Summary

Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Published: February 25, 2021
doi:

Summary

Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.

Abstract

Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.

Introduction

Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos1. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a la misma célula) y trans- (ligando unido a la célula vecina)2. Además, los GAG también desempeñan funciones críticas como elementos estructurales en tejidos como la membrana basal glomerular3,el glicocáliz endotelial vascular4 y el glicocáliz epitelial pulmonar5,y en tejidos conectivos como el cartílago6.

La longitud de las cadenas de polisacáridos GAG varía sustancialmente según su contexto biológico y puede ser dinámicamente alargada, escindida y modificada por un sistema regulador enzimático altamente complejo7. Es importante destacar que la longitud de las cadenas de polímeros GAG contribuye sustancialmente a su afinidad de unión por los ligandos y, posteriormente, a su función biológica8,9. Por esta razón, la determinación de la función de un GAG endógeno requiere la apreciación de su tamaño. Desafortunadamente, a diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, existen muy pocas técnicas fácilmente disponibles para detectar y medir los GAG, lo que históricamente ha resultado en una investigación relativamente limitada sobre los roles biológicos de esta diversa familia de polisacáridos.

Este artículo describe cómo aislar y purificar los GAG de la mayoría de los tejidos biológicos y, también, describe cómo usar la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para evaluar la longitud de los polímeros aislados con un buen grado de especificidad. A diferencia de otros enfoques glucómicos altamente complejos (y a menudo basados en espectrometría de masas), este método se puede emplear utilizando equipos y técnicas de laboratorio estándar. Este enfoque práctico puede, por lo tanto, ampliar la capacidad de los investigadores para determinar el papel biológico de los GAG nativos y su interacción con ligandos contextualmente importantes.

Protocol

Todas las muestras biológicas analizadas en este protocolo se obtuvieron de ratones, bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado. 1. Aislamiento de sulfato de heparán Delipidación de muestras de tejidoNOTA: La delipidación es un paso opcional para los tejidos ricos en grasa. Haga una mezcla 1:1 de metanol y diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por muestra; las piezas más…

Representative Results

El azul alciano se utiliza para teñir GAGs sulfatados 10; esta señal se amplifica mediante el uso de una mancha de plata posterior 11. La Figura 1 proporciona una demostración visual del proceso de desarrollo de tinción de plata. Como se demostró, la señal azul alcense que representa los GAG separados por electroforesis se amplifica a medida que el agente en desarrollo penetra en el gel de poliacrilamida. Por lo general, el proceso de des…

Discussion

Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG 8,9,14. Por esta razón, es importante que los investig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL y EPS)

Materials

Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge thermoFisher Scientific 13-100-675 Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP170-100 Electrophoresis grade
Actinase E Sigma Aldrich P5147 Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid) thermoFisher Scientific AC400460100
Ammonium acetate (solid) thermoFisher Scientific A639-500 Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid) thermoFisher Scientific A669S-500 certified ACS
Ammonium persulfate (solid) thermoFisher Scientific BP179-25 electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System ThermoFisher Scientific 10-451-217PKG Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid) thermoFisher Scientific A73-500 Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid) thermoFisher Scientific B392-5
Calcium acetate (solid) ThermoFisher Scientific 18-609-432 Molecular biology grade
Calcium chloride (solid) ThermoFisher Scientific AC349610250 Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) ThermoFisher Scientific 28299
Chondroitinase ABC Sigma Aldrich C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) Bio-Rad 3459901 Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) Bio-Rad 1656019 any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid) thermoFisher Scientific AC610931000 certified ACS
EDTA disodium salt (solid) thermoFisher Scientific 02-002-786 Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid) thermoFisher Scientific A35-500 Certified ACS
Glycine (solid) thermoFisher Scientific G48-500 Electrophoresis grade
Heparanase I/III Sigma Aldrich H3917 From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10) galen scientific HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6) Galen scientific HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20) galen scientific HO20
Hydrochloric acid (liquid) thermoFisher Scientific A466-250
Lyophilizer Labconco 7752020 Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid) thermoFisher Scientific A412-500 Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad 170-8170 Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP171-25 Electrophoresis grade
Phenol red (solid) thermoFisher Scientific P74-10 Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column Vivapure VS-IX01QH24 Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid) thermoFisher Scientific S181-25 certified ACS
Sodium Acetate (solid) ThermoFisher Scientific S210-500 Molecular biology grade
Sodium chloride (solid) thermoFisher Scientific S271-500 Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid) thermoFisher Scientific S392-212
Sucrose (solid) thermoFisher Scientific BP220-1 Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) thermoFisher Scientific BP150-20 Electrophoresis grade
Tris base (solid) thermoFisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff Amicon UFC500324 Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid) ThermoFisher Scientific 29700
Vacufuge Plus Eppendorf 22820001 Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume thermoFisher Scientific 569-0020 Alternative volumes and filter materials acceptable

References

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LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).

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