Summary
В этом отчете описываются методы выделения и очистки сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) из биологических образцов и подход электрофореза полиакриламидного геля для приближения их размера. ГАГ способствуют структуре тканей и влияют на сигнальные процессы посредством электростатического взаимодействия с белками. Длина полимера GAG способствует их сродству связыванию с родственными лигандами.
Abstract
Сульфатированные гликозаминогликаны (GAGs), такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), повсеместно распространены в живых организмах и играют решающую роль в различных основных биологических структурах и процессах. В качестве полимеров GAG существуют в виде полидисперсной смеси, содержащей полисахаридные цепи, которые могут варьироваться от 4000 Да до более 40 000 Да. Внутри этих цепей существуют домены сульфатации, приделяющие паттерн отрицательного заряда, который облегчает взаимодействие с положительно заряженными остатками родственных белковых лигандов. Сульфатированные домены ГАГ должны быть достаточной длины, чтобы обеспечить эти электростатические взаимодействия. Чтобы понять функцию ГАГ в биологических тканях, исследователь должен быть в состоянии изолировать, очистить и измерить размер ГАГ. В этом отчете описывается практический и универсальный метод электрофореза на основе полиакриламидного геля, который может быть использован для устранения относительно небольших различий в размерах между GAG, выделенными из различных типов биологических тканей.
Introduction
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой разнообразное семейство линейных полисахаридов, которые являются повсеместным элементом в живых организмах и способствуют многим основным физиологическим процессам1. ГАГ, такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), могут быть сульфатированы в различных положениях вдоль полисахаридной цепи, придав географическим доменам отрицательный заряд. Эти GAG, будучи привязанными к белкам клеточной поверхности, известным как протеогликаны, проецируются во внеклеточное пространство и связываются с родственными лигандами, что позволяет регуляцию как цис- (лиганд, прикрепленный к одной и той же клетке), так и транс- (лиганд, прикрепленный к соседней клетке) сигнальных процессов2. Кроме того, ГАГ также выполняют решающую роль в качестве структурных элементов в тканях, таких как клубочковая базальная мембрана3,сосудистый эндотелиальный гликокаликс4 и легочный эпителиальный гликокаликс5,а также в соединительных тканях, таких как хрящ6.
Длина полисахаридных цепей GAG существенно варьируется в зависимости от ее биологического контекста и может динамически удлигаться, расщепляться и модифицироваться очень сложной ферментативной регуляторной системой7. Важно отметить, что длина полимерных цепей GAG существенно способствует их сродству связывания к лигандам и, впоследствии, их биологической функции8,9. По этой причине определение функции эндогенной ГАГ требует оценки ее размера. К сожалению, в отличие от белков и нуклеиновых кислот, существует очень мало легкодоступных методов обнаружения и измерения ГАГ, что исторически привело к относительно ограниченному исследованию биологических ролей этого разнообразного семейства полисахаридов.
В этой статье описывается, как изолировать и очищать ГАГ из большинства биологических тканей, а также описывается, как использовать электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) для оценки длины выделенных полимеров с достаточной степенью специфичности. В отличие от других, очень сложных (и часто основанных на масс-спектрометрии) гликомических подходов, этот метод может быть использован с использованием стандартного лабораторного оборудования и методов. Таким образом, этот практический подход может расширить возможности исследователей по определению биологической роли нативных ГАГ и их взаимодействия с контекстуально важными лигандами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все биологические образцы, проанализированные в этом протоколе, были получены от мышей в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо.
1. Выделение сульфата гепарана
- Делипидация образцов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Делипидация является необязательным этапом для богатых жирами тканей.- Сделайте смесь метанола и дихлорметана 1:1. Приготовить приблизительно 500 мкл на образец; более крупные куски ткани могут потребовать до 1 мл.
- Поместите каждый образец ткани в небольшой стеклянный контейнер с крышкой для делипидации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Масса образца может варьироваться в зависимости от ткани, представляющих интерес, и экспериментальных потребностей. 50 мг или менее обычно достаточно для адекватного выхода GAG, но конечному пользователю может потребоваться некоторая оптимизация. - Добавьте 500 мкл раствора метанола: дихлорметана в каждый стеклянный контейнер и перемешайте. Убедитесь, что все образцы твердых тканей полностью погружены в растворитель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте серологические пипетки или пластиковые конические трубки для смешивания и обработки раствора метанола/дихлорметана; другие пластмассы могут растворяться. - Поместите образцы на шейкер (в защищенную стойку) в химический вытяжной капюшон и осторожно перемешивайте в течение 1 ч.
- Перемешивают образцы до смешивания и центрифуги при 17 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Осторожно вылейте фракцию органического растворителя (супернатанта). Это липидная фракция – она не содержит ГАГ и может быть выброшена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь не беспокоить ткани, так как небольшие кусочки могут быть потеряны. Предпочтительно оставить часть органического слоя в контейнере для образцов, а не рисковать потерей образца. - Оставьте крышку стеклянной емкости открытой и дайте ей испариться в течение ночи в вытяжке. Замените трубку для следующего этапа, так как эти трубки не выдержут дальнейшую обработку.
- Как только смесь растворителя полностью испарится, приступают к механическому распаду (если остаточный образец составляет >50 мг) или перевариванию актиназы Е (< 50 мг).
- Механический распад твердой ткани (опционально; для более крупных образцов тканей)
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство небольших кусочков твердой ткани (примерно 50 мг или менее) должны полностью раствориться на этапе пищеварения. Однако более крупные образцы потребуют механического распада.- Интересующие образцы мгновенной заморозки, помещая их в полипропиленовую трубку соответствующего размера и помещая закрытую трубку в жидкий азот. Дайте образцу замерзнуть до полного твердого вещества.
- Используя чистую ступку и пестик, измельчите замороженные образцы в порошкообразную консистенцию.
- Приступайте непосредственно к пищеварению актиназы Е (шаг 1.4).
- Обессоливание и концентрация проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный этап, который требуется только для разбавления образцов жидких тканей (например, бронхо-альвеолярной промывной жидкости (BALF) или плазмы).- Объединение жидких образцов в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе)
- Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 3000 Да.
- Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость колонки центробежного фильтра.
- Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
- Переверьте фильтр и открутите в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных сборных тубах. Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
- Переваривание актиназы Е
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для переваривания и в конечном итоге удаления белковых загрязнителей из вашего образца.- Смешайте образцы 1:1 с рекомбинантной актиназой Е до желаемой концентрации 10 мг/мл. Добавьте соответствующий объем 10-кратного буферного концентрата для пищеварения. Желаемая конечная концентрация: 0,005 М ацетата кальция и 0,01 М ацетата натрия, рН 7,5. Например: 190 мкл жидкого образца, 190 мкл 20 мг/мл актиназы Е, 20 мкл 0,05 М ацетата кальция, 0,1 М ацетата натрия.
- Образцы осторожно перемешивают, затем переваривают в течение 48-72 ч при 55 °C (до 7 дней для целой ткани).
- Нагревать до 80 °C в течение 15-20 мин для нагрева инактивировать актиназу Е.
- Заморозьте образец при -80 °C или продолжайте двигаться к шагу 1,5.
- Обессоливание и концентрация проб
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в биологическом образце ожидается низкая масса интересующего ГАГ или если желательно сохранение расходуемых реагентов (т.е. центробежных фильтрующих колонн), образцы могут быть объединены для получения одного концентрата на экспериментальную группу (например, биологической репликой или экспериментальной группой).- Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Da.
- Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость центробежной фильтрующей колонны.
- Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
- Инвертировать фильтр и отжимать в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных коллекторных трубках (обычно входят в комплект поставки центробежных фильтруемых колонн). Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
- Высыхание
- Либо поместите растворенные образцы из этапа 1.5.5 во вращательную вакуумную концентратор на ночь, либо лиофилизируйте образцы, как описано ниже.
- Тщательно заморозьте образцы либо на ночь при -80 °C, либо путем погружения в жидкий азот.
- Проткните крышки образца иглой 18 Г и поместите в камеру лиофилизатора. Добавьте бумажные полотенца для упаковки по мере необходимости.
- Зафиксируйте камеру лиофилайзера на лиофилизаторе и высушите сублимационную в течение ночи (не менее -40 °C, 0,135 Torr)
- Катионообменная колонна
- Повторное суспендирование высушаемых образцов в объеме до 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствора CHAPS (или, при объединении образцов, повторное суспендирование до максимума (400/n) мкл, где n = количество образцов в желаемом пуле. Используйте как можно меньше моющего раствора.
- Уравновешивают катионообменную колонну (IEX) 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствор ЧАПС. Отжимать в течение 5 мин при 2 000 х г при комнатной температуре.
- Загрузите 400 мкл образцов/объединенных образцов в колонку IEX. Вращаться в течение 5 мин при 2 000 х г.
- Промыть 3x 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствор ЧАПС. Вращайте в течение 5 минут при 2 000 х г каждый раз.
- Elute 3x с 400 мкл 0,2 М NaCl. Вращать в течение 5 мин при 2 000 х г каждый. Это фракция с низким сродством - при желании ее можно сохранить для целей контроля качества.
- Elute 3x с 400 мкл 2,7 М (16%) NaCl. Вращать в течение 5 мин при 2 000 х г каждый. Эта фракция будет содержать выделенные гликозаминогликаны, представляющие интерес - сохраните все это!
- Чтобы обессолить каждую элюированную фракцию, добавляют метанол до 80 об.% и инкубируют при 4 °C в течение ночи. Вращайте каждый образец в течение 5 минут при 2 000 х г. Рекуперирует твердый остаток, так как это высушенный обеззаленный гликозаминогликан.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы пропустите этот этап и перейдите к этапу 1.8 для обезживливать элюат без метанола.
- Обессоливание и концентрация проб
- При необходимости объединяют элюированные фракции (из 1.7.6) в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе).
- Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Da.
- Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость центробежной фильтрующей колонны.
- Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Выбрасываемые потоки. Перейдите непосредственно к шагу 1.9.
- Переваривание хондроитина
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является удаление GAG, не представляющих интереса для конечного пользователя. В этом случае хондроитиназа используется для удаления хондроитина. В тканях, используемых для получения репрезентативных результатов (бронхо-альвеолярная лаважная жидкость и все легкое), переваривание хондроитина сульфата листьев гепарана сульфата в качестве первичного остаточного GAG. Конечным пользователям может потребоваться добавить дополнительные этапы пищеварения в зависимости от их экспериментальных целей.- Загрузите 350 мкл буфера пищеварения (50 мМ ацетата аммония с 2 мМ хлорида кальция с поправкой на рН 7,0) в колонку центробежного фильтра, не касаясь мембраны.
- Добавляют 5 мкл рекомбинантной хондроитиназы ABC.
- Поместите пробирку для образцов в духовку с 37 °C и инкубировать в течение 1 ч.
- Переверните колонну и поместите в соответствующие наборные трубки. Отжим в течение 1 мин при 2000 х г.
- Нагревайте образцы до 80 °C в течение 15-20 мин для инактивации хондроитиназы ABC.
- Обессоливание и концентрация проб
- При необходимости пул хондроитина переваривал образцы со этапа 1.9.5 в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе)
- Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Да.
- Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость колонки центробежного фильтра.
- Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
- Инвертировать фильтр и отжимать в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных сборных тубах. Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
- Высыхание
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе высыхание необходимо для того, чтобы образцы можно было повторно суспендовать в минимально возможном количестве воды и проточном буфере.- Либо поместите переваренные образцы хондроитина со этапа 1.10.5 непосредственно во вращающийся вакуумный концентратор на ночь или лиофилизируйте следующим образом:
- Тщательно заморозьте образцы либо на ночь при -80 °C, либо путем погружения в жидкий азот.
- Проткните крышки образца иглой 18 Г и поместите в камеру лиофилизатора. Добавьте бумажные полотенца для упаковки по мере необходимости.
- Зафиксируйте камеру лиофилизатора к лиофилизатору и высушите лиофилизером в течение ночи (не менее 40 °C, 0,135 Торра)
2. Электрофорез полиакриламидного геля из выделенных и очищенных гликозаминогликанов
- Заранее готовят растворы, необходимые для электрофореза полиакриламидного геля (ПАЖ)(табл. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите процент акриламида раствора разрешающего геля в зависимости от размера гликозаминогликанов, которые, как ожидается, будут в образце. 15% рекомендуется для рассасывания более крупных фрагментов (более 30 дисахаридных субъединиц в длину); 22% для более мелких фрагментов (<20 дисахаридных субъединиц в длину). - Поместите пустую кассету в резервуар PAGE. Отлить рассасывающий гель следующим образом: В пробирке объемом 15 мл смешать 10 мл раствора разрешающего геля, 60 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовленным) и 10 мкл TEMED (добавить TEMED последним). Осторожно переверяем трубку в 2-3 раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить вышеуказанный раствор 10 мл в кассету. Наложить 2 мл деионизированной, фильтрованной воды и дать рассасывающейся гелю полимеризоваться в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол PAGE был оптимизирован для вертикальной системы PAGE с использованием литейных кассет толщиной 13,3 x 8,7 см (ширина x длина) толщиной 1,0 мм общим объемом около 12 мл. Другие кассетные системы могут быть использованы, но могут потребовать оптимизации конечным пользователем. - После того, как разрешающий гель полностью полимеризуется, отбросьте наложенную воду и отлить укладочный гель следующим образом: в пробирке объемом 15 мл смешайте 3 мл раствора геля для укладки, 90 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовлен), 3 мкл TEMED (добавьте TEMED последним).
- Осторожно переверяем трубку в 2-3 раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить укладывающий гель поверх затвердевания разрешающего геля; заполнить кассету до краев. Полностью вставьте гребень, входящий в комплект поставки. Дайте укладываемым гелю полимеризоваться в течение 30 мин.
- После полимеризации геля убедитесь, что ленточная лента удалена со дна кассеты, и поместите кассету обратно в сборку резервуара PAGE.
- Заполните верхнюю и нижнюю камеры буфером верхней и нижней камер соответственно.
- Растворите высушенные образцы со ступени 1.11.4 в минимально необходимом объеме деионизированной, фильтрованной воды (не более 50% от объема скважин в геле PAGE). Смешайте 1:1 с буфером загрузки образца. Загрузите образцы HS и олигосахаридные «лестницы» (см. таблицу 1)в гель.
- Предварительно запустите гель в течение 5 мин при 100 В. Затем запускают гель при 200 В в течение 20-25 мин (для 15% полиакриламидного разрешающего геля), 40-50 мин (для 18% полиакриламидного разрешающего геля), 90-100 мин (для 22% полиакриламидного разрешающего геля).
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться некоторая оптимизация времени выполнения 200 В. Фенол красный мигрирует впереди олигосахаридов гепарина, которые имеют длину 2 полимерные субъединицы (т.е. степень полимеризации 2 или dp2); бромфенол синий мигрирует раньше dp10-dp14. Наилучшие результаты получаются при подаче такого напряжения, что фенольно-красная полоса мигрирует почти, но не совсем, на дно геля. Отрегулируйте время выполнения соответствующим образом.
3. Протокол окрашивания серебра
- Заранее подготовьте все растворы, необходимые для окрашивания серебра(таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь непосредственно к гелю PAGE до тех пор, пока он не будет окрашен, разработан и помещен в стоп-раствор. Вместо этого манипулируйте гелем, используя чистые пластиковые или стеклянные инструменты. Непосредственное обращение с гелем приведет к искажениям отпечатков пальцев и другим видимым артефактам на геле после окрашивания. - После завершения пробега разберите кассету и извлеките гель в чистый контейнер среднего размера, заполненный деионизированной, фильтрованной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать непосредственного обращения с гелем, используйте наконечник пипетки или другой пластиковый предмет, чтобы аккуратно отклеить гель от кассеты во время погружения в воду. Гель может быть хрупким – обращаться осторожно.- Выбросьте воду. Окрашивание геля в раствор для окрашивания Alcian blue в течение 5 мин.
- Отбросьте алцианское синее пятно. Быстро промывайте/промывайте 2-3 раза деионизированной, фильтрованной водой до тех пор, пока большая часть раствора для окрашивания Alcian blue не будет удалена.
- Дайте обеззаражить деионизированную, фильтрованную воду в течение ночи на коромысле. Убедитесь, что имеется достаточный объем деионизированной, отфильтрованной воды, чтобы гарантировать, что любое остаточное пятно полностью смывается с геля в течение ночи.
- Промыть гель в 50% метаноле (всего 40 мин, заменить раствор 2-3х).
- Промыть гель в деионизированной, фильтрованной воде в течение 30 мин. Выбросьте воду и повторите еще 3 раза в течение 2 ч, каждый раз заменяя воду.
- В свежей, чистой емкости окрашивать гель в течение 30 мин раствором для окрашивания нитратом серебра.
- Быстро промойте/смойте 2-3 раза в деионизированной, фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра.
- Промывайте в течение 30 мин в деионизированной, фильтрованной воде. Отбросьте воду и повторите 2 раза в общей сложности 90 минут, каждый раз заменяя водяную баню.
- Отбросьте воду и добавьте развивающий раствор.
- После того, как развивающий раствор добавлен, внимательно наблюдайте за гелем и следите за появлением полос. В зависимости от качества пятна и массы загруженного образца, разработка может занять от нескольких секунд до нескольких минут.
- Как только видны нужные полосы, немедленно отбросьте развивающийся раствор и ненадолго промойте стоп-раствором.
- Откажитесь от стоп-раствора, промыть и заменить его свежим стоп-раствором. Дать впитаться в течение 1 ч на коромысле или шейкере.
- Промывайте в деионизированной, фильтрованной воде на ночь (однако гель можно визуализировать сразу после остановки промывки раствором).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Альциановый синий используется для окрашивания сульфатированных GAGs 10; этот сигнал усиливается с помощью последующего серебряного пятна 11. На рисунке 1 представлена наглядная демонстрация процесса развития окрашивания серебром. Как было показано, альцианианский синий сигнал, представляющий ГАГ, разделенные электрофорезом, усиливается по мере проникновения развивающего агента в полиакриламидный гель. Как правило, развивающийся процесс уменьшает серебристые и альцианские синие GAG в зависимости от плотности, причем края каждой полосы уменьшаются первыми, в то время как более плотно окрашивающие области в центре будут окрашиваться.
В литературе сообщаемый предел обнаружения ГАГ с использованием подходов на основе PAGE колеблется в пределах 0,5-1 мкг12,13. Чтобы определить предел обнаружения с помощью нашего подхода, олигосахариды гепарансульфата различной длины полимера (нефракционированный гепарин, dp20, dp10, dp6) нагружали на 22% полиакриламидный гель, затем запускали и окрашивали, как описано выше. Каждый олигосахарид был загружен дважды при двух разных массах: 1,0 мкг и 0,5 мкг. Рисунок 2 демонстрирует, что наш метод может довольно легко обнаружить 0,5 мкг очищенного GAG. Примечательно, что нефракционированный гепарин был наименее легко обнаружен из четырех различных тестируемых олигосахаридов, вероятно, из-за более широкого распределения размеров полимеров, что соответственно снижает плотность каждой отдельной полосы.
Чтобы оценить эффективность очистки GAG из жидких биологических образцов, GAG были выделены из двух образцов бронхоальвеолярного лаважа (BAL). Как показано на рисунке 3,первый образец, помеченный как A, используемый для выделения GAG, представлял собой 1 мл жидкости BAL, собранной у мыши через 24 ч после интратрахеального липополисахарида (LPS) (3 мг / кг), введенного для индуцирования выделения альвеолярного эпителия HS 5. 10 мкг коммерчески доступного dp6 были добавлены непосредственно к этой жидкости BAL, чтобы служить в качестве контроля «всплеска» для оценки потерь GAG во время процесса изоляции. Второй образец, помеченный как B, состоял из 10 мл жидкости BAL, объединенной у 3 мышей, которым давали интратрахеальный ЛПС (3 мг/кг) за 24 ч до этого, без экзогенного всплеска GAG. Оба образца были обработаны для изоляции GAG одновременно, и все 3 фракции, элюированные из ионообменного столба, были сохранены и дополнительно обработаны, чтобы определить, присутствовали ли какие-либо GAG в низкоаффинные и промывные фракции. 2 мкг коммерчески приобретенных олигосахаридов dp20, dp10 и dp6 гепарана сульфата были запущены в геле PAGE вместе с этими образцами, чтобы обеспечить ориентир, с помощью которого можно качественно оценить размер ГАГ HS в каждой элюированной фракции, а также ссылку для сравнения плотности с контролем «всплеска» 10 мкг, который подвергся изоляции GAG.
Чтобы продемонстрировать использование этого метода на твердой ткани, сульфат гепарана был выделен из 15 мг куска замороженного легкого мыши, как описано выше. В процессе выделения и очистки фракцию с низким сродством (0,2 М NaCl), элюированную из ионообменных колонн, сохраняли и обрабатывали вместе с фракцией с высоким сродством (2,7 М NaCl) и запускали нагеле (рисунок 4). 2 мкг коммерчески закупаемых олигосахаридов dp20, dp10 и dp6 гепарана сульфата были запущены вместе с этими образцами, чтобы обеспечить ориентир для размера. Как видно, весь гомогенат легких дал достаточное количество изолированного HS, причем мельчайшие фрагменты примерно равны dp10 по размеру. Относительное обогащение альцианского синего/серебристого пятна с высоким содержанием GAG в фракции 2,7 М NaCl демонстрирует, что гепарансульфат связывается с высоким сродством к ионообменным колоннам и может быть элюирован с колонны с высокой специфичностью. Весь гомогенат легких дал достаточное количество изолированного гепарансульфата (фракция 2,7 M NaCl), причем мельчайшие фрагменты примерно равны dp10 по размеру.
Рисунок 1:Процесс развития серебряного пятна. Альциановое синее окрашивание нефракционированного гепарина (UFH) или определяемых размером олигосахаридов (dp = степень полимеризации), разделенных электрофорезом, усиливается серебристым окрашиванием. Слева направо: UFH, dp20, dp10, dp6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Чувствительность полиакриламидного геля и серебряного пятна для обнаружения сульфата гепарана. Олигосахариды гепарана сульфата различной длины (нефракционированный гепарин, он же UFH, dp20, dp10, dp6) были нанесены на 22% полиакриламидный гель и окрашены в серебро. Каждый олигосахарид загружали дважды при двух разных массах: 1,0 мкг (самые левые полосы) и 0,5 мкг (самые правые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Эффективность очистки ГАГ от жидких биологических образцов. GAG, выделенные из двух образцов бронхоальвеолярного лаважа (BAL), помеченных здесь как «A» и «B», были запущены на 22% полиакриламидном геле и окрашены серебром. Образец А состоял из 1 мл жидкости BAL, собранной у мыши через 24 ч после обработки 3 мг/кг интратрахеального липополисахарида (ЛПС). Дополнительные 10 мкг dp6 HS были добавлены к этому образцу в качестве «всплеска» контроля. Образец B состоял из 10 мл объединенной жидкости BAL, собранной у 3 мышей через 24 ч после введения ЛПС. Каждый образец проводили вместе с фракциями из ионообмонной колонны, элюированной либо разбухателем («промывка»), либо низкими концентрациями NaCl (0,2 М). 2 мкг коммерчески приобретенных олигосахаридов dp20, dp10 и dp6 гепарансульфата были использованы в качестве эталонов размера (самые левые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Измерение размера сульфатов гепарана, выделенных и очищенных из здорового легкого мыши. Содержание гепарина сульфата выделено и очищено из 15 мг замороженного образца легкого, выделенного из здоровой мыши и запущенного на 22% полиакриламидном геле. Гепарансульфат элюировали из ионообмонной колонны либо низкими концентрациями (0,2 М; низкая аффинная фракция), либо высокими концентрациями (2,7 М, 16% раствор; высокая аффинная фракция) NaCl. 2 мкг коммерчески приобретенных олигосахаридов dp20, dp10 и dp6 гепарансульфата были использованы в качестве эталонов размера (самые левые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть отфильтрованы (0,22 мкм) перед использованием. | |||
| Решение | Рецепт | Состав | Комментарии |
| Разрешающий гель/буфер работы нижней камеры (2 л или 4 л) | Борная кислота, MW 61,83 | 2л: 12,36 г; 4л: 24,76 г | Желаемая концентрация: 0,1 М |
| База Трис, МВт 124.14 | 2л: 24,2 г; 4л: | Желаемая концентрация: 0,1 М | |
| Динатрия ЭДТА MW 336.21 или дигидрат, MW 372.36 | 2л: 6,7 г или 7,4 г соответственно; 4 л 13,4 г или 14,8 г соответственно | Желаемая концентрация: 0,01 М | |
| Деионизированная вода | 2Л или 4Л | Отрегулируйте pH до 8,3 после полного растворения реагентов | |
| Буфер работы верхней камеры (1 л) | Глицин | 93 г | Желаемая концентрация: 1 M |
| База Трис, МВт 124.14 | 24.2 г | Желаемая концентрация: 0,2 М | |
| Деионизированная вода | 1 л | ||
| Разрешающий гель, 22% общего акриламида (500 мл) | Акриламид, MW 71.08 | 100.1 г | Желаемая концентрация: 20,02% мас./об. |
| N,N'-метилен-бис-акриламид (бис, MW 154,17) | 10 г | Желаемая концентрация: 2% мас./об. | |
| Сахароза | 75 г | Желаемая концентрация: 15% мас./об. | |
| Разрешение гелевого буфера | 500 мл | Довести до общего объема 500 мл; потребуется менее 500 мл общего буфера | |
| Разрешающий гель, 15% общего акриламида (400 мл) | Акриламид, MW 71.08 | 56.3 г | Желаемая концентрация: 14,08% мас./об. |
| N,N'-метилен-бис-акриламид (бис, MW 154,17) | 3.7 г | Желаемая концентрация: 2% мас./об. | |
| Сахароза | 20.8 г | Желаемая концентрация: 15% мас./об. | |
| Разрешение гелевого буфера | 400 мл | Довести до общего объема 400 мл; потребуется менее 400 мл общего буфера | |
| Укладочный гель (100 мл) | Акриламид, MW 71.08 | 4,75 г | Желаемая концентрация: 4,75% мас./об. |
| N,N'-метилен-бис-акриламид (бис, MW 154,17) | 0,25 г | Желаемая концентрация: 0,25% мас./об. | |
| Разрешение гелевого буфера | 100 мл | Добавьте 80 мл буфера и полностью растворите реагенты. Затем отрегулируйте рН до 76,3 с соляной кислотой, по каплям. Затем довести до общего объема 100 мл с помощью разрешающего гелевого буфера. | |
| Буфер загрузки образцов (500 мл) | Сахароза | 250г | Желаемая концентрация: 50% мас./об. |
| Фенол красный | 500мг | Желаемая концентрация: 1 мг/мл | |
| Бромфенол синий | 250мг | Желаемая концентрация: 0,5 мг / мл | |
| Деионизированная вода | 500мл | Довести до общего объема 500 мл; потребуется менее 500 мл воды в общей сложности | |
| Гепарин, полученный из олигосахарида «лестница» (по 2 мл каждый) | дп6 | 0.1мг | ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать производные гепарина олигосахариды 6 полимерных субъединиц длиной (также известная как степень полимеризации 6 или dp6) для наименьшей полосы, dp20 для самой большой полосы и dp10 для средней полосы. Однако при желании можно использовать и другие комбинации. Желаемая концентрация: 0,05 мг/мл |
| дп10 | 0.1мг | ||
| дп20 | 0.1мг | ||
| Деионизированная вода | 3мл | Растворите каждый олигосахарид в отдельных пробирках по 1 мл в каждой | |
| Буфер загрузки образцов | 3мл | Добавьте 1 мл (смесь 1:1) к каждому раствору олигосахарида | |
Таблица 1: Растворы, необходимые для электрофореза очищенных гликозаминогликанов полиакриламидного гликозаминогликанов. Все растворы необходимо фильтровать (0,22 мкм) перед использованием.
| ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть отфильтрованы (0,22 мкм) перед использованием. | |||
| Решение | Рецепт | Состав | Комментарии |
| Альциановый раствор для окрашивания синего цвета (500 мл) | Альциан синий порошок 8GX | 2.5г | Желаемая концентрация: 0,5% мас./об. |
| 2% v/v ледниковой уксусной кислоты | 500мл | ||
| Серебряное пятно (200 мл) | Деионизированная вода | 192.7 мл | Приготовить пятно раствор свежим; использовать в течение одной недели. |
| 7.6M гидроксид натрия | 2 мл | Для изготовления добавьте 3,04 г гранул гидроксида натрия в воду 10 мл | |
| Гидроксид аммония | 3,3 мл | ||
| 4M раствор нитрата серебра | 2 мл | Для изготовления добавьте 3,397 г нитрата серебра в 5 мл воды. Добавляйте по каплям при перемешивке, чтобы избежать осадков. | |
| Разрабатывающее решение (501 мл) | Деионизированная вода | 500 мл | Развивающий раствор необходимо сделать свежим и использовать в течение 24 ч. |
| 2,5% мас./v лимонной кислоты | 1 мл | Чтобы сделать, добавьте 100 мг в 4 мл деионизированной воды. Лимонная кислота должна быть свежей. | |
| Формальдегид | 250мкл | ||
| Стоп-раствор (500 мл) | Деионизированная вода | 300 мл | |
| Ледниковая уксусная кислота | 20 мл | ||
| Метанол | 90 мл | ||
Таблица 2: Растворы, необходимые для окрашивания серебром гликозаминогликанов, разделенных электрофорезом полиакриламидного геля. Все растворы необходимо фильтровать (0,22 мкм) перед использованием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ГАГ играют центральную роль во многих разнообразных биологических процессах. Одной из основных функций сульфатированных GAG (таких как HS и CS) является взаимодействие с лигандами и связывание с них, которые могут изменять последующие сигнальные функции. Важным фактором, определяющим сродство связывания GAG с родственными лигандами, является длина полимерной цепи GAG 8,9,14. По этой причине важно, чтобы исследователи могли с разумной точностью определить размер цепей GAG, выделенных из биологических образцов, представляющих интерес. Чтобы быть практичным, этот метод должен быть способен выполняться с использованием общего лабораторного оборудования и реагентов.
Этот протокол описывает метод выделения и очистки ГАГ из биологических образцов, их разделения по размеру с помощью PAGE и их визуализации с использованием техники окрашивания алцианским синим и серебристым цветом. Хотя существует несколько способов разделения гликозаминогликанов по размеру, наш подход имеет несколько сильных сторон, характерных для применения этого метода в лабораториях наук о жизни. Во-первых, при пределе обнаружения 0,5 мкг этот метод очень чувствителен при обнаружении ГАГ, представляющих интерес. По нашему опыту, даже образцы, которые содержат относительно низкие концентрации GAG (т.е. образцы жидкости BAL), должны давать более чем достаточно GAG для обнаружения с использованием этого метода. В то время как выход от выделения и очистки жидкости BAL будет варьироваться в зависимости от техники и конкретного GAG, представляющих интерес, наш опыт показывает, что 10 мл сырой жидкости BAL дает достаточно HS, чтобы быть обнаруженным с использованием этого метода. Выход из твердых органов значительно выше, в зависимости от собранной ткани, но наш опыт показывает, что первоначальный твердый образец в 10 мг даст достаточный HS для обнаружения с использованием этого метода.
Важно отметить, что окончательное изображение окрашенного геля PAGE будет варьироваться в зависимости от технологий визуализации, доступных конечному пользователю. Цифровые фотографии геля могут быть сделаны с использованием ряда различных систем, включая многочисленные коммерчески доступные системы документирования геля или обычную коммерческую камеру, в зависимости от доступного оборудования и требуемой чувствительности обнаружения (обычно диктуемой количеством образца, загруженного на гель). Следует также отметить, что источник света, необходимый для цифрового изображения этого геля, может варьироваться в зависимости от плотности образца и количества времени разработки, необходимого в процессе окрашивания. Гели, которые быстро развиваются и производят окрашенные серебром полосы, легко видимые невооруженным глазом, потребуют УФ-трансиллюминации для получения лучших изображений, так как большая часть света будет поглощаться непрореагировавым альциановым синим. Гели, которые требуют более длительного времени разработки (например, с очень небольшим количеством образца), потребуют либо эпиосвещения, либо трансиллюминации с нормальным светом полного спектра, так как это будет лучше всего поглощено серебряным пятном.
Еще одной сильной стороной этого метода является то, что он особенно адаптируется к лабораториям наук о жизни из-за его основы в простой технологии PAGE, с использованием оборудования и реагентов, которые обычно доступны и дешево приобретаются. Хотя существуют и другие подходы к количественной оценке длины изолированных полимеров GAG (например, капиллярный электрофорез), они, как правило, требуют как знаний, так и оборудования, которое обычно не доступно в большинстве лабораторий наук о жизни15,16. Простота этого подхода и относительно доступный и доступный характер необходимых реагентов делают этот метод легко адаптируемым исследователями в области наук о жизни, заинтересованными в изучении биологии GAG в контексте их заданных подполей. Кроме того, этот метод служит важным дополнением к методам обнаружения ГАГ в биологических тканях, основанным на масс-спектрометрии. В то время как подходы, основанные на масс-спектрометрии, способны обнаруживать GAG с высокой чувствительностью и различать тонкие различия в структуре из сложных образцов17,из-за природы технологии она не способна различать полимеры GAG по размеру. По этой причине подход, основанный на PAGE, имеет важное значение для разгадывания размера полимеров HS в биологических образцах, представляющих интерес.
Важно отметить, что существует несколько ограничений для методов, описанных в этой статье. Первый и наиболее заметный заключается в том, что из-за взаимодействия заряд-заряд, которые являются центральными в реакции окрашивания алциановым синим цветом, этот подход является высокоселективным для высокосульфатированных GAG и будет только слабо окрашивать более нейтрально заряженные части (например, гиалуроновая кислота18). Таким образом, этот метод, вероятно, сместит свои результаты в сторону более кислых gaG-створок. По этой причине дополнительные подходы к измерению содержания ГАГ в интересующих биологических образцах (например, методы, основанные на масс-спектрометрии) должны использоваться дополнительно, чтобы обеспечить более полную картину ГАГ, присутствующих в экспериментальных образцах. Кроме того, для конечных пользователей, специально заинтересованных в измерении размера гиалуронана, другие описали аналогичные методы на основе PAGE, которые используют биотинилированный белок, связывающий гиалуроновую кислоту (HABP), который может быть адаптирован к базовому методу, описанной здесь19.
Таким образом, метод, представленный в этой статье, может быть использован для выделения, очистки и обнаружения GAG из биологических образцов с большой чувствительностью и специфичностью, а также для измерения собственной длины этих полисахаридных цепей. Эта информация может иметь решающее значение для проверки гипотез о взаимодействиях GAG-лигандов из-за важности длины полимера GAG в определении родственного сродства связывания лигандов. Этот подход имеет ряд преимуществ, в первую очередь его относительную простоту и адаптивность к исследовательским лабораториям наук о жизни, хотя он ограничен его относительным уклоном в сторону отрицательно заряженных gaG-компонентов. Несмотря на этот недостаток, этот метод представляет собой надежный инструмент, который побудит исследователей изучать роль ГАГ в гомеостазе и заболеваниях органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL и EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
