opcional y solo se requiere para muestras de tejido líquido diluido (por ejemplo, líquido de lavado broncoal-alveolar (BALF) o plasma).- Agrupar muestras líquidas en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por replicación biológica o grupo experimental)
- Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.
- Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
- Lave cada columna 3x con 400 μL de agua desionizada y filtrada. Descarta el flujo a través.
- Invierta el filtro y gire durante 1 minuto a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
- Digestión de actinasa E
NOTA: Este paso es necesario para digerir y, en última instancia, eliminar los contaminantes de proteínas de su muestra.- Mezclar muestras 1:1 con actinasa E recombinante a una concentración deseada de 10 mg/ml. Agregue el volumen apropiado de concentrado tampón de digestión 10x. Concentración final deseada: 0,005 M de acetato de calcio y 0,01 M de acetato de sodio, pH 7,5. Por ejemplo: 190 μL de muestra líquida, 190 μL de 20 mg/ml de actinasa E, 20 μL de acetato de calcio de 0,05 M, acetato de sodio de 0,1 M.
- Agitar las muestras suavemente para mezclar, luego digerir durante 48-72 h a 55 °C (hasta 7 días para el tejido entero).
- Calentar a 80 °C durante 15-20 min para calentar inactivar la Actinasa E.
- Congele la muestra a -80 °C o continúe con el paso 1.5.
- Desalúdrico y concentración de muestras
NOTA: Si se anticipa una masa baja del GAG de interés en la muestra biológica, o si es deseable la conservación de reactivos consumibles (es decir, columnas de filtro centrífugo), las muestras se pueden agrupar para producir un solo concentrado por grupo experimental (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).- Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
- Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
- Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.
- Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados (generalmente incluidos con las columnas del filtro centrífugo). Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
- Desecación
- Coloque las muestras disueltas del paso 1.5.5 en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice las muestras como se detalla a continuación.
- Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.
- Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.
- Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos -40 °C, 0,135 Torr)
- Columna de intercambio catiónico
- Resusped muestras desecadas en hasta 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2% (o, si se agrupan muestras, resuspend a un máximo de (400/n) μL, donde n = el número de muestras en la piscina deseada. Use la menor parte posible de la solución detergente.
- Equilibrar la columna de intercambio catiónico (IEX) con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
- Cargue 400 μL de muestras/muestras agrupadas en la columna IEX. Girar durante 5 min a 2.000 x g.
- Lavar 3x con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada vez.
- Elute 3x con 400 μL de 0,2 M NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta es la fracción de baja afinidad, que se puede conservar para fines de control de calidad si se desea.
- Elute 3x con 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta fracción contendrá los glicosaminoglicanos aislados de interés, ¡guárdalo todo!
- Para desamar cada fracción eluida, agregue metanol hasta 80 vol% e incube a 4 ° C durante la noche. Girar cada muestra durante 5 min a 2.000 x g. Recupere el residuo sólido ya que este es glicosaminoglicano dessalado seco.
NOTA: Alternativamente, omita este paso y continúe con el paso 1.8 para desatano el eluida sin metanol.
- Desalúdrico y concentración de muestras
- Si es necesario, agrupar las fracciones eluidas (a partir de 1.7.6) en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).
- Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
- Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
- Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarte el flujo a través. Continúe directamente con el paso 1.9.
- Digestión de la condroitina
NOTA: El propósito de este paso es eliminar los GAG que no son de interés para el usuario final. En este caso, la condroitinasa se usa para eliminar la condroitina. En los tejidos utilizados para generar Resultados Representativos (líquido de lavado bronco-alveolar y pulmón entero), la digestión del sulfato de condroitina deja sulfato de heparán como el GAG residual primario. Los usuarios finales pueden necesitar agregar pasos de digestión adicionales dependiendo de sus objetivos experimentales.- Cargue 350 μL de tampón de digestión (50 mM de acetato de amonio con 2 mM de cloruro de calcio ajustado a pH 7.0) a la columna del filtro centrífugo sin tocar la membrana.
- Añadir 5 μL de condroitinasa ABC recombinante.
- Coloque el tubo de muestras en un horno de 37 °C e incube durante 1 h.
- Gire la columna y colóquelos en tubos de recolección debidamente etiquetados. Girar durante 1 min a 2000 x g.
- Caliente las muestras a 80 °C durante 15-20 min para inactivar la condroitinasa ABC.
- Desalúdrico y concentración de muestras
- Si es necesario, agrupar las muestras de condroitina digeridas del paso 1.9.5 en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental)
- Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.
- Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.
- Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.
- Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.
- Desecación
NOTA: En este paso, la desecación es necesaria para que las muestras puedan ser resuspendidas en la menor cantidad posible de agua y tampón corriente.- Coloque las muestras digeridas con condroitina del paso 1.10.5 directamente en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice de la siguiente manera:
- Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.
- Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.
- Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos 40 °C, 0,135 Torr)
2. Electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos aislados y purificados
- Preparar con antelación las soluciones necesarias para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Tabla 1).
NOTA: Seleccione el porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución dependiendo del tamaño de los glicosaminoglicanos que se espera que estén en la muestra. Se recomienda un 15% para resolver fragmentos más grandes (más de 30 subunidades disacáridos de longitud); 22% para fragmentos más pequeños (<20 subunidades disacáridos de longitud). - Coloque el cassette vacío en el tanque PAGE. Fundir el gel resolunte de la siguiente manera: En un tubo de 15 ml, mezcle 10 ml de solución de gel de resolución, 60 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado) y 10 μL de TEMED (agregue TEMED en último lugar). Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use pipeta para agregar rápidamente la solución de 10 ml anterior al cassette. Superponga con 2 ml de agua desionizada y filtrada y permita que el gel de resolución polimerice durante 30 min.
NOTA: El siguiente protocolo PAGE se ha optimizado para un sistema PAGE vertical que utiliza casetes de fundición de 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo) y 1,0 mm de grosor con un volumen total de aproximadamente 12 ml. Se pueden utilizar otros sistemas de casetes, pero pueden requerir la optimización por parte del usuario final. - Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta y funda el gel de apilamiento de la siguiente manera: en un tubo de 15 ml, mezcle 3 ml de la solución de gel de apilamiento, 90 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado), 3 μL de TEMED (agregue TEMED por último).
- Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado; llenar cassette hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con la configuración. Deje que el gel de apilamiento polimerice durante 30 min.
- Una vez que el gel se haya polimerizado, asegúrese de que la tira de cinta se retire de la parte inferior del cassette y vuelva a colocar el cassette en el conjunto del tanque PAGE.
- Llene las cámaras superior e inferior con amortiguador de cámara superior e inferior, respectivamente.
- Disolver las muestras secas del paso 1.11.4 en el volumen mínimo necesario de agua desionizada y filtrada (como máximo, el 50% del volumen de los pozos en el gel PAGE). Mezclar 1:1 con el búfer de carga de muestras. Cargue las muestras y las "escaleras" de oligosacáridos HS (ver Tabla 1) en el gel.
- Pre-ejecutar el gel durante 5 min a 100 V. Luego ejecute el gel a 200 V durante 20-25 min (para un gel resoludor de poliacrilamida al 15%).
NOTA: Puede ser necesaria cierta optimización del tiempo de ejecución de 200 V. El rojo fenol migra por delante de los oligosacáridos de heparina que son 2 subunidades de polímero de longitud (es decir, grado de polimerización 2 o dp2); El azul de bromofenol migra antes que dp10-dp14. Los mejores resultados se obtienen cuando se aplica el voltaje de tal manera que la banda roja de fenol migra casi, pero no del todo, al fondo del gel. Ajuste el tiempo de ejecución en consecuencia.
3. Protocolo de tinción de plata
- Prepare todas las soluciones necesarias para la tinción de plata con anticipación (Tabla 2).
NOTA: No toque directamente el gel PAGE hasta que se haya teñido, desarrollado y colocado en solución de parada. En su lugar, manipule el gel con herramientas limpias de plástico o vidrio. El manejo directo del gel dará como resultado distorsiones de huellas dactilares y otros artefactos visibles en el gel después de la tinción. - Una vez que se complete la ejecución, desmonte el cassette y extraiga el gel en un recipiente limpio y mediano-grande lleno de agua desionizada y filtrada.
NOTA: Para evitar manipular directamente el gel, use la punta de la pipeta u otro objeto de plástico para pelar suavemente el gel del cassette mientras está sumergido en agua. El gel puede ser frágil: manipule con cuidado.- Deseche el agua. Manche el gel en solución de tinción azul alciano durante 5 min.
- Deseche la mancha azul alcense. Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alciano.
- Deje que se desmanche en agua desionizada y filtrada durante la noche en el balancín. Asegúrese de que haya un gran volumen de agua desionizada y filtrada para garantizar que cualquier mancha residual se lave completamente del gel durante la noche.
- Gel de lavado en metanol al 50% (40 min en total, solución de cambio 2-3x).
- Lavar el gel en agua desionizada y filtrada durante 30 min. Deseche el agua y repita 3 veces más durante un total de 2 h, reemplazando el agua cada vez.
- En un recipiente fresco y limpio, manche el gel durante 30 minutos en solución de tinción de nitrato de plata.
- Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces en agua desionizada y filtrada para eliminar completamente la solución de tinción de plata.
- Lavar durante 30 min en agua desionizada y filtrada. Deseche el agua y repita 2x durante un total de 90 minutos, reemplazando el baño de agua cada vez.
- Deseche el agua y agregue la solución en desarrollo.
- Una vez que se agrega la solución en desarrollo, observe cuidadosamente el gel y observe la aparición de bandas. Dependiendo de la calidad de la mancha y la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos.
- Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lávese brevemente con la solución de parada.
- Deseche el lavado de la solución de parada y reemplácelo con una solución de parada fresca. Dejar remojar durante 1 h en un balancín o agitador.
- Lavar en agua desionizada y filtrada durante la noche (sin embargo, el gel se puede tomar una imagen inmediatamente después de detener el lavado de la solución).
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Representative Results
El azul alciano se utiliza para teñir GAGs sulfatados 10; esta señal se amplifica mediante el uso de una mancha de plata posterior 11. La Figura 1 proporciona una demostración visual del proceso de desarrollo de tinción de plata. Como se demostró, la señal azul alcense que representa los GAG separados por electroforesis se amplifica a medida que el agente en desarrollo penetra en el gel de poliacrilamida. Por lo general, el proceso de desarrollo reducirá los GAG teñidos de plata y azul alciano de una manera dependiente de la densidad, con los bordes de cada banda reduciéndose primero, mientras que las regiones más densamente teñidas en el centro se mancharán en último lugar.
En la literatura, el límite reportado de detección de GAG utilizando enfoques basados en PAGE oscila entre 0,5-1 μg12,13. Para determinar el límite de detección utilizando nuestro enfoque, los oligosacáridos de sulfato de heparán de diferentes longitudes de polímero (heparina no fraccionada, dp20, dp10, dp6) se cargaron en un gel de poliacrilamida al 22%, luego se ejecutaron y se tiñeron como se describió anteriormente. Cada oligosacárido se cargó dos veces a dos masas diferentes: 1,0 μg y 0,5 μg. La Figura 2 demuestra que nuestra técnica puede detectar fácilmente 0,5 μg de GAG purificado. En particular, la heparina no fraccionada se detectó con menor facilidad de los cuatro oligosacáridos diferentes probados, probablemente debido a una distribución más amplia de los tamaños de polímeros que reduce correspondientemente la densidad de cada banda individual.
Para evaluar la eficiencia de la purificación GAG a partir de muestras biológicas líquidas, se aislaron GAG de dos muestras de lavado broncoalveolar (BAL). Como se muestra en la Figura 3,la primera muestra marcada como A utilizada para el aislamiento gag fue 1 mL de líquido BAL cosechado de un ratón 24 h después de lipopolisacárido intratraqueal (LPS) (3 mg/kg), administrado para inducir la disección epitelial alveolar de HS 5. Se agregaron 10 μg de dp6 disponible comercialmente directamente a este fluido BAL para servir como un "pico en" control para evaluar la pérdida de GAG durante el proceso de aislamiento. La segunda muestra marcada como B consistió en 10 ml de líquido BAL agrupado de 3 ratones que recibieron LPS intratraqueal (3 mg / kg) 24 h antes, sin pico de GAG exógeno. Ambas muestras se procesaron para el aislamiento GAG simultáneamente, y las 3 fracciones eluidas de la columna de intercambio iónico se retuvieron y procesaron para determinar si había GAG presentes en las fracciones de baja afinidad y lavado. Se ejecutaron 2 μg de oligosacáridos de sulfato de heparán dp20, dp10 y dp6 comprados comercialmente en el gel PAGE junto con estas muestras para proporcionar una referencia mediante la cual evaluar cualitativamente el tamaño de los GAG de HS en cada fracción eluida, así como una referencia para comparar la densidad con el control de "pico de entrada" de 10 μg que se sometió al aislamiento gag.
Para demostrar el uso de esta técnica en tejido sólido, se aisló el sulfato de heparán de un trozo de 15 mg de pulmón de ratón congelado como se describió anteriormente. Durante el proceso de aislamiento y purificación, la fracción de baja afinidad (0,2 M NaCl) eluida de la columna de intercambio iónico se retuvo y procesó junto con la fracción de alta afinidad (2,7 M NaCl) y se ejecutó sobre el gel(Figura 4). Junto con estas muestras se ejecutaron 2 μg de oligosacáridos de sulfato de heparán dp20, dp10 y dp6 comprados comercialmente para proporcionar una referencia de tamaño. Como se puede ver, todo el homogeneizado pulmonar produjo una amplia cantidad de HS aislado, con los fragmentos más pequeños aproximadamente iguales a dp10 en tamaño. El enriquecimiento relativo de los GAG de contenido ávido de manchas azules/plateadas de Alcian en la fracción de NaCl de 2,7 M demuestra que el sulfato de heparán se une con alta afinidad a las columnas de intercambio iónico y puede ser eluido de la columna con alta especificidad. El homogeneizado pulmonar completo produjo una amplia cantidad de heparán sulfato aislado (fracción de NaCl de 2,7 M), con los fragmentos más pequeños aproximadamente iguales a dp10 en tamaño.
Figura 1: Proceso de desarrollo de la tinción de plata. La tinción azul alciana de heparina no fraccionada (HNF) u oligosacáridos de tamaño definido (dp = grado de polimerización) separados por electroforesis se amplifica mediante tinción de plata. De izquierda a derecha: UFH, dp20, dp10, dp6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sensibilidad del gel de poliacrilamida y la tinción de plata para la detección de sulfato de heparán. Los oligosacáridos de sulfato de heparán de diferentes longitudes (heparina no fraccionada, también conocida como UFH, dp20, dp10, dp6) se sometieron a un gel de poliacrilamida al 22% y se tiñeron de plata. Cada oligosacárido se cargó dos veces en dos masas diferentes: 1,0 μg (bandas más a la izquierda) y 0,5 μg (bandas más a la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Eficiencia de la purificación GAG a partir de muestras biológicas líquidas. Los GAG aislados de dos muestras de lavado broncoalveolar (BAL), etiquetados aquí como "A" y "B", se ejecutaron en un gel de poliacrilamida al 22% y teñido de plata. La muestra A consistió en 1 ml de líquido BAL extraído de un ratón 24 h después del tratamiento con 3 mg/kg de lipopolisacárido intratraqueal (LPS). Se agregaron 10 μg adicionales de dp6 HS a esta muestra como un control de "pico en". La muestra B consistió en 10 ml de líquido BAL agrupado recolectado de 3 ratones 24 h después de la administración de LPS. Cada muestra se ejecutó junto con fracciones de la columna de intercambio iónico eluido con diluyente ("lavado") o bajas concentraciones de NaCl (0,2 M). Se utilizaron 2 μg de oligosacáridos de sulfato de heparán dp20, dp10 y dp6 comprados comercialmente como referencias de tamaño (bandas más a la izquierda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Medición del tamaño de los sulfatos de heparán aislados y purificados de un pulmón de ratón sano. Contenido de sulfato de heparina aislado y purificado a partir de una muestra congelada de 15 mg de un pulmón aislado de un ratón sano y ejecutado en un gel de poliacrilamida al 22%. El sulfato de heparán se eluyó de la columna de intercambio iónico con concentraciones bajas (0,2 M; fracción de baja afinidad) o altas concentraciones (2,7 M, solución al 16%; fracción de alta afinidad) de NaCl. Se utilizaron 2 μg de oligosacáridos de sulfato de heparán dp20, dp10 y dp6 comprados comercialmente como referencias de tamaño (bandas más a la izquierda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| NOTA: Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso. | |||
| Solución | Receta | Composición | Comentarios |
| Gel de resolución/tampón de funcionamiento de cámara inferior (2 L o 4 L) | Ácido bórico, MW 61.83 | 2L: 12.36 g; 4L: 24,76 g | Concentración deseada: 0.1 M |
| Base Tris, MW 124.14 | 2L: 24.2 g; 4L: | Concentración deseada: 0.1 M | |
| EDTA disódico MW 336.21 o dihidrato, MW 372.36 | 2L: 6.7 g o 7.4 g, respectivamente; 4L 13.4 g o 14.8 g, respectivamente | Concentración deseada: 0.01 M | |
| Agua desionizada | 2L o 4L | Ajuste el pH a 8.3 después de disolver completamente los reactivos | |
| Tampón de funcionamiento de la cámara superior (1 L) | Glicina | 93 g | Concentración deseada: 1 M |
| Base Tris, MW 124.14 | 24,2 g | Concentración deseada: 0.2 M | |
| Agua desionizada | 1 L | ||
| Gel resolunte, 22% de acrilamida total (500 ml) | Acrilamida, MW 71.08 | 100,1 g | Concentración deseada: 20.02% p/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 10 g | Concentración deseada: 2% p/v | |
| Sacarosa | 75 g | Concentración deseada: 15% p/v | |
| Resolución del tampón de gel | 500 ml | Llevar a un volumen total de 500 ml; requerirá menos de 500 ml de búfer total | |
| Gel resolunte, 15% de acrilamida total (400 ml) | Acrilamida, MW 71.08 | 56,3 g | Concentración deseada: 14.08% p/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Concentración deseada: 2% p/v | |
| Sacarosa | 20,8 g | Concentración deseada: 15% p/v | |
| Resolución del tampón de gel | 400 ml | Llevar a un volumen total de 400mL; requerirá menos de 400 ml de búfer en total | |
| Gel de apilamiento (100 ml) | Acrilamida, MW 71.08 | 4,75 g | Concentración deseada: 4.75% p/v |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Concentración deseada: 0.25% p/v | |
| Resolución del tampón de gel | 100 ml | Agregue un búfer de 80 ml y reactivos de disolución completa. Luego ajuste el pH a 76.3 con ácido clorhídrico, gota a gota. A continuación, lleve a un volumen total de 100 ml con tampón de gel de resolución. | |
| Búfer de carga de muestras (500 ml) | Sacarosa | 250g | Concentración deseada: 50% p/v |
| Rojo fenol | 500mg | Concentración deseada: 1mg/mL | |
| Azul de bromofenol | 250mg | Concentración deseada: 0.5mg/mL | |
| Agua desionizada | 500 ml | Llevar a un volumen total de 500 ml; requerirá menos de 500 ml de agua en total | |
| "Escalera" de oligosacáridos derivados de heparina (2 ml cada uno) | dp6 | 0,1 mg | NOTA: Se recomienda el uso de oligosacáridos derivados de heparina 6 subunidades de polímero en longitud (también conocido como grado de polimerización 6, o dp6) para la banda más pequeña, dp20 para la banda más grande y dp10 para la banda media. Sin embargo, se pueden usar otras combinaciones si se desea. Concentración deseada: 0.05 mg/mL |
| dp10 | 0,1 mg | ||
| dp20 | 0,1 mg | ||
| Agua desionizada | 3 ml | Disolver cada oligosacárido en tubos separados con 1 ml cada uno | |
| Búfer de carga de muestras | 3 ml | Añadir 1 ml (mezcla 1:1) a cada solución de oligosacáridos | |
Tabla 1: Soluciones requeridas para la electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos purificados. Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso.
| NOTA: Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso. | |||
| Solución | Receta | Composición | Comentarios |
| Solución de tinción azul alciano (500 ml) | Polvo azul alciano 8GX | 2,5 g | Concentración deseada: 0.5% p/v |
| 2% v/v de ácido acético glacial | 500 ml | ||
| Tinción de plata (200 mL) | Agua desionizada | 192,7 ml | Preparar la solución de manchas fresca; usar dentro de una semana. |
| 7.6M hidróxido de sodio | 2 ml | Para hacer, agregue 3.04 g de g de gránulos de hidróxido de sodio a 10 ml de agua | |
| Hidróxido de amonio | 3,3 ml | ||
| Solución de nitrato de plata 4M | 2 ml | Para hacer, agregue 3.397 g de nitrato de plata a 5 ml de agua. Agregue gota a gota mientras revuelve para evitar precipitaciones. | |
| Solución de desarrollo (501 mL) | Agua desionizada | 500 ml | La solución de desarrollo debe hacerse fresca y usarse dentro de las 24 h. |
| 2.5% p/v de ácido cítrico | 1 ml | Para hacer, agregue 100 mg a 4 ml de agua desionizada. El ácido cítrico debe hacerse fresco. | |
| Formaldehído | 250 μL | ||
| Solución de parada (500 ml) | Agua desionizada | 300 ml | |
| Ácido acético glacial | 20 ml | ||
| Metanol | 90 ml | ||
Tabla 2: Soluciones necesarias para la tinción de plata de glicosaminoglicanos separados por electroforesis en gel de poliacrlamida. Todas las soluciones deben filtrarse (0,22 μm) antes de su uso.
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Discussion
Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG 8,9,14. Por esta razón, es importante que los investigadores puedan definir con una precisión razonable el tamaño de las cadenas GAG aisladas de muestras biológicas de interés. Para ser práctica, esta técnica debe poder realizarse utilizando equipos y reactivos de laboratorio comunes.
Este protocolo describe un método para aislar y purificar los GAG de muestras biológicas, separarlos por tamaño a través de PAGE y visualizarlos utilizando la técnica de tinción de azul y plata de Alcian. Si bien hay varias formas de separar los glicosaminoglicanos por tamaño, nuestro enfoque tiene varias fortalezas específicas para la aplicación de esta técnica en los laboratorios de ciencias de la vida. En primer lugar, con un límite de detección de 0,5 μg, esta técnica es altamente sensible en la detección de GAG de interés. En nuestra experiencia, incluso las muestras que contienen concentraciones relativamente bajas de GAG (es decir, muestras de fluido BAL) deberían producir GAG más que suficiente para la detección utilizando este método. Si bien el rendimiento del aislamiento y la purificación del fluido BAL variará según la técnica y el GAG específico de interés, ha sido nuestra experiencia que 10 ml de fluido BAL crudo produce suficiente HS para ser detectable utilizando esta técnica. El rendimiento de los órganos sólidos es sustancialmente mayor, dependiendo del tejido cosechado, pero es nuestra experiencia que una muestra sólida inicial de 10 mg producirá un amplio HS para la detección utilizando esta técnica.
Es importante tener en cuenta que la imagen final del gel PAGE teñido variará de acuerdo con las tecnologías de imagen disponibles para el usuario final. Las fotografías digitales del gel se pueden tomar utilizando una serie de sistemas diferentes, incluidos numerosos sistemas de documentación de gel disponibles comercialmente o una cámara comercial regular, dependiendo del equipo disponible y la sensibilidad de detección requerida (generalmente dictada por la cantidad de muestra cargada en el gel). También debe tenerse en cuenta que la fuente de luz requerida para obtener imágenes digitales de este gel puede variar según la densidad de la muestra y la cantidad de tiempo de desarrollo requerido durante el proceso de tinción. Los geles que se desarrollan rápidamente y producen bandas teñidas de plata fácilmente visibles a simple vista requerirán transiluminación UV para obtener las mejores imágenes, ya que la mayoría de la luz será absorbida por el azul alciano no reaccionado. Los geles que requieren tiempos de desarrollo más largos (como aquellos con cantidades muy pequeñas de muestra) requerirán epiiluminación o transiluminación con luz normal de espectro completo, ya que esto será mejor absorbido por la mancha de plata.
Otra fortaleza de esta técnica es que es particularmente adaptable a los laboratorios de ciencias de la vida, debido a su base en la tecnología PAGE simple, utilizando equipos y reactivos que están comúnmente disponibles y adquiridos a bajo costo. Si bien existen otros enfoques para cuantificar la longitud de los polímeros GAG aislados (por ejemplo, electroforesis capilar), generalmente requieren tanto conocimientos como equipos que no están comúnmente disponibles en la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida15,16. La simplicidad de este enfoque y la naturaleza relativamente asequible y disponible de los reactivos requeridos hace que esta técnica sea fácilmente adaptable por los investigadores de ciencias de la vida interesados en estudiar la biología GAG en el contexto de sus subcampos dados. Además, esta técnica sirve como complemento esencial de las técnicas basadas en espectrometría de masas para detectar GAG en tejidos biológicos. Si bien los enfoques basados en espectrometría de masas son capaces de detectar GAG con alta sensibilidad y discernir diferencias sutiles en la estructura de muestras complejas17, debido a la naturaleza de la tecnología, no es capaz de distinguir entre polímeros GAG por tamaño. Por esta razón, un enfoque basado en PAGE es esencial para adivinar el tamaño de los polímeros HS en muestras biológicas de interés.
Es importante tener en cuenta que existen varias limitaciones a las técnicas descritas en este documento. El primero y más destacado es que debido a la interacción carga-carga que son centrales para la reacción de tinción azul de Alcian, este enfoque es altamente selectivo para GAG altamente sulfatados y solo manchará débilmente las partes más cargadas de neutro (por ejemplo, ácido hialurónico18). Por lo tanto, es probable que esta técnica sesgue sus resultados hacia las partes GAG más ácidas. Por esta razón, los enfoques complementarios para medir el contenido de GAG en muestras biológicas de interés (por ejemplo, técnicas basadas en espectrometría de masas) deben utilizarse de forma complementaria para proporcionar una imagen más completa de los GAG presentes en muestras experimentales. Además, para los usuarios finales específicamente interesados en medir el tamaño del hialuronano, otros han descrito técnicas similares basadas en PAGE que aprovechan la proteína de unión al ácido hialurónico biotinilado (HABP) que puede ser adaptable a la técnica básica descrita aquí19.
En resumen, la técnica presentada en este artículo se puede utilizar para aislar, purificar y detectar GAG de muestras biológicas con una gran sensibilidad y especificidad, así como para medir la longitud nativa de estas cadenas de polisacáridos. Esta información puede ser crítica para probar hipótesis sobre las interacciones GAG-ligando debido a la importancia de la longitud del polímero GAG para determinar la afinidad de unión al ligando cognado. Este enfoque tiene varias ventajas, sobre todo su relativa simplicidad y adaptabilidad a los laboratorios de investigación en ciencias de la vida, aunque está limitado por su sesgo relativo hacia las partes GAG cargadas negativamente. A pesar de este inconveniente, esta técnica representa una herramienta robusta que alentaría a los investigadores a estudiar el papel de los GAG en la homeostasis y la enfermedad de los órganos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL y EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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