Summary
Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.
Abstract
Gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) zijn alomtegenwoordig in levende organismen en spelen een cruciale rol in een verscheidenheid aan fundamentele biologische structuren en processen. Als polymeren bestaan GAG's als een polydisperse mengsel met polysaccharideketens die kunnen variëren van 4000 Da tot ruim 40.000 Da. Binnen deze ketens bestaan domeinen van sulfatie, die een patroon van negatieve lading verlenen dat interactie met positief geladen residuen van verwante eiwitliganden vergemakkelijkt. Gesulfateerde domeinen van GAG's moeten voldoende lang zijn om deze elektrostatische interacties mogelijk te maken. Om de functie van GAG's in biologische weefsels te begrijpen, moet de onderzoeker in staat zijn om de grootte van GAG's te isoleren, te zuiveren en te meten. Dit rapport beschrijft een praktische en veelzijdige polyacrylamide gel elektroforese-gebaseerde techniek die kan worden gebruikt om relatief kleine verschillen in grootte tussen GAG's geïsoleerd uit een verscheidenheid aan biologische weefseltypen op te lossen.
Introduction
Glycosaminoglycanen (GAG's) zijn een diverse familie van lineaire polysacchariden die een alomtegenwoordig element zijn in levende organismen en bijdragen aan vele fundamentele fysiologische processen1. GAG's zoals heparansulfaat (HS) en chondroïtinesulfaat (CS) kunnen op verschillende posities langs de polysaccharideketen worden gesulfateerd, waardoor geografische domeinen van negatieve lading worden overgedragen. Deze GAG's, wanneer ze worden vastgebonden aan celoppervlakeiwitten die bekend staan als proteoglycanen, projecteren in de extracellulaire ruimte en binden aan verwante liganden, waardoor de regulatie van zowel cis- (ligand gehecht aan dezelfde cel) als trans- (ligand gehecht aan naburige cel) signaleringsprocessen mogelijk is2. Bovendien vervullen GAG's ook kritieke rollen als structurele elementen in weefsels zoals het glomerulaire keldermembraan3,de vasculaire endotheelglyx4 en pulmonale epitheliale glycocalyx5, en in bindweefsels zoals kraakbeen6.
De lengte van GAG-polysaccharideketens varieert aanzienlijk afhankelijk van de biologische context en kan dynamisch worden verlengd, gesplitst en gewijzigd door een zeer complex enzymatisch regulerend systeem7. Belangrijk is dat de lengte van GAG-polymeerketens substantieel bijdraagt aan hun bindingsaffiniteit voor liganden en vervolgens aan hun biologische functie8,9. Om deze reden vereist de bepaling van de functie van een endogene GAG waardering van de grootte ervan. Helaas bestaan er, in tegenstelling tot eiwitten en nucleïnezuren, zeer weinig direct beschikbare technieken om GAG's te detecteren en te meten, wat historisch heeft geresulteerd in relatief beperkt onderzoek naar de biologische rollen van deze diverse polysaccharidefamilie.
Dit artikel beschrijft hoe GAG's uit de meeste biologische weefsels kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en beschrijft ook hoe polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) kan worden gebruikt om de lengte van de geïsoleerde polymeren met een redelijke mate van specificiteit te evalueren. In tegenstelling tot andere, zeer complexe (en vaak op massaspectrometrie gebaseerde) glycomische benaderingen, kan deze methode worden gebruikt met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en -technieken. Deze praktische benadering kan daarom het vermogen van onderzoekers uitbreiden om de biologische rol van inheemse GAG's en hun interactie met contextueel belangrijke liganden te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle biologische monsters die in dit protocol werden geanalyseerd, werden verkregen van muizen, volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de University of Colorado Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Heparansulfaat isolatie
- Delipidatie van weefselmonsters
OPMERKING: Delipidatie is een optionele stap voor vetrijke weefsels.- Maak een 1:1 mengsel van methanol en dichloormethaan. Bereid ongeveer 500 μL per monster; grotere stukken weefsel kunnen tot 1 ml nodig hebben.
- Plaats elk weefselmonster in een kleine glazen container met een deksel voor delipidatie.
OPMERKING: De massa van het monster kan variëren per weefsel van belang en experimentele behoeften. 50 mg of minder is meestal voldoende voor een adequate GAG-opbrengst, maar enige optimalisatie kan nodig zijn voor de eindgebruiker. - Voeg 500 μL van de methanol:dichloormethaanoplossing toe aan elke glazen container en meng. Zorg ervoor dat alle vaste weefselmonsters volledig zijn ondergedompeld in oplosmiddel.
OPMERKING: Gebruik serologische pipetten of plastic conische buizen om de methanol/ dichloormethaanoplossing te mengen en te hanteren; andere kunststoffen kunnen oplossen. - Plaats monsters op een shaker (in beveiligd rek) in een chemische zuurkast en roer voorzichtig gedurende 1 uur.
- Roer de monsters tot een mengsel en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Pipetteer voorzichtig de organische oplosmiddelfractie (supernatant). Dit is de lipidenfractie - het bevat geen GAG's en kan worden weggegooid.
OPMERKING: Probeer het weefsel niet te verstoren, omdat kleine stukjes verloren kunnen gaan. Het verdient de voorkeur om een deel van de organische laag in de monstercontainer te laten, in plaats van het verlies van het monster te riskeren. - Laat het deksel van de glazen container open en laat het een nacht in de kap verdampen. Vervang de buis voor de volgende stap, omdat die buizen de verdere verwerking niet zullen overleven.
- Zodra het oplosmiddelmengsel volledig is verdampt, gaat u over tot mechanische desintegratie (als het resterende monster is >50 mg) of Actinase E-vertering (< 50 mg).
- Mechanische desintegratie van vast weefsel (optioneel; voor grotere weefselmonsters)
OPMERKING: De meeste kleinere stukjes vast weefsel (ongeveer 50 mg of minder) moeten volledig oplossen tijdens de verteringsstap. Grotere monsters vereisen echter mechanische desintegratie.- Flash-freeze monsters van belang door ze in een polypropyleenbuis van de juiste grootte te plaatsen en de gesloten buis in vloeibare stikstof te plaatsen. Laat het monster bevriezen tot het helemaal vast is.
- Maal met een schone vijzel en stamper bevroren monsters tot een poederachtige consistentie.
- Ga direct verder met Actinase E digestie (Stap 1.4).
- Monster ontsalting en concentratie
OPMERKING: Dit is een optionele stap en alleen vereist voor verdunde vloeibare weefselmonsters (bijv. Broncho-alveolaire lavagevloeistof (BALF) of plasma).- Vloeibare monsters bundelen in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep)
- Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) van 3.000 Da.
- Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
- Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
- Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
- Actinase E spijsvertering
OPMERKING: Deze stap is nodig om eiwitverontreinigingen uit uw monster te verteren en uiteindelijk te verwijderen.- Meng monsters 1:1 met recombinant Actinase E tot een gewenste concentratie van 10 mg/ml. Voeg het juiste volume van 10x digestiebufferconcentraat toe. Gewenste eindconcentratie: 0,005 M calciumacetaat en 0,01 M natriumacetaat, pH 7,5. Bijvoorbeeld: 190 μL vloeibaar monster, 190 μL 20 mg/ml Actinase E, 20 μL 0,05 M calciumacetaat, 0,1 M natriumacetaat.
- Roer de monsters voorzichtig om te mengen en verteer vervolgens gedurende 48-72 uur bij 55 °C (tot 7 dagen voor het hele weefsel).
- Verwarm tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om Actinase E te verwarmen.
- Vries het monster in bij -80 °C of ga verder met stap 1.5.
- Monster ontsalting en concentratie
OPMERKING: Als een lage massa van de GAG van belang wordt verwacht in het biologische monster, of als het behoud van verbruiksreagentia (d.w.z. centrifugaalfilterkolommen) wenselijk is, kunnen monsters worden samengevoegd om een enkel concentraat per experimentele groep te produceren (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep).- Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
- Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
- Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
- Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen (meestal inbegrepen bij de centrifugaalfilterkolommen). Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
- Desiccation
- Plaats de opgeloste monsters uit stap 1.5.5 's nachts in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer de monsters zoals hieronder beschreven.
- Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.
- Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.
- Bevestig de lyofilisatorkamer op de lyofilisator en vries deze 's nachts droog (ten minste -40 °C, 0,135 Torr)
- Kationenuitwisselingskolom
- Resuspend gedroogde monsters in maximaal 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing (of, bij bundeling van monsters, resuspend tot een maximum van (400/n) μL, waarbij n = het aantal monsters in de gewenste pool. Gebruik zo min mogelijk van de reinigingsoplossing.
- Kalibatie de kationenuitwisselingskolom (IEX) in evenwicht met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS-oplossing. Draai gedurende 5 minuten bij 2.000 x g bij kamertemperatuur.
- Laad 400 μL monsters/gepoolde monsters in de IEX-kolom. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g.
- Wassen 3x met 400 μL 8 M ureum, 2% CHAPS oplossing. Draai elke keer 5 minuten op 2.000 x g.
- Elute 3x met 400 μL van 0,2 M NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Dit is de fractie met lage affiniteit - deze kan indien gewenst worden behouden voor kwaliteitscontroledoeleinden.
- Elute 3x met 400 μL van 2,7 M (16%) NaCl. Draai gedurende 5 minuten op 2.000 x g elk. Deze fractie bevat de geïsoleerde glycosaminoglycanen van belang - bewaar het allemaal!
- Voeg elke eluteerde fractie toe aan methanol tot 80 vol% en incubeer bij 4 °C gedurende de nacht. Draai elk monster gedurende 5 minuten op 2.000 x g. Herstel het vaste residu omdat dit gedroogde gezouten glycosaminoglycaan is.
OPMERKING: U kunt deze stap ook overslaan en doorgaan naar stap 1.8 om het eluaat zonder methanol te ontzouten.
- Monster ontsalting en concentratie
- Indien nodig, groepeer eluteerde fracties (vanaf 1.7.6) in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld per biologische replicatie of experimentele groep).
- Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
- Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal dit indien nodig als het gewenste monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
- Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Weggooien stroomt door. Ga direct verder met stap 1.9.
- Chondroïtine spijsvertering
OPMERKING: Het doel van deze stap is om GAG's te verwijderen die niet interessant zijn voor de eindgebruiker. In dit geval wordt chondroitinase gebruikt om chondroïtine te verwijderen. In de weefsels die worden gebruikt voor het genereren van representatieve resultaten (broncho-alveolaire lavagevloeistof en hele longen), laat het verteren van chondroïtinesulfaat heparansulfaat achter als de primaire resterende GAG. Eindgebruikers moeten mogelijk extra verteringsstappen toevoegen, afhankelijk van hun experimentele doelen.- Laad 350 μL vergistingsbuffer (50 mM ammoniumacetaat met 2 mM calciumchloride aangepast tot pH 7,0) op de centrifugaalfilterkolom zonder het membraan aan te raken.
- Voeg 5 μL recombinant chondroitinase ABC toe.
- Plaats de monsterbuis in een oven van 37 °C en incubeer gedurende 1 uur.
- Draai de kolom om en plaats deze in de juiste gelabelde opvangbuizen. Draai gedurende 1 min op 2000 x g.
- Verwarm monsters tot 80 °C gedurende 15-20 minuten om chondroitinase ABC te inactiveren.
- Monster ontsalting en concentratie
- Indien nodig, bundel chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.9.5 in geschikte experimentele groepen (bijvoorbeeld door biologische replicatie of experimentele groep)
- Plaats het totale monstervolume in een centrifugaalfilterkolom van 500 μL met een MWCO van 3.000 Da.
- Draai gedurende 30 minuten bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Herhaal indien nodig indien gewenst het monstervolume de capaciteit van de centrifugaalfilterkolom overschrijdt.
- Was elke kolom 3x met 400 μL gedeoniseerd, gefilterd water. Gooi de doorstroming weg.
- Keer het filter om en draai gedurende 1 minuut op 2.000 x g in verse, correct gelabelde opvangbuizen. Bevries bij -80 °C of ga verder met de volgende stap.
- Desiccation
OPMERKING: In deze stap is uitdroging nodig, zodat monsters kunnen worden geresuspendeerd in een zo klein mogelijke hoeveelheid water en lopende buffer.- Plaats de met chondroïtine verteerde monsters uit stap 1.10.5 's nachts rechtstreeks in een roterende vacuümconcentrator of lyofiliseer als volgt:
- Vries monsters grondig in, hetzij een nacht in -80 °C, hetzij door het onderdompelen in vloeibare stikstof.
- Doorprik monsterdeksels met een naald van 18 G en plaats ze in de lyofilisatorkamer. Voeg indien nodig papieren handdoeken toe om in te pakken.
- Bevestig de lyofilisatorkamer aan de lyofilisator en vries een nacht droog (ten minste 40 °C, 0,135 Torr)
2. Polyacrylamide gel elektroforese van geïsoleerde en gezuiverde glycosaminoglycanen
- Bereid oplossingen die nodig zijn voor polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) van tevoren voor(tabel 1).
OPMERKING: Selecteer het percentage acrylamide van de oplossende geloplossing, afhankelijk van de grootte van de glycosaminoglycanen die naar verwachting in het monster zullen zitten. 15% wordt aanbevolen voor het oplossen van grotere fragmenten (langer dan 30 disacharide subeenheden); 22% voor kleinere fragmenten (<20 disacharide subeenheden in lengte). - Plaats de lege cassette in de PAGE-tank. Giet de oplossende gel als volgt: Meng in een buis van 15 ml 10 ml oplossende geloplossing, 60 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid) en 10 μl TEMED (voeg ALS LAATSTE TEMED toe). Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik pipet om de bovenstaande 10 ml oplossing snel aan de cassette toe te voegen. Overlay met 2 ml gedeïoniseerd, gefilterd water en laat de oplossende gel gedurende 30 minuten polymeriseren.
OPMERKING: Het volgende PAGE-protocol is geoptimaliseerd voor een verticaal PAGE-systeem met behulp van 13,3 x 8,7 cm (breedte x lengte) 1,0 mm dikke gietcassettes met een totaal volume van ongeveer 12 ml. Andere cassettesystemen kunnen worden gebruikt, maar vereisen mogelijk optimalisatie door de eindgebruiker. - Nadat de oplossende gel volledig is gepolymeriseerd, gooit u het bedekte water weg en giet u de stapelgel als volgt: meng in een buis van 15 ml 3 ml van de stapelgeloplossing, 90 μl 10% ammoniumpersulfaat (moet vers worden bereid), 3 μl TEMED (voeg TEMED als laatste toe).
- Keer de buis voorzichtig 2-3x om. Gebruik een pipet om snel de stapelgeloplossing over de gestolde oplossende gel toe te voegen; vul cassette tot rand. Volledig insteekkam meegeleverd met de set-up. Laat de stapelgel 30 min polymeriseren.
- Zodra de gel is gepolymeriseerd, zorgt u ervoor dat de tapestrip van de bodem van de cassette wordt verwijderd en plaatst u de cassette terug in de PAGE-tankassemblage.
- Vul de bovenste en onderste kamers met respectievelijk de bovenste en onderste kamerbuffer.
- Los de gedroogde monsters uit stap 1.11.4 op in het minimaal noodzakelijke volume gedeoniseerd, gefilterd water (ten hoogste 50% van het volume van de putten in de PAGE-gel). Meng 1:1 met de buffer voor het laden van het monster. Laad de monsters en de HS oligosaccharide "ladders" (zie tabel 1) in de gel.
- Voer de gel 5 min voor op 100 V. Laat de gel vervolgens 20-25 minuten op 200 V lopen (voor een 15% polyacrylamide oplossende gel), 40-50 min (voor een 18% polyacrylamide oplossende gel), 90-100 min (voor 22% polyacrylamide oplossende gel).
OPMERKING: Enige optimalisatie van de 200 V-looptijd kan nodig zijn. Fenolrood migreert voor heparine oligosacchariden die 2 polymeersubeenheden lang zijn (d.w.z. mate van polymerisatie 2 of dp2); broomfenolblauw migreert voor dp10-dp14. De beste resultaten worden verkregen wanneer de spanning zodanig wordt toegepast dat de fenolrode band bijna, maar niet helemaal, naar de bodem van de gel migreert. Pas de looptijd dienovereenkomstig aan.
3. Zilverkleuring protocol
- Bereid alle oplossingen die nodig zijn voor zilverkleuring van tevoren voor(tabel 2).
OPMERKING: Raak de PAGE-gel niet direct aan totdat deze is gekleurd, ontwikkeld en in stopoplossing is geplaatst. Manipuleer in plaats daarvan de gel met schoon plastic of glazen gereedschap. Het direct hanteren van de gel zal resulteren in vingerafdrukvervormingen en andere zichtbare artefacten op de gel na kleuring. - Zodra de run is voltooid, demonteert u de cassette en extraheert u de gel in een schone, middelgrote container gevuld met gedeïoniseerd, gefilterd water.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de gel direct wordt gehanteerd, gebruikt u pipetpunt of een ander plastic voorwerp om de gel voorzichtig van de cassette af te pellen terwijl deze in water wordt ondergedompeld. Gel kan kwetsbaar zijn - voorzichtig omgaan.- Gooi het water weg. Kleur de gel in Alcian blauwe kleuringsoplossing gedurende 5 min.
- Gooi Alcian blauwe vlek weg. Snel spoelen/wassen 2-3x met gedeoniseerd, gefilterd water totdat het grootste deel van de Alcian blauwe kleuroplossing is verwijderd.
- Laat de vlekken een nacht in gedeoniseerd, gefilterd water op de rocker. Zorg ervoor dat er voldoende volume gedeoniseerd, gefilterd water is om ervoor te zorgen dat eventuele resterende vlek 's nachts volledig van de gel wordt gewassen.
- Wasgel in 50% methanol (40 min totaal, vervang de oplossing 2-3x).
- Was gel in gedeïoniseerd, gefilterd water gedurende 30 min. Gooi water weg en herhaal nog 3 keer voor een totaal van 2 uur, vervang het water elke keer.
- In een verse, schone container, beits de gel gedurende 30 minuten in zilvernitraatkleuringsoplossing.
- Snel spoelen/wassen 2-3x in gedeoniseerd, gefilterd water om de zilverkleuringsoplossing volledig te verwijderen.
- Was gedurende 30 minuten in gedeïoniseerd, gefilterd water. Gooi water weg en herhaal dit 2x gedurende een totaal van 90 minuten, waarbij u telkens het waterbad vervangt.
- Gooi water weg en voeg een ontwikkelingsoplossing toe.
- Zodra de ontwikkelingsoplossing is toegevoegd, observeer de gel zorgvuldig en let op het verschijnen van banden. Afhankelijk van de kwaliteit van de vlek en de massa van het geladen monster, kan de ontwikkeling enkele seconden tot enkele minuten duren.
- Zodra de gewenste banden zichtbaar zijn, gooit u de ontwikkelende oplossing onmiddellijk weg en wast u kort met stopoplossing.
- Gooi de was van de stopoplossing weg en vervang deze door een nieuwe stopoplossing. Laat 1 uur weken op een rocker of shaker.
- Was 's nachts in gedeioniseerd, gefilterd water (de gel kan echter onmiddellijk na het wassen van de stopoplossing in beeld worden gebracht).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcian blauw wordt gebruikt om gesulfateerd GAGs 10te kleuren; dit signaal wordt versterkt door het gebruik van een volgende zilvervlek 11. Figuur 1 geeft een visuele demonstratie van het ontwikkelingsproces van zilverkleuring. Zoals aangetoond, wordt het Alcian blauwe signaal dat GAG's vertegenwoordigt, gescheiden door elektroforese, versterkt naarmate het zich ontwikkelende middel de polyacrylamide-gel binnendringt. Typisch, het ontwikkelingsproces zal zilver en Alcian blauw gekleurde GAG's verminderen op een dichtheidsafhankelijke manier, waarbij de randen van elke band eerst verminderen, terwijl de dichter beitsende gebieden in het midden het laatst zullen vlekken.
In de literatuur varieert de gerapporteerde detectiegrens van GAG's met behulp van PAGE-gebaseerde benaderingen van 0,5-1 μg12,13. Om de detectiegrens met behulp van onze aanpak te bepalen, werden heparansulfaat oligosacchariden van verschillende polymeerlengtes (ongefractioneerde heparine, dp20, dp10, dp6) op een 22% polyacrylamidegel geladen, vervolgens uitgevoerd en gekleurd zoals hierboven beschreven. Elke oligosacharide werd tweemaal geladen op twee verschillende massa's: 1,0 μg en 0,5 μg. Figuur 2 toont aan dat onze techniek vrij gemakkelijk 0,5 μg gezuiverde GAG kan detecteren. Met name ongefractioneerde heparine werd het minst gemakkelijk gedetecteerd van de vier verschillende oligosacchariden die werden getest, waarschijnlijk als gevolg van een bredere verdeling van polymeergroottes die de dichtheid van elke individuele band dienovereenkomstig vermindert.
Om de efficiëntie van GAG-zuivering uit vloeibare biologische monsters te beoordelen, werden GAG's geïsoleerd uit twee bronchoalveolaire lavage (BAL) monsters. Zoals weergegeven in figuur 3,was het eerste monster gemarkeerd als A dat werd gebruikt voor GAG-isolatie 1 ml BAL-vloeistof geoogst uit een muis 24 uur na intratracheale lipopolysaccharide (LPS) (3 mg / kg), toegediend om alveolaire epitheliale HS-uitscheiding te induceren 5. 10 μg in de handel verkrijgbare dp6 werd rechtstreeks aan deze BAL-vloeistof toegevoegd om te dienen als een "spike in" -controle om het verlies van GAG's tijdens het isolatieproces te beoordelen. Het tweede monster gemarkeerd als B bestond uit 10 ml BAL-vloeistof gepoold van 3 muizen die 24 uur eerder intratracheale LPS (3 mg / kg) kregen, zonder exogene GAG-spike-in. Beide monsters werden tegelijkertijd verwerkt voor GAG-isolatie en alle 3 fracties die uit de ionenuitwisselingskolom werden elueerd, werden behouden en verder verwerkt om te bepalen of er GAG's aanwezig waren in de lage affiniteits- en wasfracties. 2 μg commercieel gekochte dp20,dp10 en dp6 heparan sulfaat oligosacchariden werden uitgevoerd in de PAGE gel naast deze monsters om een referentie te bieden waarmee de grootte van HS GAG's in elke eluted fractie kwalitatief kan worden beoordeeld, evenals een referentie om de dichtheid te vergelijken met de 10 μg "spike in" -controle die GAG-isolatie onderging.
Om het gebruik van deze techniek op vast weefsel aan te tonen, werd heparansulfaat geïsoleerd uit een stuk bevroren muizenlong van 15 mg zoals hierboven beschreven. Tijdens het isolatie- en zuiveringsproces werd de lage affiniteitsfractie (0,2 M NaCl) die van de ionenuitwisselingskolom was elueerd, behouden en verwerkt naast de fractie met hoge affiniteit (2,7 M NaCl) en op de gel uitgevoerd(figuur 4). 2 μg commercieel gekochte dp20, dp10 en dp6 heparansulfaat oligosacchariden werden naast deze monsters uitgevoerd om een referentie voor grootte te bieden. Zoals te zien is, leverde het hele longhomogenaat een ruime hoeveelheid geïsoleerd HS op, waarbij de kleinste fragmenten ongeveer gelijk waren aan dp10 in grootte. De relatieve verrijking van Alcian blauw/zilvervlek gretige inhoud GAG's in de 2,7 M NaCl fractie toont aan dat heparansulfaat met hoge affiniteit bindt aan de ionenuitwisselingskolommen en met hoge specificiteit van de kolom kan worden afgeloekt. Het hele longhomogenaat leverde een ruime hoeveelheid geïsoleerd heparansulfaat (2,7 M NaCl-fractie) op, waarbij de kleinste fragmenten ongeveer gelijk waren aan dp10 in grootte.
Figuur 1: Ontwikkelingsproces van zilvervlekken. Alcische blauwe kleuring van ongefractioneerde heparine (UFH) of grootte-gedefinieerde oligosacchariden (dp = mate van polymerisatie) gescheiden door elektroforese wordt versterkt door zilverkleuring. Van links naar rechts: UFH, dp20, dp10, dp6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gevoeligheid van polyacrylamidegel en zilverkleuring voor de detectie van heparansulfaat. Heparansulfaat oligosacchariden van verschillende lengtes (ongefractioneerde heparine aka UFH, dp20, dp10, dp6) waren op een 22% polyacrylamide gel en liep en zilver gekleurd. Elke oligosacharide werd tweemaal geladen op twee verschillende massa's: 1,0 μg (meest linkse banden) en 0,5 μg (meest rechtse banden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Efficiëntie van GAG-zuivering uit vloeibare biologische monsters. GAG's geïsoleerd uit twee bronchoalveolaire lavage (BAL) monsters, hier gelabeld als "A" en "B", werden uitgevoerd op een 22% polyacrylamide gel en zilver gekleurd. Monster A bestond uit 1 ml BAL-vloeistof geoogst uit een muis 24 uur na behandeling met 3 mg/kg intratracheale lipopolysaccharide (LPS). Een extra 10 μg dp6 HS werd aan dit monster toegevoegd als een "spike in" controle. Monster B bestond uit 10 ml gepoolde BAL-vloeistof verzameld van 3 muizen 24 uur na toediening van LPS. Elk monster werd uitgevoerd naast fracties uit de ionenuitwisselingskolom die waren geïlueerd met verdunningsmiddel ("wash") of lage concentraties NaCl (0,2 M). 2 μg commercieel gekochte dp20, dp10 en dp6 heparan sulfaat oligosacchariden werden gebruikt als maatreferenties (meest linkse banden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Meting van de grootte van heparansulfaten geïsoleerd en gezuiverd uit een gezonde muizenlong. Heparinesulfaatgehalte geïsoleerd en gezuiverd uit 15 mg bevroren monster van een long geïsoleerd van een gezonde muis en uitgevoerd op een 22% polyacrylamide gel. Heparansulfaat werd uit de ionenuitwisselingskolom elueerd met ofwel lage concentraties (0,2 M; lage affiniteitsfractie) of hoge concentraties (2,7 M, 16% oplossing; hoge affiniteitsfractie) NaCl. 2 μg commercieel gekochte dp20, dp10 en dp6 heparan sulfaat oligosacchariden werden gebruikt als maatreferenties (meest linkse banden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| OPMERKING: Alle oplossingen moeten voor gebruik worden gefilterd (0,22 μm). | |||
| Oplossing | Recept | Compositie | Opmerkingen |
| Oplossende gel/onderste kamer lopende buffer (2 L of 4 L) | Boorzuur, MW 61.83 | 2L: 12,36 g; 4L: 24,76 g | Gewenste concentratie: 0,1 M |
| Tris basis, MW 124.14 | 2L: 24,2 g; 4l: | Gewenste concentratie: 0,1 M | |
| Disodium EDTA MW 336.21 of dihydraat, MW 372.36 | 2L: respectievelijk 6,7 g of 7,4 g; 4L 13,4 g respectievelijk 14,8 g | Gewenste concentratie: 0,01 M | |
| Gedeoniseerd water | 2L of 4L | Stel de pH in op 8,3 na het volledig oplossen van reagentia | |
| Bovenkamer lopende buffer (1 L) | Glycine | 93 gr | Gewenste concentratie: 1 M |
| Tris basis, MW 124.14 | 24.2 gr | Gewenste concentratie: 0,2 M | |
| Gedeoniseerd water | 1 l | ||
| Oplossende gel, 22% totaal acrylamide (500 ml) | Acrylamide, MW 71,08 | 100.1 gr | Gewenste concentratie: 20,02% w/v |
| N,N'-methyleen-bis-acrylamide (bis, MW 154.17) | 10 gr | Gewenste concentratie: 2% w/v | |
| Sacharose | 75 gr | Gewenste concentratie: 15% w/v | |
| Gelbuffer oplossen | 500 ml | Breng tot een totaal volume van 500 ml; vereist minder dan 500 ml buffertotaal | |
| Oplossende gel, 15% totaal acrylamide (400 ml) | Acrylamide, MW 71,08 | 56.3 gr | Gewenste concentratie: 14,08% w/v |
| N,N'-methyleen-bis-acrylamide (bis, MW 154.17) | 3,7 g | Gewenste concentratie: 2% w/v | |
| Sacharose | 20.8 gr | Gewenste concentratie: 15% w/v | |
| Gelbuffer oplossen | 400 ml | Breng tot een totaal volume van 400 ml; vereist minder dan 400 ml buffertotaal | |
| Stapelgel (100 ml) | Acrylamide, MW 71,08 | 4,75 g | Gewenste concentratie: 4,75% w/v |
| N,N'-methyleen-bis-acrylamide (bis, MW 154.17) | 0,25 g | Gewenste concentratie: 0,25% w/v | |
| Gelbuffer oplossen | 100 ml | Voeg 80 ml buffer en volledig opgeloste reagentia toe. Stel vervolgens de pH in op 76,3 met zoutzuur, druppelsgewijs. Breng vervolgens tot een totaal volume van 100 ml met oplossende gelbuffer. | |
| Monster laadbuffer (500 ml) | Sacharose | 250g | Gewenste concentratie: 50% w/v |
| Fenol rood | 500 mg | Gewenste concentratie: 1mg/ml | |
| Broomfenol blauw | 250 mg | Gewenste concentratie: 0,5 mg / ml | |
| Gedeoniseerd water | 500 ml | Breng tot een totaal volume van 500 ml; vereist minder dan 500 ml water totaal | |
| Heparine afgeleide oligosacharide 'ladder' (2 ml elk) | DP6 | 0,1 mg | OPMERKING: Beveel aan om heparine afgeleide oligosacchariden 6 polymeer subeenheden in lengte (ook bekend als mate van polymerisatie 6, of dp6) te gebruiken voor de kleinste band, dp20 voor de grootste band en dp10 voor de middelste band. Wel kunnen er desgewenst andere combinaties worden gebruikt. Gewenste concentratie: 0,05 mg/ml |
| DP10 | 0,1 mg | ||
| DP20 | 0,1 mg | ||
| Gedeoniseerd water | 3 ml | Los elke oligosaccharide op in afzonderlijke buizen met elk 1 ml | |
| Buffer voor het laden van monsters | 3 ml | Voeg 1 ml (1:1 mengsel) toe aan elke oligosacharide-oplossing | |
Tabel 1: Oplossingen die nodig zijn voor polyacrylamidegelelektroforese van gezuiverde glycosaminoglycanen. Alle oplossingen moeten vóór gebruik worden gefilterd (0,22 μm).
| OPMERKING: Alle oplossingen moeten voor gebruik worden gefilterd (0,22 μm). | |||
| Oplossing | Recept | Compositie | Opmerkingen |
| Alcian blauwe kleuringsoplossing (500 ml) | Alcian blauw 8GX poeder | 2,5 g | Gewenste concentratie: 0,5% w/v |
| 2% v/v ijsazijn | 500 ml | ||
| Zilverbeits (200 ml) | Gedeoniseerd water | 192,7 ml | Bereid vlekoplossing vers voor; gebruik binnen een week. |
| 7.6M natriumhydroxide | 2 ml | Voeg hiervoor 3,04 g natriumhydroxidekorrels toe aan 10 ml water | |
| Ammoniumhydroxide | 3,3 ml | ||
| 4M zilvernitraat oplossing | 2 ml | Voeg hiervoor 3,397 g zilvernitraat toe aan 5 ml water. Voeg druppelsgewijs toe tijdens het roeren om neerslag te voorkomen. | |
| Ontwikkeloplossing (501 ml) | Gedeoniseerd water | 500 ml | De ontwikkelingsoplossing moet vers worden gemaakt en binnen 24 uur worden gebruikt. |
| 2,5% m/v citroenzuur | 1 ml | Om te maken, voeg 100 mg toe aan 4 ml gedeioniseerd water. Citroenzuur moet vers worden gemaakt. | |
| Formaldehyde | 250μL | ||
| Stopoplossing (500 ml) | Gedeoniseerd water | 300 ml | |
| Ijsazijn | 20 ml | ||
| Methanol | 90 ml | ||
Tabel 2: Oplossingen die nodig zijn voor zilverkleuring van glycosaminoglycanen gescheiden door polyacrlamidegelelektroforese. Alle oplossingen moeten vóór gebruik worden gefilterd (0,22 μm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GAG's spelen een centrale rol in veel verschillende biologische processen. Een van de belangrijkste functies van gesulfateerd GAG's (zoals HS en CS) is om te interageren met en te binden aan liganden, die stroomafwaartse signaleringsfuncties kunnen veranderen. Een belangrijke determinant van GAG-bindingsaffiniteit aan verwante liganden is de lengte van de GAG-polymeerketen 8,9,14. Om deze reden is het belangrijk voor onderzoekers om met redelijke precisie de grootte van GAG-ketens te kunnen definiëren die zijn geïsoleerd uit biologische monsters van belang. Om praktisch te zijn, moet deze techniek kunnen worden uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en reagentia.
Dit protocol beschrijft een methode om GAG's uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren, om ze op grootte te scheiden via PAGE en om ze te visualiseren met behulp van Alcian blauwe en zilveren kleuringstechniek. Hoewel er verschillende manieren zijn om glycosaminoglycanen op grootte te scheiden, heeft onze aanpak verschillende sterke punten die specifiek zijn voor de toepassing van deze techniek in biowetenschappelijke laboratoria. Ten eerste is deze techniek met een detectiegrens van 0,5 μg zeer gevoelig voor de detectie van GAG's van belang. In onze ervaring zouden zelfs monsters die relatief lage concentraties GAG's bevatten (d.w.z. BAL-vloeistofmonsters) meer dan genoeg GAG moeten opleveren voor detectie met behulp van deze methode. Hoewel de opbrengst van isolatie en zuivering van BAL-vloeistof zal variëren per techniek en specifieke GAG van belang, is het onze ervaring dat 10 ml ruwe BAL-vloeistof voldoende HS oplevert om detecteerbaar te zijn met behulp van deze techniek. De opbrengst van vaste organen is aanzienlijk hoger, afhankelijk van het geoogste weefsel, maar het is onze ervaring dat een eerste vast monster van 10 mg voldoende HS oplevert voor detectie met behulp van deze techniek.
Het is belangrijk op te merken dat de uiteindelijke beeldvorming van de gekleurde PAGE-gel zal variëren afhankelijk van de beeldvormingstechnologieën die beschikbaar zijn voor de eindgebruiker. Digitale foto's van de gel kunnen worden gemaakt met behulp van een aantal verschillende systemen, waaronder tal van in de handel verkrijgbare geldocumentatiesystemen of een gewone commerciële camera, afhankelijk van de beschikbare apparatuur en de vereiste detectiegevoeligheid (meestal gedicteerd door de hoeveelheid monster die op de gel wordt geladen). Er moet ook worden opgemerkt dat de lichtbron die nodig is om deze gel digitaal in beeld te brengen, kan variëren afhankelijk van de dichtheid van het monster en de hoeveelheid ontwikkelingstijd die nodig is tijdens het kleuringsproces. Gels die zich snel ontwikkelen en zilverkleurige banden produceren die gemakkelijk zichtbaar zijn voor het blote oog, vereisen UV-transilluminatie voor de beste beelden, omdat het grootste deel van het licht wordt geabsorbeerd door niet-gereageerd Alcian-blauw. Gels die langere ontwikkelingstijden vereisen (zoals die met zeer kleine hoeveelheden monster) vereisen epi-verlichting of transilluminatie met normaal volledig spectrumlicht, omdat dit het beste wordt geabsorbeerd door de zilvervlek.
Een andere kracht van deze techniek is dat het bijzonder aanpasbaar is aan life sciences labs, vanwege de basis in eenvoudige PAGE-technologie, met behulp van apparatuur en reagentia die algemeen beschikbaar zijn en goedkoop worden verkregen. Hoewel er andere benaderingen zijn voor het kwantificeren van de lengte van geïsoleerde GAG-polymeren (bijv. Capillaire elektroforese), vereisen ze meestal zowel kennis als apparatuur die niet algemeen beschikbaar is in de meeste life sciences-laboratoria15,16. De eenvoud van deze benadering en de relatief betaalbare en beschikbare aard van de vereiste reagentia maakt deze techniek gemakkelijk aanpasbaar door life sciences onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van GAG-biologie in de context van hun gegeven subvelden. Bovendien dient deze techniek als een essentiële aanvulling op op massaspectrometrie gebaseerde technieken voor het detecteren van GAG's in biologische weefsels. Hoewel op massaspectrometrie gebaseerde benaderingen in staat zijn om GAG's met een hoge gevoeligheid te detecteren en subtiele verschillen in structuur te onderscheiden van complexe monsters17, is het vanwege de aard van de technologie niet in staat om onderscheid te maken tussen GAG-polymeren op grootte. Om deze reden is een op PAGE gebaseerde benadering essentieel voor het waarmaken van de grootte van HS-polymeren in biologische monsters van belang.
Het is belangrijk op te merken dat er verschillende beperkingen zijn aan de technieken die in dit artikel worden beschreven. De eerste en meest opvallende is dat vanwege de lading-ladingsinteractie die centraal staat in de Alcian blauwe kleuringsreactie, deze benadering zeer selectief is voor sterk gesulfeerde GAG's en slechts zwak zal kleuren meer neutraal geladen moieties (bijv. Hyaluronzuur18). Deze techniek zal dus waarschijnlijk de resultaten vertekenen naar meer zure GAG-moieties. Om deze reden moeten aanvullende benaderingen voor het meten van GAG-gehalte in biologische monsters van belang (bijv. op massaspectrometrie gebaseerde technieken) aanvullend worden gebruikt om een completer beeld te geven van de GAG's die aanwezig zijn in experimentele monsters. Bovendien, voor eindgebruikers die specifiek geïnteresseerd zijn in het meten van de grootte van hyaluronaat, hebben anderen vergelijkbare PAGE-gebaseerde technieken beschreven die gebruikmaken van gebiotinyleerd hyaluronzuurbindend eiwit (HABP) dat kan worden aangepast aan de hier beschreven basistechniek19.
Samenvattend kan de techniek die in dit artikel wordt gepresenteerd, worden gebruikt om GAG's uit biologische monsters met veel gevoeligheid en specificiteit te isoleren, zuiveren en detecteren en om de inheemse lengte van deze polysaccharideketens te meten. Deze informatie kan van cruciaal belang zijn voor het testen van hypothesen over GAG-ligandinteracties vanwege het belang van GAG-polymeerlengte bij het bepalen van cognate ligandbindingsaffiniteit. Deze benadering heeft verschillende voordelen, met name de relatieve eenvoud en het aanpassingsvermogen aan biowetenschappelijke onderzoekslaboratoria, hoewel het wordt beperkt door zijn relatieve voorkeur voor negatief geladen GAG-moieties. Ondanks dit nadeel vertegenwoordigt deze techniek een robuust hulpmiddel dat onderzoekers zou aanmoedigen om de rol van GAG's in orgaanhomeostase en -ziekte te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL en EPS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
