Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.
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Artículo de método
Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata
En este artículo
Resumen
Resumen
Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.
Introducción
Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos1. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a ....
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Protocolo
Todas las muestras biológicas analizadas en este protocolo se obtuvieron de ratones, bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado.
1. Aislamiento de sulfato de heparán
- Delipidación de muestras de tejido
NOTA: La delipidación es un paso opcional para los tejidos ricos en grasa.- Haga una mezcla 1:1 de metanol y diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por muestra; las piezas más grandes de tejido pueden requerir hasta 1 ml.
- Coloque cada muestra de tejido en un recipiente de vidrio pequeño con una tapa para la delipidación....
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Resultados
El azul alciano se utiliza para teñir GAGs sulfatados 10; esta señal se amplifica mediante el uso de una mancha de plata posterior 11. La Figura 1 proporciona una demostración visual del proceso de desarrollo de tinción de plata. Como se demostró, la señal azul alcense que representa los GAG separados por electroforesis se amplifica a medida que el agente en desarrollo penetra en el gel de poliacrilamida. Por lo general, el proceso de desarroll.......
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Discusión
Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG 8,9,14. Por esta razón, es importante que los investigadores .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL y EPS)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microcentrífuga de sobremesa Accuspin Micro17 | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Cualquier combinación de microcentrífuga/rotor de sobremesa con capacidad de 14000 xG es apropiada |
| Acrilamida (sólida) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Grado de electroforesis |
| Actinasa E | Sigma Aldrich | P5147 | Mezcla de proteasas de S. griseus |
| Azul alcián 8GX (sólido) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Acetato de amonio (sólido) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Grado de biología molecular |
| Hidróxido de amonio (líquido) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | ACS |
| Persulfato de amonio (sólido) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | grado de electroforesis |
| Barnstead GenPure Pro Water Sistema de purificación | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Cualquier sistema de desionización/purificación de agua es un sustituto aceptable |
| Ácido bórico (sólido) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Grado de biología molecular |
| Azul de bromphenol (sólido) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Acetato de calcio (sólido) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Grado de biología molecular |
| Cloruro de calcio (sólido) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | grado de biología molecular |
| (3-((3-colamidopropil) dimetilaminamonio)-1-propanosulfonato) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Condroitinasa ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion casete vacío para PAGE (1,0 mm de grosor, 12+2 pocillos) | Bio-Rad | 3459901 | Cualquier sistema de casete de fundición PAGE de 1,0 mm de grosor será suficiente |
| Criterion PAGE Sistema de celdas (celda y fuente de alimentación) | Bio-Rad | 1656019 | cualquier sistema PAGE de gel vertical comparable funcionará) |
| Diclorometano (líquido) | thermoFisher Scientific | certificado | por AC610931000 ACS |
| EDTA sal disódica (sólida) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular grado biológico |
| Ácido acético glacial (líquido) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certificado ACS |
| Glicina (sólido) | thermoFisher Scientific | G48-500 Grado de | electroforesis |
| Heparanasa I/III | Sigma Aldrich | H3917 | De Flavobacterium heparinum |
| Decasaccárido derivado de heparina (dp10) | galeno científico | HO10 | |
| Hexascárido derivado de la heparina (dp6) | Galeno científico | HO06 | |
| Oligosacárido derivado de la heparina (dp20) | Galeno | científico HO20 | |
| Ácido clorhídrico (líquido) | thermoFisher Scientific | Liofilizador A466-250 | |
| Labconco | 7752020 | Cualquier liofilizador que pueda alcanzar -40C y 0.135 Torr funcionará; también se puede reemplazar con un concentrador de vacío rotacional | |
| Metanol (líquido) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certificado ACS |
| Generador de imágenes moleculares Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Cualquier sistema de imagen en gel comparable es un sustituto aceptable |
| N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido) | thermoFisher Scientific | BP171-25 Grado de | electroforesis |
| Rojo de fenol (sólido) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Columna |
| intercambio iónico Q Mini H | Vivapure | VS-IX01QH24 | La columna de intercambio iónico debe tener un volumen de carga mínimo de 0,4 ml, un pH de trabajo de 2-12 y una selectividad para grupos iónicos con pKa de 11 |
| Nitrato de plata (sólido) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certificado ACS |
| Acetato de sodio (sólido) | ThermoFisher Scientific | S210-500 Grado de | biología molecular |
| Cloruro de sodio (sólido) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Grado de biología molecular |
| Hidróxido de sodio (sólido) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sacarosa (sólido) | thermoFisher Scientific | BP220-1 Grado de | biología molecular |
| TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamina) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Grado de electroforesis |
| Tris base (sólido) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Filtros |
| ultracentrífugos de grado de biología molecular, 0,5 ml, corte de peso molecular de 3000 Da | Amicon | UFC500324 | Se pueden utilizar unidades de filtro de mayor volumen, dependiendo del tamaño de la muestra. |
| Urea (sólida) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Cualquier concentrador de vacío rotacional funcionará; se puede reemplazar con liofilizador |
| Unidad de filtro de vacío, de un solo uso, poro de 0,22 uM PES, volumen de 500 ml | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Volúmenes alternativos y materiales de filtro aceptables |
Referencias
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan ....
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Reimpresiones y permisos
