Summary
이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.
Abstract
헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 황산 글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스이며 다양한 기본적인 생물학적 구조 및 공정에서 중요한 역할을 한다. 폴리머로서 GAG는 4000 Da에서 40,000 Da까지 다양하게 함유된 다당류 체인을 함유하는 다분산 혼합물로 존재합니다. 이러한 사슬 내에는 음전하의 도메인이 존재하며, 이는 cognate 단백질 리간드의 양전하 잔류물과의 상호 작용을 용이하게 하는 음전하 패턴을 부여합니다. GAG의 황질 도메인은 이러한 정전기 상호 작용을 허용하기에 충분한 길이여야 합니다. 생물학적 조직에서 GAG의 기능을 이해하려면 조사원은 GAG의 크기를 분리, 정화 및 측정할 수 있어야 합니다. 이 보고서는 다양한 생물학적 조직 유형에서 분리된 GAGs 간의 크기 차이를 비교적 작은 차이를 해결하기 위해 활용할 수 있는 실용적이고 다재다능한 폴리아크릴아미드 젤 전기포고제 기반 기술을 설명합니다.
Introduction
글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스 원소이며 많은 기본적인생리적과정에 기여하는 선형 다당류의 다양한 가족이다. 헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 GAGs는 다당류 사슬을 따라 뚜렷한 위치에서 황살이 될 수 있으며, 부정적인 전하의 지리적 영역을 부여한다. 이들 GAGs는 프로테오글리칸으로 알려진 세포 표면 단백질에 테더링될 때 세포 외 공간으로 투영하여 코그네이트 리간드에 결합하여 시스-(동일한 세포에 부착된 리간드) 및 트랜스-(이웃 세포에 부착된 리간드) 신호 공정2의조절을 허용한다. 또한, GAGs는 또한 구체 지하 막3,혈관 내피 글리코릭스4 및 폐 상피 글리코릭스5,및 결합 조직(연골6)과같은 조직에서 구조적 요소로서 중요한 역할을 수행한다.
GAG 다당류 체인의 길이는 생물학적 맥락에 따라 크게 다르며 매우 복잡한 효소 규제 시스템7에의해 동적으로 길어지고, 갈라지고, 수정될 수 있다. 중요한 것은, GAG 폴리머 사슬의 길이는 리간드에 대한 그들의 결합 친화성에 실질적으로 기여하고, 그 후, 그들의 생물학적 기능에8,9. 이러한 이유로, 내인성 GAG의 기능의 결정은 그 크기의 감사를 필요로한다. 불행히도, 단백질과 핵산과는 달리 GAGs를 감지하고 측정하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 기술은 거의 존재하며, 이는 역사적으로 이 다양한 다당류 제품군의 생물학적 역할에 대한 비교적 제한된 조사를 초래했습니다.
이 문서에서는 대부분의 생물학적 조직에서 GAG를 분리하고 정화하는 방법에 대해 설명하고, 또한 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE)을 사용하여 분리된 폴리머의 길이를 공정한 수준의 특이성을 평가하는 방법을 설명합니다. 다른, 매우 복잡 한 (그리고 종종 질량 분광계 기반) 글리코믹 접근 과는 달리, 이 방법은 표준 실험실 장비 및 기술을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 따라서 이러한 실용적인 접근법은 원주민 GAGs의 생물학적 역할과 문맥적으로 중요한 리간드와의 상호 작용을 결정하는 조사관의 능력을 확장할 수 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 샘플은 콜로라도 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 마우스로부터 수득되었습니다.
1. 헤파란 황산염 고립
- 조직 샘플의 탈지
참고: 탈지화는 지방이 풍부한 조직을 위한 선택 사항입니다.- 메탄올과 디클로로메탄의 1:1 혼합물을 만듭니다. 샘플 당 약 500 μL을 준비; 조직의 큰 조각은 1 mL까지 필요할 수 있습니다.
- 각 조직 샘플을 탈착을 위해 뚜껑이 있는 작은 유리 용기에 넣습니다.
참고: 샘플 질량은 관심 있는 조직 및 실험적인 필요에 따라 다를 수 있습니다. 50 mg 이하는 일반적으로 적절한 GAG 수율에 충분하지만 최종 사용자가 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. - 메탄올:디클로로메탄 용액의 500μL을 각 유리 용기에 넣고 섞습니다. 모든 고체 조직 샘플이 용매에 완전히 침수되었는지 확인합니다.
참고: 혈탄고 피펫 또는 플라스틱 원판 튜브를 사용하여 메탄올/디클로로메탄 용액을 혼합하고 처리합니다. 다른 플라스틱은 용해될 수 있습니다. - 시료를 쉐이커(고정 랙에 고정랙)에 놓고 1시간 동안 부드럽게 교반합니다.
- 4°C에서 5분 동안 17,000 x g에서 17,000 x g에서 샘플을 혼합하고 원심분리기를 교반합니다.
- 유기 용매 분획 (상수)을 조심스럽게 피펫. 이것은 지질 분획입니다 - 그것은 GAG를 포함하지 않으며 폐기 할 수 있습니다.
참고 : 작은 조각을 잃을 수 있기 때문에 조직을 방해하지 않도록하십시오. 시료 손실을 위험시키기보다는 시료 용기에 일부 유기층을 두는 것이 바람직하다. - 유리 용기의 뚜껑을 열어 두고 후드에서 하룻밤 동안 증발하게 하십시오. 그 튜브는 추가 처리에서 살아남지 않을 것이기 때문에 다음 단계에 대한 튜브를 변경합니다.
- 용매 혼합물이 완전히 증발되면 기계적 붕괴 (잔류 샘플이 >50 mg인 경우) 또는 액티나아제 E 소화 (< 50 mg)로 진행하십시오.
- 고체 조직의 기계적 붕괴 (선택 사항; 더 큰 조직 샘플의 경우)
참고: 고체 조직의 가장 작은 조각 (약 50 mg 이하) 소화 단계 동안 완전히 용해 해야 합니다. 그러나, 더 큰 견본은 기계적 붕괴를 요구할 것입니다.- 적절한 크기의 폴리 프로필렌 튜브에 배치하고 액체 질소에 폐쇄 튜브를 배치하여 관심의 플래시 동결 샘플. 샘플이 완전히 단단할 때까지 고정되도록 합니다.
- 깨끗한 박격포와 유봉을 사용하여 냉동 샘플을 분말과 같은 일관성으로 분쇄합니다.
- 액티나아제 E 소화(1.4단계)로 직접 진행합니다.
- 시료 탈염 및 농도
참고: 이것은 선택적 단계이며 희석 된 액체 조직 샘플 (예를 들어 기관지-폐포라 라베액 (BALF) 또는 플라즈마에만 필요합니다.- 적절한 실험 그룹으로 액체 샘플을 풀 (예를 들어, 생물학적 복제, 또는 실험 그룹에 의해)
- 총 샘플 볼륨을 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣고 3,000Da의 분자량 차단(MWCO)을 제공합니다.
- 실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.
- 각 컬럼을 400 μL의 탈량, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.
- 필터를 반전시키고 2,000xg에서 1분 동안 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브를 사용할 수 있습니다. -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.
- 액티나아제 E 소화
참고: 이 단계는 시료에서 단백질 오염 물질을 소화하고 궁극적으로 제거하는 데 필요합니다.- 10 mg/mL의 원하는 농도에 재조합 액티나아제 E와 샘플을 혼합1:1. 10배 소화 버퍼 농축액의 적절한 부피를 추가합니다. 원하는 최종 농도: 0.005 M 칼슘 아세테이트 및 0.01 M 아세테이트 나트륨, pH 7.5. 예를 들면: 액체 견본의 190 μL, 20 mg/mL Actinase E의 190 μL, 0.05 M 칼슘 아세테이트의 20 μL, 0.1 M 아세테이트 나트륨.
- 부드럽게 섞어 샘플을 동요한 다음 55°C에서 48-72h (전체 조직에 대해 최대 7 일까지 소화).
- 15-20 분 동안 80 °C로 가열하여 Actinase E를 가열합니다.
- 샘플을 -80°C로 동결하거나 1.5단계를 계속합니다.
- 시료 탈염 및 농도
참고: 생물학적 시료에서 낮은 양의 GAG가 예상되거나, 소모성 시약(즉, 원심 필터 컬럼)의 보존이 바람직한 경우, 샘플은 실험 군당 단일 농축액(예를 들어, 생물학적 복제 또는 실험군에 의한)을 생성하기 위해 풀로 풀을 수 있다.- 총 샘플 볼륨을 MWCO3,000 Da로 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣습니다.
- 실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.
- 각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.
- 필터를 뒤집어 2,000 x g에서 1분 동안 회전하여 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브(일반적으로 원심 필터 컬럼에 포함). -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.
- 건조
- 어느 단계1.5.5에서 용해 된 샘플을 하룻밤 회전 진공 농축기에 배치하거나 아래에 자세히 설명된 대로 샘플을 lyophilize.
- 하룻밤 사이에 -80°C또는 액체 질소에 담그면 샘플을 철저히 동결하십시오.
- 18G 바늘로 뚜껑을 관통하고 리오필라이저 챔버에 놓습니다. 필요에 따라 포장을 위한 종이 타월을 추가합니다.
- lyophilizer 챔버를 리오필라이저로 수정하고 하룻밤 동안 건조를 동결하십시오 (적어도 -40 °C, 0.135 Torr)
- 양이온 교환 열
- 8M 우레아의 최대 400 μL, 2% CHAPS 솔루션(또는 샘플을 풀링하는 경우 n = 원하는 풀의 샘플 수인 400/n)으로 다시 일시 중단합니다. 가능한 한 세제 용액을 적게 사용하십시오.
- 8M 우레아의 400 μL, 2% CHAPS 용액으로 양이온 교환(IEX) 컬럼을 상형화합니다. 실온에서 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
- 400 μL의 샘플/풀로 된 샘플을 IEX 열에 로드합니다. 2,000 x g에서5 분 동안 회전하십시오.
- 8M 우레아 400μL, 2% CHAPS 용액으로 3배 세척합니다. 매번 2,000 x g에서 5분 간 회전하십시오.
- Elute 3x 와 400 μL 의 0.2 M NaCl. 각각 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오. 이것은 낮은 선호도 분획입니다 - 이것은 원하는 경우 품질 관리 목적을 위해 유지 될 수 있습니다.
- 2.7M(16%) NaCl의 400 μL을 가진 엘루트 3배. 각각 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오. 이 분획은 관심의 고립 된 글리코 아미노 글리칸을 포함 합니다-그것의 모든 유지!
- 각 에출 분획을 탈염하려면 메탄올을 최대 80vol %까지 추가하고 하룻밤 사이에 4 °C에서 배양하십시오. 2,000 x g에서 각 샘플을 5 분 동안 회전하십시오. 이 건조 염자 글리코사미노 글리칸으로 고체 잔류물을 복구.
참고: 또는, 이 단계를 건너뛰고 메탄올 없이 용액을 소금에 절하는 1.8단계를 진행한다.
- 시료 탈염 및 농도
- 필요한 경우, 풀은 분획(1.7.6에서) 적절한 실험 군(예: 생물학적 복제 또는 실험 군에 의한)으로 용출하였다.
- 총 샘플 볼륨을 MWCO3,000 Da로 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣습니다.
- 실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.
- 각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다. 1.9단계로 직접 진행합니다.
- 콘드로이틴 소화
참고: 이 단계의 목적은 최종 사용자에게 관심이 없는 GAG를 제거하는 것입니다. 이 경우, 콘드로이티나제는 연골을 제거하는 데 사용된다. 대표적인 결과(기관지-폐포라 라베지 유체 및 전체 폐)를 생성하는 데 사용되는 조직에서, 연골황산염을 소화하면 헤파란 황산염을 1차 잔류 개그로 나뭇잎이 된다. 최종 사용자는 실험 목표에 따라 추가 소화 단계를 추가해야 할 수 있습니다.- 350 μL의 소화 버퍼(50mM 암모늄 아세테이트 와 2mM 염화염화 pH 7.0로 조정)를 멤브레인을 건드리지 않고 원심 필터 컬럼에 적재한다.
- 재조합 연골 연골 ABC의 5 μL을 추가합니다.
- 샘플 튜브를 37°C 오븐에 넣고 1시간 동안 배양합니다.
- 컬럼을 뒤집어 적절히 레이블이 붙은 수집 튜브로 배치합니다. 2000 x g에서1 분 동안 회전하십시오.
- 15-20 분 동안 80 °C로 샘플을 가열하여 연골 증액 ABC를 비활성화합니다.
- 시료 탈염 및 농도
- 필요한 경우, 풀 콘드로이틴은 1.9.5 단계에서 적절한 실험 그룹으로 샘플을 소화했습니다(예: 생물학적 복제 또는 실험 군에 의한)
- 총 샘플 볼륨을 MWCO 3,000 Da로 500 μL 원심 필터 열에 넣습니다.
- 실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.
- 각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.
- 필터를 반전시키고 2,000 x g에서 1분 동안 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브를 사용할 수 있습니다. -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.
- 건조
참고: 이 단계에서는 가능한 한 적은 양의 물과 흐르는 버퍼에서 샘플을 다시 일시 중단할 수 있도록 건조가 필요합니다.- 한 단계에서 연골 소화 샘플을 배치 1.10.5 회전 진공 농축기 하룻밤 또는 다음과 같이 lyophilize:
- 하룻밤 사이에 -80°C또는 액체 질소에 담그면 샘플을 철저히 동결하십시오.
- 18G 바늘로 뚜껑을 관통하고 리오필라이저 챔버에 놓습니다. 필요에 따라 포장을 위한 종이 타월을 추가합니다.
- lyophilizer 챔버를 리오필라이저로 수정하고 하룻밤 동안 건조하게 얼립니다 (적어도 40 °C, 0.135 Torr)
2. 고립되고 정제된 글리코아미노글리칸의 폴리아크릴아미드 젤 전기포아
- 폴리아크릴아미드 젤 전기포에 필요한 솔루션을 미리 준비(표1).
참고: 시료에 있을 것으로 예상되는 글리코사미노글리칸의 크기에 따라 젤 용액을 해결하는 백퍼센트 아크릴아미드를 선택합니다. 15%는 더 큰 조각(길이 30개 이상의 소멸 하위 단위) 문제를 해결하는 데 권장됩니다. 22% 작은 조각에 대 한 (<20 길이의 소멸 하위 단위). - 빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 다음과 같이 해결 젤을 캐스팅 : 15 mL 튜브에서, 젤 용액의 10 mL, 10 % 암모늄 과황산염의 60 μL (갓 준비해야합니다), TEMED의 10 μL (TEMED 마지막 추가)를 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 2-3배 반전시다. 파이펫을 사용하여 위의 10mL 솔루션을 카세트에 빠르게 추가합니다. 2mL의 탈이온화, 여과된 물로 오버레이하여 30분 동안 젤을 중합할 수 있도록 합니다.
참고: 다음 PAGE 프로토콜은 총 부피가 약 12mL인 13.3 x 8.7cm(너비 x 길이) 1.0mm 두께의 주조 카세트를 사용하여 수직 페이지 시스템에 최적화되었습니다. 다른 카세트 시스템을 사용할 수 있지만 최종 사용자가 최적화해야 할 수 있습니다. - 해결 젤이 완전히 중합된 후, 오버레이 된 물을 버리고 스태킹 젤을 다음과 같이 캐스팅 : 15 mL 튜브에서, 스태킹 젤 용액의 3 mL, 10 % 암모늄 아황 의 90 μL (갓 준비해야합니다), TEMED의 3 μL (TEMED 마지막 추가).
- 튜브를 부드럽게 2-3배 반전시다. 파이펫을 사용하여 고화된 해결 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 카세트를 챙으로 채웁니다. 설정에 포함된 빗을 완전히 삽입합니다. 스태킹 젤을 30분 동안 중합하도록 허용합니다.
- 젤이 중합되면 테이프 스트립이 카세트 바닥에서 제거되었는지 확인하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다.
- 상하 챔버 버퍼를 각각 채웁니다.
- 건조된 시료를 1.11.4 단계에서 최소한의 필요한 대용량으로 녹여서 여과된 수역(PAGE 젤내 의 우물 부피의 50%). 1:1을 샘플 로딩 버퍼와 섞습니다. 샘플과 HS 올리고사카라이드 "사다리"(표 1참조)를 젤에 적재합니다.
- 100 V에서 5 분 동안 젤을 미리 실행하십시오. 그런 다음 20-25 분 (15 % 폴리 아크릴아미드 해결 젤), 40-50 분 (18 % 폴리 아크릴아미드 해결 젤), 90-100 분 (22 % 폴리 아크라이클라미드 해결 젤)에 대해 200 V에서 젤을 실행합니다.
참고: 200 V 런타임의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 페놀 레드는 길이 2폴리머 서브유닛인 헤파린 올리고당오리라이드보다 먼저 이동합니다(즉, 중합2 또는 dp2의 정도); 브로모페놀 블루는 dp10-dp14보다 먼저 이동합니다. 페놀 레드 밴드가 젤 의 바닥으로 거의 마이그레이션되지만 정반대가 아니라 전압이 적용될 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 그에 따라 런타임을 조정합니다.
3. 실버 염색 프로토콜
- 실버 염색에 필요한 모든 솔루션을 미리 준비하십시오(표2).
참고: PAGE 젤이 스테인드, 개발 및 정지 용액에 배치될 때까지 직접 만지지 마십시오. 대신 깨끗한 플라스틱 또는 유리 도구를 사용하여 젤을 조작합니다. 젤을 직접 처리하면 염색 후 겔에 손가락 인쇄 왜곡 및 기타 눈에 보이는 아티팩트가 생성됩니다. - 실행이 완료되면, 탈이온화, 여과 된 물로 채워진 깨끗하고 중간 큰 용기에 카세트와 추출 젤을 분해합니다.
참고: 젤을 직접 취급하지 않으려면 파이펫 팁이나 기타 플라스틱 물체를 사용하여 물에 잠긴 상태에서 카세트에서 젤을 부드럽게 벗깁니다. 젤은 깨지기 쉬우며 조심스럽게 처리하십시오.- 물을 버리십시오. 알시안 블루 스테인딩 용액으로 젤을 5분 간 염색합니다.
- 알시안 블루 얼룩을 버리십시오. 알시안 블루 스테닝 솔루션의 대부분이 제거 될 때까지 탈이온, 여과 된 물로 2-3 배 빠르게 헹구고 씻습니다.
- 로커에서 하룻밤 사이에 변조되고 여과된 물에 얼룩을 내도록 하십시오. 잔류 얼룩이 밤새 젤에서 완전히 세척되도록 충분한 양의 탈이온화된 여과된 물이 있는지 확인하십시오.
- 젤을 50% 메탄올로 씻어내며(총 40분, 변경 용액 2~3배).
- 젤을 탈이온화물로 30분 동안 씻으시면 됩니다. 물을 버리고 총 2 시간 동안 3 시간을 더 반복하여 매번 물을 대체하십시오.
- 신선하고 깨끗한 용기에 은질산염 염색 용액으로 30분 동안 젤을 염색합니다.
- 탈이온화된 여과된 물에 2-3배 빠르게 헹구고 씻어 실버 염색 용액을 완전히 제거합니다.
- 탈이온, 여과 된 물에 30 분 동안 씻으라. 물을 버리고 총 90 분 동안 2x를 반복하여 매번 수조를 교체하십시오.
- 물을 버리고 개발 솔루션을 추가합니다.
- 개발 솔루션이 추가되면 조심스럽게 젤을 관찰하고 밴드의 모양을 조심하십시오. 얼룩의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 개발은 몇 초에서 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 원하는 밴드가 표시되자마자 개발 용액을 즉시 폐기하고 스톱 솔루션으로 간단히 세척하십시오.
- 스톱 용액 세척을 버리고 신선한 정지 솔루션으로 대체하십시오. 로커 나 셰이커에 1 시간 동안 담그십시오.
- 디온화된 여과된 물로 하룻밤 간 세척하십시오(그러나, 젤은 정해세척 직후에 이미지될 수 있음).
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Representative Results
알시안 블루는 황산 GAGs 10을염색하는 데 사용된다; 이 신호는 후속 실버 얼룩(11)을사용하여 증폭된다. 도 1은 은 염색 개발 프로세스의 시각적 데모를 제공합니다. 입증된 바와 같이, 발전에이전트가 폴리아크릴아미드 젤을 관통함에 따라 전기포고증에 의해 분리된 GAGs를 나타내는 알시안 청색 신호가 증폭된다. 일반적으로 개발 과정은 밀도 종속 방식으로 은과 알시안 블루 스테인드 GAG를 감소시키고, 각 대역의 가장자리는 먼저 감소하는 반면 중앙의 더 조밀하게 염색된 영역은 마지막으로 얼룩지게 됩니다.
문헌에서, PAGE 기반 접근법을 이용한 GAG검출의 보고된 한계는 0.5-1 μg12,13범위입니다. 우리의 접근법을 이용한 검출 한계를 결정하기 위해, 다양한 폴리머 길이(굴절되지 않은 헤파린, dp20, dp10, dp6)의 헤파란 황산염 올리고당류를 22% 폴리아크라이글라미드 젤에 적재한 다음, 위에서 설명한 바와 같이 염색하였다. 각 올리고사카라이드는 두 개의 서로 다른 질량에 두 번 로드되었다: 1.0 μg 와 0.5 μg. 그림 2는 우리의 기술이 매우 쉽게 정제 된 GAG의 0.5 μg를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 특히, 굴절되지 않은 헤파린은 각 개별 대역의 밀도를 감소시키는 폴리머 크기의 광범위한 분포로 인해 테스트된 4개의 상이한 올리고당류에서 가장 쉽게 검출되었다.
액체 생물학적 샘플에서 GAG 정제의 효율을 평가하기 위해 GAGs는 두 개의 기관지알포라 라베지 (BAL) 샘플에서 분리되었습니다. 도 3에도시된 바와 같이, GAG 절연에 사용되는 첫 번째 샘플은 내장 지질 폴리사카라이드(LPS)(3 mg/kg) 후 마우스로부터 수확된 BAL 유체의 1mL(3 mg/kg)였으며, 폐포 상피 HS 흘리기 5를유도하도록 투여하였다. 10 μg의 시판 가능한 dp6은 격리 과정에서 GAG의 손실을 평가하기 위해 "스파이크 인" 제어 역할을 하기 위해 이 BAL 유체에 직접 첨가되었다. B로 표시된 두 번째 샘플은 외인성 GAG 스파이크인 없이 24시간 이전에 간 내 LPS(3 mg/kg)를 투여받은 3마리의 마우스로부터 풀링된 BAL 유체10mL로 구성되었다. 두 샘플 모두 GAG 절연을 위해 동시에 처리되었고, 이온 교환 열에서 출루된 모든 3개의 분수는 유지되고 더 많은 처리되어 어떤 GAG가 낮은 친화성 및 세척 분수에 존재했는지 여부를 결정하였다. 2 μg의 상업적으로 구입 된 dp20, dp10, dp6 heparan 황산염 올리고당류는 각 eluted 분획에서 HS GAG의 크기를 질적으로 평가하는 기준을 제공하기 위해 이러한 샘플과 함께 PAGE 젤에서 실행되었으며, 10 μg "스파이크"와 밀도를 비교하는 참조를 제공합니다.
고체 조직에 이 기술의 사용을 입증하기 위해, 헤파란 황산염은 위에서 설명한 바와 같이 냉동 마우스 폐의 15 mg 조각으로부터 분리되었다. 격리 및 정화 과정에서, 이온 교환 열에서 발루된 낮은 친화 분수(0.2 M NaCl)는 높은 친화도(2.7M NaCl) 분획과 함께 유지 및 처리되어겔(도 4)에서실행되었다. 2 μg의 상업적으로 구입 된 dp20, dp10 및 dp6 heparan 황산 염 올리고당 올리고차라이드는 크기에 대한 참조를 제공하기 위해 이러한 샘플과 함께 실행되었다. 볼 수 있듯이, 전체 폐 균모네이트는 dp10 크기와 거의 동일한 가장 작은 조각으로, 고립 된 HS의 충분한 양을 산출했다. 2.7 M NaCl 분획에서 알시안 블루/실버 얼룩 열렬한 콘텐츠 GAGs의 상대적 농축은 헤파란 황산염이 이온 교환 열에 높은 친화력으로 결합하고 높은 특이성을 가진 컬럼을 발례할 수 있음을 보여준다. 전체 폐 균모네이트는 절연 헤파란 황산염 (2.7 M NaCl 분획)의 충분한 양을 산출, 크기에서 dp10 거의 동일한 작은 조각.
그림 1: 실버 얼룩 개발 과정. 전자포광에 의해 분리된 굴절되지 않은 헤파린(UFH) 또는 크기 정의 올리고당류(dp = 폴리머화정도)의 알시안 블루 염색은 은 염색에 의해 증폭된다. 왼쪽에서 오른쪽으로: UFH, dp20, dp10, dp6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 헤파란 황산염검출을 위한 폴리아크릴아미드 젤과 은얼룩의 감도. 다양한 길이의 헤파란 황산염 올리고당(분별되지 않은 헤파린 일명 UFH, dp20, dp10, dp6)은 22% 폴리아크릴아미드 젤에 올라 와 달리며 은색으로 염색하였다. 각 올리고사카라이드는 1.0 μg(좌측 대역)와 0.5 μg(가장 오른쪽 밴드)의 두 개의 서로 다른 질량에 두 번 로드되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 액체 생물학적 샘플에서 GAG 정제의 효율. "A"와 "B"로 표시된 두 개의 기관지알베일라 라베이지(BAL) 샘플에서 분리된 GAGs는 22% 폴리아크릴아미드 젤과 은 염색으로 실행되었습니다. 샘플 A는 3 mg/kg 내장 내 지방 폴리사카라이드 (LPS)로 치료 후 마우스24 h에서 수확 한 BAL 유체의 1mL로 구성되었습니다. dp6 HS의 추가 10 μg가 이 샘플에 "스파이크 인" 제어로 추가되었습니다. 샘플 B는 LPS 투여 후 24시간 3마우스로부터 수집된 풀링된 BAL 유체10mL로 구성되었다. 각 샘플은 희석제("wash") 또는 NaCl(0.2M)의 낮은 농도로 용출된 이온 교환 컬럼의 분수와 함께 실행되었다. 상업적으로 구입한 dp20, dp10 및 dp6 헤파란 황산염 올리고당류의 2 μg가 크기 참조(좌측 대역)로 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 건강한 마우스 폐로부터 분리되고 정제된 헤파란 황산염의 크기를 측정합니다. 헤파린 황산염 함량은 건강한 마우스로부터 분리된 폐의 15 mg 냉동 샘플에서 분리및 정제되어 22% 폴리아크라이알라미드 젤로 실행됩니다. Heparan 황산염은 NaCl의 낮은 농도(0.2M; 낮은 선호도 분획) 또는 고농도(2.7M, 16% 용액; 고친화 분분)를 가진 이온 교환 기둥으로부터 출루되었다. 상업적으로 구입한 dp20, dp10 및 dp6 헤파란 황산염 올리고당류의 2 μg가 크기 참조(좌측 대역)로 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 참고: 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링(0.22μm)이어야 합니다. | |||
| 용액 | 처방 | 구성 | 코멘트 |
| 젤/하부 챔버 실행 버퍼 해결(2L 또는 4L) | 보릭산, MW 61.83 | 2L: 12.36 g; 4L: 24.76 g | 원하는 농도: 0.1M |
| 트리스 베이스, MW 124.14 | 2L: 24.2 g; 4L: | 원하는 농도: 0.1M | |
| 디소르소나트륨 EDTA MW 336.21 또는 이수제, MW 372.36 | 2L: 각각 6.7g 또는 7.4g; 각각 4L 13.4 g 또는 14.8g | 원하는 농도: 0.01 M | |
| 탈이온수 | 2L 또는 4L | 시약을 완전히 용해한 후 pH를 8.3으로 조정 | |
| 상부 챔버 러닝 버퍼(1 L) | 글리신 | 93 g | 원하는 농도: 1M |
| 트리스 베이스, MW 124.14 | 24.2 g | 원하는 농도: 0.2M | |
| 탈이온수 | 1 L | ||
| 젤 해결, 총 아크릴아미드 22% (500mL) | 아크릴아미드, MW 71.08 | 100.1 g | 원하는 농도: 20.02% w/v |
| N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드 (비스, MW 154.17) | 10 g | 원하는 농도: 2% w/v | |
| 자당 | 75 g | 원하는 농도: 15% w/v | |
| 젤 버퍼 해결 | 500 mL | 총 500mL로 가져오기; 버퍼 합계가 500mL 미만이 필요합니다. | |
| 젤 해결, 총 아크릴아미드 15% (400mL) | 아크릴아미드, MW 71.08 | 56.3 g | 원하는 농도: 14.08% w/v |
| N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드 (비스, MW 154.17) | 3.7 g | 원하는 농도: 2% w/v | |
| 자당 | 20.8g | 원하는 농도: 15% w/v | |
| 젤 버퍼 해결 | 400mL | 총 400mL의 부피를 가져와; 버퍼 합계가 400mL 미만이 필요합니다. | |
| 스태킹 젤 (100 mL) | 아크릴아미드, MW 71.08 | 4.75 g | 원하는 농도: 4.75% w/v |
| N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드 (비스, MW 154.17) | 0.25 g | 원하는 농도: 0.25% w/v | |
| 젤 버퍼 해결 | 100 mL | 80mL 버퍼와 전체 용해 시약을 추가합니다. 그런 다음 염산으로 pH를 76.3으로 조정하여 드롭와이즈로 조정합니다. 그런 다음 젤 버퍼를 해결하여 총 100mL의 부피를 가져옵니다. | |
| 샘플 적재 버퍼(500mL) | 자당 | 250g | 원하는 농도: 50% w/v |
| 페놀 레드 | 500mg | 원하는 농도: 1mg/mL | |
| 브로모페놀 블루 | 250mg | 원하는 농도: 0.5mg/mL | |
| 탈이온수 | 500mL | 총 500mL로 가져오기; 총 수분 500mL 미만이 필요합니다. | |
| 헤파린 유래 올리고사차라이드 '사다리' (각 2mL) | dp6 | 0.1mg | 참고: 헤파린 유래 올리고당 6 폴리머 서브유닛(일명 중합6 또는 dp6)을 사용하여 가장 작은 대역용 dp20, 중간 대역의 dp10을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 원하는 경우 다른 조합을 사용할 수 있습니다. 원하는 농도: 0.05 mg/mL |
| dp10 | 0.1mg | ||
| dp20 | 0.1mg | ||
| 탈이온수 | 3mL | 각 올리고사카라이드를 각각 1mL로 별도의 튜브에 녹입니다. | |
| 샘플 로드 버퍼 | 3mL | 각 올리고당카라이드 용액에 1mL(1:1 혼합물) 추가 | |
표 1: 정제된 글리코아미노글리칸의 폴리아크릴아미드 젤 전기포에 필요한 솔루션. 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링(0.22 μm)이어야 합니다.
| 참고: 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링(0.22μm)이어야 합니다. | |||
| 용액 | 처방 | 구성 | 코멘트 |
| 알시안 블루 스테인딩 솔루션 (500mL) | 알시안 블루 8GX 파우더 | 2.5g | 원하는 농도: 0.5% w/v |
| 2% v/v 빙하 아세트산 | 500mL | ||
| 실버 스테인 (200 mL) | 탈이온수 | 192.7 mL | 얼룩 솔루션을 신선하게 준비; 1주일 이내에 사용하십시오. |
| 7.6M 수산화나트륨 | 2 mL | 만들려면 수산화 나트륨 펠릿 3.04g을 10mL 물에 추가하십시오. | |
| 수산화 암모늄 | 3.3mL | ||
| 4M 실버 질산염 용액 | 2 mL | 만들려면 3.397 g의 질산염을 5mL 물에 추가하십시오. 강수량을 피하기 위해 저어주면서 드롭와이즈를 추가합니다. | |
| 개발 솔루션 (501 mL) | 탈이온수 | 500 mL | 개발 솔루션은 24시간 이내에 신선하게 제작되어야 합니다. |
| 구연산 2.5% | 1 mL | 만들려면 100mg을 4mL 의 탈온 화 된 물에 추가하십시오. 구연산은 신선하게 만들어야 합니다. | |
| 포름알데히드 | 250μL | ||
| 정지 용액 (500 mL) | 탈이온수 | 300mL | |
| 빙하 아세트산 | 20mL | ||
| 메탄올 | 90mL | ||
표 2: 폴리아클로미드 젤 전기포고증으로 분리된 글리코소아미노글리칸의 은 염색에 필요한 솔루션입니다. 모든 솔루션은 사용하기 전에 필터링(0.22 μm)이어야 합니다.
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Discussion
GAGs는 다양한 생물학적 프로세스에서 중심적인 역할을 합니다. 황화 GAGs (HS 및 CS와 같은)의 주요 기능 중 하나는 다운스트림 신호 기능을 변경할 수있는 리간드와 상호 작용하고 결합하는 것입니다. 개그 결합 친화성의 중요한 결정요인은 GAG 폴리머 체인 8,9,14의길이이다. 이러한 이유로, 연구원은 합리적인 정밀하게 관심의 생물학적 샘플에서 분리 된 GAG 체인의 크기를 정의 할 수 있어야합니다. 실용적이기 위해 이 기술은 일반적인 실험실 장비와 시약을 사용하여 수행될 수 있어야 합니다.
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 GAG를 분리하고 정화하고 PAGE를 통해 크기별로 분리하고 Alcian 파란색 및 은 염색 기술을 사용하여 시각화하는 방법을 설명합니다. 크기별로 글리코아미노글리칸을 분리하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 우리의 접근 방식은 생명 과학 실험실에서 이 기술을 적용한 데 특정한 몇 가지 강점을 가지고 있습니다. 첫째, 0.5 μg의 검출 한계를 가진 이 기술은 관심 있는 GAG의 검출에 매우 민감합니다. 우리의 경험에서, GAGs (즉, BAL 유체 샘플)의 상대적으로 낮은 농도를 포함하는 샘플조차도이 방법을 사용하여 검출을위한 충분한 GAG를 산출해야합니다. BAL 유체의 격리 및 정제로 인한 수율은 기술과 특정 GAG관심에 따라 다르지만, 10mL의 원시 BAL 유체는 이 기술을 사용하여 검출할 수 있는 충분한 HS를 산출하는 것이 우리의 경험이었습니다. 고체 장기의 수율은 수확된 조직에 따라 실질적으로 더 높지만, 10 mg의 초기 고체 샘플이 이 기술을 사용하여 검출을 위한 충분한 HS를 산출할 것이라는 것은 우리의 경험입니다.
스테인드 페이지 젤의 최종 이미징은 최종 사용자가 사용할 수있는 이미징 기술에 따라 달라질 것이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 젤의 디지털 사진은 사용 가능한 장비및 필요한 검출 감도(일반적으로 젤에 로드된 샘플의 양에 따라 결정됨)에 따라 다양한 상용 젤 문서화 시스템 또는 일반 상용 카메라를 포함하여 다양한 시스템을 사용하여 촬영할 수 있습니다. 또한 이 젤을 디지털화하는 데 필요한 광원은 시료의 밀도와 염색 과정에서 필요한 개발 시간의 양에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의해야 한다. 빠르게 발달하고 육안으로 쉽게 볼 수있는 은 색 얼룩 밴드를 생산하는 젤은 빛의 대부분이 반응하지 않은 알시안 블루에 의해 흡수될 것이기 때문에 최고의 이미지에 대한 UV transillumination이 필요합니다. 더 긴 개발 시간 (예 : 매우 적은 양의 시료를 가진 젤)은 실버 얼룩에 가장 잘 흡수될 것이기 때문에 정상적인 전체 스펙트럼 광으로 에피 조명 또는 과실무가 필요합니다.
이 기술의 또 다른 강점은 일반적으로 사용할 수 있고 저렴하게 획득되는 장비와 시약을 사용하여 간단한 PAGE 기술의 기초로 인해 생명 과학 실험실에 특히 적응할 수 있다는 것입니다. 고립 된 GAG 폴리머 (예를 들어, 모세관 전기 포근)의 길이를 정량화하는 다른 접근 법이 있지만, 일반적으로 대부분의 생명 과학 실험실에서 일반적으로 사용할 수없는 지식과 장비를 모두필요로15,16. 이 접근법의 단순성과 필요한 시약의 비교적 저렴하고 사용 가능한 특성은 주어진 하위 필드의 맥락에서 GAG 생물학을 연구하는 데 관심이있는 생명 과학 연구원에 의해이 기술을 쉽게 적응 할 수 있게합니다. 또한,이 기술은 생물학적 조직에서 GAGs를 검출하는 대량 분광계 기반 기술에 필수적인 보완 역할을합니다. 질량 분광법 기반 접근법은 고감도GAG를 검출하고 복잡한샘플(17)으로부터구조의 미묘한 차이를 분별할 수 있지만, 기술의 특성상 GAG 폴리머의 크기를 구분할 수 없다. 이러한 이유로, PAGE 기반 접근법은 관심있는 생물학적 샘플에서 HS 폴리머의 크기를 신성화하는 데 필수적입니다.
이 백서에 설명된 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫 번째와 가장 눈에 띄는 것은 알시안 블루 염색 반응의 중심인 전하-전하 상호 작용으로 인해, 이 접근법은 고황화 GAGs에 대해 매우 선택적이며 더 중화 된 moieties (예를 들어, 히알루론산18)에대해 매우 선택적일 뿐이라는 것입니다. 따라서,이 기술은 더 산성 개그 moieties쪽으로 그 결과를 편향 할 가능성이 높습니다. 이러한 이유로, 관심 있는 생물학적 샘플에서 GAG 함량을 측정하는 보완적 접근법(예를 들어, 질량 분광법 기반 기술)은 실험 샘플에 존재하는 GAG의 보다 완전한 그림을 제공하기 위해 부수적으로 사용되어야 한다. 더욱이, 히알루로난의 크기를 측정하는 데 특별히 관심이 있는 최종 사용자의 경우, 다른 사람들은여기서설명된 기본 기술에 적응할 수 있는 바이오티니화 히알루론산 결합 단백질(HABP)을 활용하는 유사한 PAGE 기반 기술을 기술하고 있다.
요약하자면, 이 문서에 제시된 기술은 이러한 다당류 사슬의 기본 길이를 측정할 뿐만 아니라, 많은 감도와 특이성을 가진 생물학적 샘플에서 GAGs를 분리, 정화 및 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 정보는 코그네이트 리간드 결합 선호도를 결정하는 GAG 폴리머 길이의 중요성으로 인해 GAG-ligand 상호 작용에 대한 가설을 테스트하는 데 중요할 수 있습니다. 이 접근 방식은 몇 가지 장점이 있습니다, 특히 생명 과학 연구 실험실에 대한 상대적 단순성과 적응성, 그것은 부정적인 충전 된 GAG moieties에 대한 상대적 편견에 의해 제한되지만. 이 단점에도 불구하고,이 기술은 장기 항상성 및 질병에 GAGs의 역할을 연구하는 구견을 격려 하는 강력한 도구를 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL 및 EPS)에 의해 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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