Summary
本報告書では、生物学的試料から硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を分離して精製する技術と、そのサイズを近似するポリアクリルアミドゲル電気泳動法について説明する。GAGsは、組織構造に寄与し、タンパク質との静電相互作用を通じてシグナル伝達プロセスに影響を与えます。GAGポリマー長は、同結合リガンドに対する結合親和性に寄与する。
Abstract
硫酸塩(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などの硫酸塩グリコサミノグリカン(GAG)は、生物に遍在し、様々な基本的な生物学的構造やプロセスにおいて重要な役割を果たしています。ポリマーとして、GAGは4000 Daから40,000 Daをはるかに超える範囲の多糖鎖を含む多分散混合物として存在します。これらの鎖の中には、硫酸化のドメインが存在し、同結合タンパクリガンドの正に帯電した残基との相互作用を促進する負電荷のパターンを与える。GAGsの硫酸化ドメインは、これらの静電相互作用を可能にするのに十分な長さでなければならない。生物学的組織におけるGAGsの機能を理解するには、研究者がGAGsのサイズを単離し、精製し、測定できる必要があります。本報告書は、様々な生体組織タイプから分離されたGAGs間のサイズの比較的小さな違いを解決するために活用できる実用的で汎用性の高いポリアクリルアミドゲル電気泳動ベースの技術について説明しています。
Introduction
グリコサミノグリカン(GAG)は、生物の中でユビキタスな要素であり、多くの基本的な生理学的プロセスに寄与する線形多糖の多様なファミリーである1。ヘパラン硫酸(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などのGAGsは、多糖鎖に沿った異なる位置で硫酸化され、負電荷の地理的領域を付与する。これらのGAGsは、プロテオグリカンとして知られている細胞表面タンパク質に連結すると、細胞外空間に突出してコクネートリガンドに結合し、シス−(同じ細胞に結合したリガンド)およびトランス(隣接する細胞に結合したリガンド)の両方の調節を可能にするシグナル伝達プロセス2。さらに、GGsはまた、糸球体基質膜3、血管内皮グリコカリックス4 および肺上皮グリコカリックス5、および軟骨6のような結合組織における組織における構造要素としての重要な役割を果たす。
GAG多糖鎖の長さは、その生物学的文脈に応じて実質的に異なり、動的に長く、切断し、非常に複雑な酵素調節システム7によって修飾することができる。重要なことに、GAGポリマー鎖の長さは、リガンドに対するそれらの結合親和性に大きく寄与し、その後、その生物学的機能8、9に寄与する。このため、内因性GAGの機能の決定は、そのサイズの鑑賞を必要とする。残念ながら、タンパク質や核酸とは異なり、GAGsを検出して測定するための容易に入手可能な技術はほとんど存在しません。
この記事では、ほとんどの生体組織からGAGを分離して精製する方法を説明し、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を使用して、分離ポリマーの長さを公正な程度の特異性で評価する方法についても説明します。他の非常に複雑な(そしてしばしば質量分析ベースの)グリコミックアプローチとは対照的に、この方法は標準的な実験室の装置および技術を使用して使用することができる。したがって、この実用的なアプローチは、ネイティブのGAGsの生物学的役割と文脈上重要なリガンドとの相互作用を決定する研究者の能力を拡大する可能性があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルで分析されたすべての生物学的サンプルは、コロラド大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、マウスから得られた。
1. ヘパラン硫酸分離
- 組織サンプルの脱脂
注:脱脂は、脂肪が豊富な組織のためのオプションのステップです。- メタノールとジクロロメタンを1:1の混合物にします。サンプルあたり約500 μLを準備します。組織の大きな部分は、最大1 mLを必要とすることができます。
- 各組織サンプルを、脱脂用の蓋をした小さなガラス容器に入れます。
注: サンプル質量は、目的の組織や実験ニーズによって異なる場合があります。50mg以下は、通常、適切なGAG収量のために十分であるが、エンドユーザーが何らかの最適化を必要とするかもしれない。 - 各ガラス容器にメタノール:ジクロロメタン溶液500μLを加え、混合します。すべての固体組織サンプルが完全に溶媒に沈めていることを確認します。
注:メタノール/ジクロロメタン溶液を混合し、処理するために血清ピペットやプラスチック円錐チューブを使用してください。他のプラスチックは溶解する可能性があります。 - 化学発煙フードに入れたシェーカー(固定ラック)にサンプルを置き、1時間静かに攪拌します。
- 4 °Cで5分間17,000 x g で混合し、遠心分離機を攪拌します。
- 有機溶媒分率(上清)を慎重にピペットアウトする。これは脂質分画です - それはGAGsを含んでいないし、廃棄することができます。
注:小片が失われる可能性がありますので、組織を邪魔しないようにしてください。サンプル損失を危険にさらすのではなく、サンプル容器に有機層の一部を残しておくことが好ましい。 - ガラス容器の蓋を開けて、ボンネットで一晩蒸発させます。これらのチューブは、さらなる処理を生き残るために、次のステップのためにチューブを変更します。
- 溶媒混合物が完全に蒸発したら、機械的崩壊(残留試料が>50mgの場合)またはアクチナーゼE消化(<50mg)に進みます。
- 固体組織の機械的崩壊(オプション;より大きな組織サンプルの場合)
注:ほとんどの小さな固形組織(約50mg以下)は、消化工程中に完全に溶解する必要があります。しかし、より大きなサンプルは機械的崩壊を必要とする。- 目的のフラッシュフリーズサンプルは、適切なサイズのポリプロピレンチューブに配置し、閉じたチューブを液体窒素に配置します。サンプルを完全に固まるまで凍結します。
- きれいなモルタルと害虫を使用して、凍結したサンプルを粉末状の一貫性に粉砕します。
- アクチナーゼE消化に直接進みます(ステップ1.4)。
- サンプル脱塩と濃度
注:これはオプションのステップで、希薄な液体組織サンプル(例えば、気管支肺胞洗浄液(BALF)またはプラズマ)にのみ必要です。- 液体サンプルを適切な実験群にプールする(例えば、生物学的複製、または実験群による)
- サンプルの総体積を分子量カットオフ(MWCO)3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムに入れる。
- 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
- 各カラム3xを400μLの脱イオン、ろ過水で洗浄します。フローを破棄します。
- フィルターを反転し、新鮮な、適切にラベル付けされたコレクションチューブで2,000 x g で1分間スピンします。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
- アクチナーゼE消化
注:このステップは、サンプルからタンパク質汚染物質を消化し、最終的に除去するために必要です。- サンプル1:1と組換えアクティナーゼEを10mg/mLの所望の濃度に混合します。10倍の消化バッファー濃縮物の適切な量を追加します。望ましい最終濃度:0.005 M酢酸カルシウムおよび0.01 M酢酸ナトリウム、pH 7.5。例えば、液体試料190μL、20mg/mLアクティナーゼEの190μL、0.05 M酢酸カルシウム20μL、0.1M酢酸ナトリウム。
- サンプルを軽く撹拌して混合し、55°Cで48-72時間消化します(組織全体で最大7日間)。
- 80°Cに加熱し、15〜20分間加熱し、アクチナーゼEを加熱します。
- サンプルを-80°Cで凍らせるか、ステップ1.5に進みます。
- サンプル脱塩と濃度
注:生物学的試料に目的のGAGの低質量が予想される場合、または消耗品試薬(すなわち遠心フィルタカラム)の保存が望ましい場合、サンプルをプールして実験群ごとに単一の濃縮物を生成することができる(例えば、生物学的複製、または実験群)。- MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムにサンプルの総量を入れる。
- 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
- 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。
- フィルターを反転し、2,000 x g で 1 分間スピンし、新しく適切にラベル付けされたコレクションチューブ (一般的に遠心フィルター列に含まれています) を使用します。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
- 乾燥
- ステップ1.5.5から溶解したサンプルを一晩回転真空濃縮器に入れるか、以下の詳細に従ってサンプルを凍結乾燥させます。
- サンプルを-80°Cで一晩、または液体窒素に浸して完全に凍結します。
- サンプル蓋に18Gの針を突き刺し、凍結乾燥機室に入れます。必要に応じて、梱包用のペーパータオルを追加します。
- 凍結乾燥剤室を凍結乾燥剤に固定し、一晩乾燥を凍結する(少なくとも-40°C、0.135トール)
- カチネーション交換列
- 8 M尿素の最大400 μL、2%のCHAPS溶液(または、プーリングサンプルの場合は、最大(400/n)μL(n =所望のプール内のサンプル数)に再中断して乾燥したサンプルを再中断します。できるだけ少ない洗剤溶液を使用してください。
- 8 M尿素、2%のCHAPS溶液の400 μLでカチオン交換(IEX)カラムを平衡化します。室温で2,000 x g で5分間スピンします。
- 400 μL のサンプル/プールされたサンプルを IEX カラムにロードします。2,000 x gで 5 分間スピンします。
- 3xを400 μLの8 M尿素、2%CHAPS溶液で洗浄します。毎回2,000 x g で5分間スピンします。
- 0.2 M NaClの400 μLのエルテ3x。2,000 x g で 5 分間スピンします。これは低親和性の分数です - これは必要に応じて品質管理のために保持することができます。
- 2.7 M (16%) NaCl の 400 μL を持つエルテ 3x。2,000 x g で 5 分間スピンします。この分数は、関心のある単離されたグリコサミノグリカンを含む - それのすべてを保ちます!
- 溶出した各分率を脱塩するには、メタノールを80体積%まで加え、一晩4°Cでインキュベートする。2,000 x gで 5 分間、各サンプルをスピンします。乾燥した脱塩グリコサミノグリカンとして固形残渣を回収する。
注:または、このステップをスキップし、メタノールなしで溶出液を脱塩するためにステップ1.8に進みます。
- サンプル脱塩と濃度
- 必要に応じて、分画を(1.7.6から)適切な実験群(例えば、生物学的複製、または実験群によって)に溶出させた。
- MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムにサンプルの総量を入れる。
- 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
- 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。ステップ 1.9 に直接進みます。
- コンドロイチン消化
注: この手順の目的は、エンド ユーザーに関心がない GAGs を削除することです。この場合、コンドロイチンを除去するためにコンドロイチンーゼが使用される。 代表的な結果 (気管支肺胞洗浄液および肺全体)を生成するために使用される組織では、コンドロイチン硫酸を消化し、ヘパラン硫酸を一次残存GAGとして残す。エンドユーザーは、実験の目的に応じて追加の消化ステップを追加する必要があります。.- 350 μLの消化バッファー(pH 7.0に調整された2mMの塩化カルシウムを含む酢酸アンモニウム50mM)を、膜に触れることなく遠心フィルターカラムに負荷を与えます。
- 組換えコンドロイチナーゼABCを5μL加えます。
- サンプルチューブを37°Cのオーブンに入れ、1時間インキュベートします。
- 柱を裏返し、適切なラベルの付いたコレクション チューブに配置します。2000 x gで 1 分間スピンします。
- サンプルを80°Cに15〜20分間加熱し、コンドロイチノーゼABCを不活性化します。
- サンプル脱塩と濃度
- 必要に応じて、コンドロイチンはステップ1.9.5から適切な実験群(例えば、生物学的複製、または実験群によって)にサンプルを消化した
- サンプルの総体積を、MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムに入れ
- 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
- 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。
- フィルターを反転し、新鮮な、適切にラベル付けされたコレクションチューブで2,000 x g で1分間スピンします。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
- 乾燥
注: このステップでは、サンプルを水と流動バッファの最小量で再懸濁できるように、乾燥が必要です。- ステップ 1.10.5 からコンドロイチン消化サンプルを一晩回転真空濃縮器に直接配置するか、次のように凍結乾燥します。
- サンプルを-80°Cで一晩、または液体窒素に浸して完全に凍結します。
- サンプル蓋に18Gの針を突き刺し、凍結乾燥機室に入れます。必要に応じて、梱包用のペーパータオルを追加します。
- 凍結乾燥剤室を凍結乾燥剤に固定し、一晩乾燥を凍結する(少なくとも40°C、0.135トール)
2. ポリアクリルアミドゲル電気泳動分解
- ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に必要な溶液を事前に準備する(表1)。
注:サンプル中に含まれると予想されるグリコサミノグリカンのサイズに応じて、ゲル溶液を分解するアクリルアミドのパーセントを選択します。15%は、より大きな断片(長さ30個以上の二糖サブユニット)を解決するために推奨されます。小さい断片(<20の二糖サブユニットの長さ)の場合は22%。 - ページタンクに空のカセットを入れます。溶解ゲルを次のようにキャストします:15 mLチューブに、10 mLの溶解ゲル溶液、60 μLの過硫酸アンモニウム(新鮮な調製が必要)、および10 μLのTEMED(最後にTEMEDを追加)を混合します。チューブを2~3倍にそっと反転します。ピペットを使用して、上記の10 mL溶液をカセットに素早く加えます。2 mLの脱イオン、ろ過水でオーバーレイし、30分間重合するゲルを分解することができます。
注: 次の PAGE プロトコルは、13.3 x 8.7cm (幅 x 長さ) 1.0mm 厚さ鋳造カセットを使用する垂直 PAGE システムに最適化されており、総体積は約 12 mL です。他のカセットシステムは使用できますが、エンドユーザーによる最適化が必要な場合があります。 - 溶解ゲルが完全に重合した後、重ね合わされた水を捨て、積層ゲルを次のように投げ出します:15 mLチューブに3mLの積み重ねゲル溶液、10%の硫酸アンモニウム(新たに調製する必要があります)の90 μL、TEMEDの3 μL(最後にTEMEDを追加)。
- チューブを2~3倍にそっと反転します。ピペットを使用して、固化した溶解ゲルの上に積み重ねゲル溶液を素早く追加します。つばにカセットを充填します。セットアップに付属のコームを完全に挿入します。積み重ねゲルを30分間重合させます。
- ゲルが重合したら、テープストリップをカセットの底部から取り出し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。
- 上下のチャンバーにそれぞれ上下のチャンバーバッファを充填します。
- 乾燥したサンプルを、最小必要量の脱イオン水、ろ過水(せいぜい、PAGEゲル内のウェルの体積の50%)に溶解します。サンプルの負荷バッファーと 1:1 を混合します。サンプルとHSオリゴ糖「はしご」( 表1参照)をゲルに入れます。
- ゲルを100Vで5分間事前に実行します。その後、20〜25分間(15%ポリアクリルアミド溶解ゲルの場合)、40〜50分(18%ポリアクリルアミド溶解ゲルの場合)、90-100分(22%ポリアクリルアミド溶解ゲル用)の200Vでゲルを実行します。
注: 200 V の実行時間の最適化が必要な場合があります。フェノールレッドは、長さが2重合サブユニットであるヘパリンオリゴ糖の前に移動します(すなわち、重合度2、またはdp2)。ブロモフェノールブルーはdp10-dp14より先に移行します。フェノールレッドバンドがゲルの底にほとんど(かなり)移行するような電圧が印加されると、最良の結果が得られます。それに応じて実行時間を調整します。
3. シルバー染色プロトコル
- 銀染色に必要な全てのソリューションを事前に準備する(表2)。
注意:PAGEゲルが染色され、開発され、停止溶液に入れられるまで、PAGEゲルに直接触れないでください。代わりに、きれいなプラスチックまたはガラスのツールを使用してゲルを操作します。ゲルを直接取り扱うと、染色後に指プリントの歪みやゲルに目に見えるアーティファクトが生じます。 - 実行が完了したら、カセットを分解し、脱イオンしたろ過水で満たされた清潔で中規模の容器にゲルを抽出します。
注:ゲルを直接扱わないように、ピペットチップやその他のプラスチック製の物体を使用して、水に沈めながらカセットからゲルをそっと剥がしてください。ゲルは壊れやすいかもしれません - 慎重に扱います。- 水を捨てる。ゲルをアルシアンブルー染色液で5分間染色します。
- アルシアブルーの汚れを捨てる。アルシアブルー染色液の大部分が除去されるまで、2-3倍の脱イオンで2-3倍の水を素早く洗い流します。
- ロッカーに一晩脱イオン、ろ過水で脱染色することを可能にします。十分な量の脱イオン、ろ過水が存在することを確認して、残留汚れがゲルから一晩完全に洗い流されるようにします。
- 50%メタノールでゲルを洗浄(合計40分、溶液を2~3倍に変える)
- 脱イオン化し、30分間濾過した水でゲルを洗浄します。水を捨て、合計2時間でさらに3回繰り返し、毎回水を交換します。
- 新鮮で清潔な容器に、硝酸銀染色液で30分間ゲルを染色します。
- 脱イオン化されたろ過水で2〜3倍速く洗い流し、銀染色液を完全に除去します。
- 脱イオン、ろ過水で30分間洗浄します。水を捨て、合計90分間2倍を繰り返し、毎回水浴を交換します。
- 水を捨て、開発ソリューションを追加します。
- 開発溶液を加えたら、ゲルを注意深く観察し、バンドの出現を見守ります。汚れの品質とサンプルの質量に応じて、開発は数秒から数分かかる場合があります。
- 目的のバンドが見えなければすぐに、現像液をすぐに捨て、停止溶液で短時間洗います。
- 洗浄を停止液を廃棄し、新しい停止溶液に交換します。ロッカーまたはシェーカーに1時間浸漬します。
- 脱イオン化された濾過水で一晩洗浄する(ただし、ゲルは溶液洗浄を停止した直後に画像化することができる)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
アルシアンブルーは、硫酸化GAGs 10を染色するために使用されます。この信号は、後続の銀染色 11を用いて増幅される。 図1 は、銀染色開発プロセスの視覚的なデモンストレーションを示しています。実証されるように、電気泳動によって分離されたGAGを表すアルシアンブルー信号は、現像剤がポリアクリルアミドゲルに浸透するにつれて増幅される。通常、現像プロセスは密度に依存する方法で銀とアルシアブルー染色されたGAGsを減少させ、各バンドのエッジは最初に減少し、中央のより密な染色領域は最後に染色されます。
文献では、PAGEベースのアプローチを使用したGAGsの検出の報告限界は、0.5〜1 μg12、13の範囲です。我々のアプローチを用いて検出限界を決定するために、異なるポリマー長のヘパラン硫酸オリゴ糖(分画ヘパリン、dp20、dp10、dp6)を22%ポリアクリルアミドゲルに装填し、上述のようにして染色した。各オリゴ糖は2つの異なる質量で2回積み込まれました:1.0 μgと0.5 μgを測定します。特に、未分離ヘパリンは、試験された4つの異なるオリゴ糖の最も容易に検出され、各個々のバンドの密度をそれに対応して減少させるポリマーサイズのより広い分布による可能性が高い。
液体生物学的サンプルからのGAG精製の効率を評価するために、GAGは2つの気管支肺胞洗浄(BAL)サンプルから単離した。 図3に示すように、GAGの単離に用いられるAとしてマークされた最初の試料は、気管内リポ多糖(LPS)(3mg/kg)後にマウス24時間から収穫されたBAL液の1mL(3mg/kg)であり、肺胞上皮HS脱落 を誘導するために投与した。10 μgの市販の dp6 をこの BAL 流体に直接追加し、分離プロセス中の GAGs の損失を評価する"スパイクイン" 制御として機能します。Bとマークされた2番目のサンプルは、外因性GAGスパイクインなしで、24時間前に気管内LPS(3mg/kg)を与えられた3匹のマウスからプールされた10mLのBAL液で構成された。両方のサンプルをGAG分離のために同時に処理し、イオン交換カラムから溶出した3つの分画すべてを保持し、低親和性および洗浄画分に存在するGAGsがあるかどうかを判断するためにさらに処理した。市販のdp20、dp10、dp6ヘパラン硫酸オリゴ糖の2 μgをこれらのサンプルと一緒にPAGEゲルで実行し、各溶出した分数のHS GAGsのサイズを定性的に評価するための参照を提供し、GAGの分離を受けた10 μgの「スパイク」制御と密度を比較するための参照を提供しました。
固形組織に対するこの技術の使用を実証するために、ヘパラン硫酸塩を、上述のように15mgの凍結したマウス肺から単離した。単離精製プロセスの間、イオン交換カラムから溶出した低親和性分率(0.2 M NaCl)を保持し、高親和性(2.7 M NaCl)の分数と共に処理し、ゲル上で実行する(図4)。2 μgの市販の dp20, dp10, dp6 ヘパラン硫酸オリゴ糖をこれらのサンプルと一緒に実行し、サイズの基準を提供しました。見ることができるように、肺ホモジネート全体は、サイズがdp10にほぼ等しい最小の断片を有する、十分な量の分離されたHSを生み出した。2.7 M NaCl分のアルシアブルー/シルバー染色の相対的な濃縮は、ヘパラン硫酸がイオン交換カラムに高い親和性を持って結合し、高特異性でカラムから溶出できることを示しています。肺ホモゲネート全体は、十分な量の分離されたヘパラン硫酸塩(2.7 M NaCl分数)をもたらし、最小の断片はdp10の大きさとほぼ等しい。
図1:銀染色の開発プロセス アルシアンブルーの未分離ヘパリン(UFH)またはサイズ定義オリゴ糖(dp=重合度)を電気泳動で分離し、銀染色により増幅する。左から順に、UFH、dp20、dp10、dp6。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヘパラン硫酸の検出に対するポリアクリルアミドゲルと銀染色の感度 異なる長さのヘパラン硫酸オリゴ糖(UFH、dp20、dp10、dp6)を22%ポリアクリルアミドゲル上に上にして、銀染色した。オリゴ糖は、1.0 μg(左端のバンド)と0.5 μg(右端のバンド)の2つの異なる質量で2回ロードされました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:液体生物学的試料からのGAG精製の効率。 2つの気管支肺胞洗浄(BAL)サンプルから分離されたGAGsは、ここで「A」および「B」とラベル付けされ、22%ポリアクリルアミドゲルおよび銀染色で実行した。サンプルAは、3mg/kgの気管内リポ多糖(LPS)で処置した後、マウス24時間から収穫した1mLのBAL液で構成された。さらに、10 μg の dp6 HS が「スパイクイン」制御としてこのサンプルに追加されました。サンプルBは、LPSの投与後24時間に3匹のマウスから集められた10mLのプールBAL液から構成された。各サンプルは、希釈剤(「洗浄」)または低濃度のNaCl(0.2 M)で溶出したイオン交換カラムからの分数と一緒に実行した。2 μgの市販の dp20, dp10, dp6 ヘパラン硫酸オリゴ糖は、サイズ参照として使用されました (左端のバンド). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: 健康なマウス肺から分離して精製したヘパラン硫酸塩の大きさを測定する。 ヘパリン硫酸含量は、健康なマウスから単離された肺の15mgの凍結サンプルから単離および精製し、22%ポリアクリルアミドゲル上で実行する。ヘパラン硫酸塩は、NaClの低濃度(0.2M;低親和率)または高濃度(2.7M、16%溶液、高親和率)のいずれかでイオン交換カラムから溶出した。2 μgの市販の dp20, dp10, dp6 ヘパラン硫酸オリゴ糖は、サイズ参照として使用されました (左端のバンド). この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 注:すべてのソリューションは、使用前にフィルタ(0.22μm)する必要があります。 | |||
| 解決 | レシピ | 組成 | コメント |
| 解決ゲル/下層チャンバーランニングバッファー(2 Lまたは4 L) | ホウ酸、MW 61.83 | 2L:12.36グラム;4L:24.76グラム | 所望の集中:0.1 M |
| トリスベース、MW 124.14 | 2L:24.2 g;4L: | 所望の集中:0.1 M | |
| EDTA MW 336.21または二水和物二ナトリウム、MW 372.36 | 2L:それぞれ6.7gまたは7.4g;4L 13.4 g または 14.8 g | 所望の集中: 0.01 M | |
| 脱イオン水 | 2Lまたは4L | 試薬を完全に溶解した後、pHを8.3に調整する | |
| 上部チャンバーランニングバッファ(1L) | グリシン | 93g | 所望の集中:1M |
| トリスベース、MW 124.14 | 24.2 g | 所望の集中:0.2 M | |
| 脱イオン水 | 1 L | ||
| 溶解ゲル、全アクリルアミド22%(500mL) | アクリルアミド、MW 71.08 | 100.1 g | 所望の集中:20.02%w/v |
| N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド(ビス、MW 154.17) | 10g | 所望の集中:2%w/v | |
| 蔗糖 | 75g | 所望の集中:15%w/v | |
| ゲルバッファーの解決 | 500 mL | 500mLの総容積に持って来なさい;バッファの合計の500mL未満を必要とします | |
| 溶解ゲル、全アクリルアミド(400mL) 15% | アクリルアミド、MW 71.08 | 56.3 g | 所望の集中: 14.08% w/v |
| N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド(ビス、MW 154.17) | 3.7グラム | 所望の集中:2%w/v | |
| 蔗糖 | 20.8 g | 所望の集中:15%w/v | |
| ゲルバッファーの解決 | 400 mL | 400mLの総容積に持って来なさい;バッファの合計の400mL未満を必要とします | |
| スタッキングゲル(100 mL) | アクリルアミド、MW 71.08 | 4.75グラム | 所望の集中:4.75%w/v |
| N,N'-メチレン-ビス-アクリルアミド(ビス、MW 154.17) | 0.25グラム | 所望の集中:0.25%w/v | |
| ゲルバッファーの解決 | 100 mL | 80mLバッファーと完全溶解試薬を加えます。次に、pHを塩酸で76.3に調整し、滴下します。その後、ゲルバッファーを分解して合計 100 mL の体積を持って来ます。 | |
| サンプルローディングバッファ(500 mL) | 蔗糖 | 250g | 所望の集中:50%w/v |
| フェノールレッド | 500mg | 所望の集中:1mg/mL | |
| ブロモフェノールブルー | 250mg | 所望の集中:0.5mg/mL | |
| 脱イオン水 | 500mL | 500mLの総容積に持って来なさい;水の合計の500mL未満を必要とします | |
| ヘパリン由来オリゴサカライド 'はしご' (各2mL) | dp6 | 0.1mg | 注:ヘパリン由来オリゴ糖6重合体サブユニット(重合度6、またはdp6)を最小帯域に、最大帯域のdp20、中帯にdp10を使用することをお勧めします。ただし、必要に応じて他の組み合わせを使用できます。所望の集中:0.05 mg/mL |
| dp10 | 0.1mg | ||
| dp20 | 0.1mg | ||
| 脱イオン水 | 3mL | 各オリゴ糖を1mLで別々のチューブに溶かします。 | |
| サンプルの読み込みバッファ | 3mL | 各オリゴ糖溶液に1mL(1:1混合物)を加える | |
表1:精製グリコサミノグリカンのポリアクリルアミドゲル電気泳動に必要な溶液。 すべてのソリューションは、使用前にフィルタ(0.22 μm)する必要があります。
| 注:すべてのソリューションは、使用前にフィルタ(0.22μm)する必要があります。 | |||
| 解決 | レシピ | 組成 | コメント |
| アルシアンブルー染色液(500mL) | アルシアンブルー8GXパウダー | 2.5g | 所望の集中:0.5%w/v |
| 2%対/v氷酢酸 | 500mL | ||
| 銀染色(200mL) | 脱イオン水 | 192.7 mL | 新鮮な汚れ溶液を準備します。1週間以内に使用してください。 |
| 7.6M 水酸化ナトリウム | 2 mL | 作るために、10 mL水に3.04gの水酸化ナトリウムペレットを加える | |
| 水酸化アンモニウム | 3.3 mL | ||
| 4M銀硝酸溶液 | 2 mL | 作るために、5 mLの水に硝酸銀3.397gを加えます。降水を避けるために攪拌しながら滴下を加えます。 | |
| 開発ソリューション (501 mL) | 脱イオン水 | 500 mL | 開発ソリューションは、新鮮にし、24時間以内に使用する必要があります。 |
| 2.5% w/v クエン酸 | 1 mL | 作るために、4 mL脱イオン水に100mgを加えます。クエン酸は新鮮にする必要があります。 | |
| ホルムアルデヒド | 250μL | ||
| 停止溶液(500 mL) | 脱イオン水 | 300 mL | |
| 氷酢酸 | 20 mL | ||
| メタノール | 90 mL | ||
表2:ポリアクロミドゲル電気泳動により分離されたグリコサミノグリカンの銀染色に必要な溶液。 すべてのソリューションは、使用前にフィルタ(0.22 μm)する必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAGsは、多くの多様な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。硫酸化GAGs(HSやCSなど)の主な機能の1つは、リガンドと相互作用して結合し、下流のシグナル伝達機能を変化させることです。コグネイトリガンドに対するGAG結合親和性の重要な決定要因は、GAGポリマー鎖8、9、14の長さである。 このため、研究者は、目的の生物学的サンプルから分離されたGAGチェーンのサイズを合理的な精度で定義できることが重要です。実用的な方法としては、この技術は、一般的な実験装置や試薬を用いて行うことができるべきである。
このプロトコルは、生物学的サンプルからGAGsを分離して精製し、PAGEを介してサイズ別に分離し、Alcianブルーとシルバー染色技術を使用してそれらを視覚化する方法を説明しています。グリコサミノグリカンをサイズ別に分離する方法はいくつかありますが、この手法を生命科学研究所で応用する方法はいくつかあります。まず、検出限界が0.5μgの場合、この技術は対象のGAGsの検出に非常に敏感です。我々の経験では、比較的低濃度のGAGs(すなわちBAL液サンプル)を含むサンプルでさえ、この方法を用いて検出するのに十分なGAGを得る必要があります。BAL液の分離および精製からの収量は、技術と目的の特定のGAGによって異なりますが、10 mLの生BAL流体がこの技術を使用して検出可能なHSを十分に生み出すというのが私たちの経験でした。固形臓器からの収量は、収穫された組織に応じて実質的に高いが、10mgの初期固体サンプルがこの技術を用いて検出するための十分なHSを生み出すのが我々の経験である。
染色されたPAGEゲルの最終的なイメージングは、エンドユーザーが利用できるイメージング技術によって異なることを注意することが重要です。ゲルのデジタル写真は、利用可能な機器や必要な検出感度(通常はゲルにロードされたサンプルの量によって決まります)に応じて、多数の市販のゲルドキュメンテーションシステムや通常の商用カメラを含む多くの異なるシステムを使用して撮影することができます。また、このゲルをデジタル画像化するために必要な光源は、試料の密度および染色プロセス中に必要な現像時間の量によって異なる場合があります。急速に発達し、肉眼で容易に見える銀染色バンドを生成するゲルは、光の大部分が未反応のアルシアンブルーによって吸収されるので、最良の画像のためのUVトランスイルミネーションを必要とします。開発時間が長いゲル(サンプル量が非常に少ないゲルなど)は、銀色の汚れによって最もよく吸収されるので、通常のフルスペクトル光を用いたエピ照明またはトランスイルミネーションのいずれかが必要になります。
この技術のさらなる強みは、一般的に入手可能で安価に入手できる装置および試薬を使用して、単純なPAGE技術の基礎のために、ライフサイエンスラボに特に適応可能である。単離されたGAGポリマーの長さを定量化する他のアプローチがあるが(例えば、毛細血管電気泳動)、それらは通常、ほとんどのライフサイエンス研究所15、16で一般的に利用できない知識と機器の両方を必要とする。このアプローチのシンプルさと、必要な試薬の比較的手頃な価格で利用可能な性質は、この技術は、与えられたサブフィールドの文脈でGAG生物学を研究することに興味を持つライフサイエンス研究者によって容易に適応可能になります。さらに、この技術は、生体組織におけるGAGを検出する質量分析ベースの技術を補完する重要な役割を果たす。質量分析ベースのアプローチは、高感度のGAGsを検出し、複雑なサンプル17から構造の微妙な違いを識別することができるが、技術の性質上、GAGポリマーをサイズによって区別することができない。このため、対象となる生物学的サンプルでHSポリマーのサイズを占うためには、PAGEベースのアプローチが不可欠です。
このホワイト ペーパーで説明する手法には、いくつかの制限があることに注意してください。最初で最も顕著なのは、アルシアブルー染色反応の中心となる電荷相互作用のために、このアプローチは高硫酸化性の高いGAGsに対して非常に選択的であり、より中立的に帯電した部分(例えば、ヒアルロン酸18)を弱く汚すだけである。したがって、この技術は、より酸性GAG部分に向けてその結果を偏らせやすくなっている。このため、目的とする生物学的サンプル中のGAG含有量を測定するための相補的なアプローチ(例えば、質量分析ベースの技術)は、実験サンプルに存在するGAGsのより完全な画像を提供するために、付加的に使用されるべきである。さらに、ヒアルロナンのサイズを測定することに特に関心のあるエンドユーザーに対しては、ここで説明する基本技術に適応可能であり得るビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)を利用する同様のPAGEベースの技術について説明している人もいる。
要約すると、この記事で紹介する技術は、多くの感受性と特異性を持つ生物学的サンプルからGAGsを分離、精製、検出し、またこれらの多糖鎖のネイティブ長を測定するために使用することができます。この情報は、同一性リガンド結合親和性を決定する際にGAGポリマー長の重要性に起因するGAG-リガンド相互作用に関する仮説を検定する上で重要であり得る。このアプローチには、いくつかの利点があり、特にライフサイエンス研究所への相対的なシンプルさと適応性がありますが、負の帯電GAG部分に対する相対的なバイアスによって制限されています。この欠点にもかかわらず、この技術は、研究者が臓器恒常性および疾患におけるGAGsの役割を研究することを奨励する堅牢なツールを表しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この作品は、F31 HL143873-01(WBL)、R01 HL125371(RJLおよびEPS)によって資金提供されました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
