Denne protokol bruger fluorescerende journalister og cellesortering til at forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T cellelinjer. To plasmider anvendes til disse forenklede knock-in eksperimenter, nemlig en CRISPR/Cas9- og DsRed2-udtrykke plasmid og en homolog rekombination donor plasmid udtrykke EBFP2, som er permanent integreret på Rosa26 græshoppe i immunceller.
Funktionelle genomforskninger af immunsystemet kræver genetiske manipulationer, der involverer både sletning af målgener og tilsætning af elementer til proteiner af interesse. Identifikation af genfunktioner i cellelinjemodeller er vigtig for genopdagelse og udforskning af celle iboende mekanismer. Men genetiske manipulationer af immunceller som T-celler og makrofag cellelinjer ved hjælp af CRISPR/Cas9-medieret knock-in er vanskelige på grund af den lave transfection effektivitet af disse celler, især i en quiescent tilstand. For at ændre gener i immunceller, lægemiddelresistens udvælgelse og virale vektorer bruges typisk til at berige for celler, der udtrykker CRIPSR / Cas9-systemet, hvilket uundgåeligt resulterer i uønsket indgriben af cellerne. I en tidligere undersøgelse designede vi dobbelt fluorescerende journalister koblet til CRISPR /Cas9, der blev forbigående udtrykt efter elektroporation. Denne tekniske løsning fører til hurtig gensletning i immunceller; gen knock-in i immunceller som T-celler og makrofager uden brug af valg af lægemiddelresistens eller virale vektorer er endnu mere udfordrende. I denne artikel viser vi, at ved at bruge cellesortering til at hjælpe med udvælgelse af celler, der forbigående udtrykker CRISPR / Cas9-konstruktioner rettet mod Rosa26-locus i kombination med en donorplasmid, kan gen knock-in opnås i både T-celler og makrofager uden lægemiddelresistensberigelse. Som et eksempel viser vi, hvordan man udtrykker human ACE2, en receptor af SARS-Cov-2, som er ansvarlig for den nuværende Covid-19-pandemi, i RAW264.7 makrofager ved at udføre knock-in eksperimenter. Sådanne gen knock-in celler kan i vid udstrækning anvendes til mekanistiske undersøgelser.
Immunceller er afgørende for forsvar mod patogener. Både medfødt og adaptiv immunitet er nødvendig for clearance af infectants og vedligeholdelse af væv homøostase1,2. Cellelinjemodeller er vigtige værktøjer til at forstå de molekylære fundamentale elementer i pattedyrs immunsystem; de anvendes i in vitro funktionelle assays, såsom dem modellering human T-celle aktivering, og til bestemmelse af funktionen af genetiske faktorer i aktivering eller dæmpning immunrespons3,4. Det er vigtigt at bemærke, at pattedyrets immunsystem er enormt heterogent, og lige så vigtigt styrer et stort antal molekyler differentiering, migration og funktion af en given celletype5,6.
Grupperet Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 genom redigeringsværktøjer giver mulighed for genetisk manipulation af specifikke celletyper, hvilket letter funktionel anmærkning af gener på en præcis måde7,8. Flere offentliggjorte protokoller har beskrevet leveringen af CRISPR/Cas9 i form af Cas9-guide RNA-komplekser kendt som ribonucleoproteiner (RNG’er) i HEK293-celler, Jurkat-cellelinjer, primære T-celler9,10, makrofager11,12,13, stamceller14og andre15,16. I disse protokoller opnås genmærkning normalt ved at sammensmelte et fluorescerende tag til endogene proteiner17,18. Men få forsøg er gjort for at bruge dobbelt fluorescerende reportere, som er kompatible med enkelt celle sortering, at lette knock-in eksperimenter19,20, især i immunceller.
Dybdegående mekanistiske analyser, der har til formål at forstå funktionerne i en ny genetisk faktor i immunceller, kræver generelt celletypespecifik sletning af et gen, genetiske redningsforsøg og ideelt identifikation af dets interactorer. Selvom metoder til optimering af genetisk sletning af gener i immunceller er blevet offentliggjort9,15,21, langt færre metoder er blevet rapporteret til at indføre knock-in alleler med alsidige funktioner til at forstå immunresponset. Derfor sigter vi i denne protokol mod i detaljer at beskrive en effektiv og meget reproducerbar protokol til at udtrykke et protein af interesse (POI) på safe harbor locus Rosa26 i både menneskelige og murin immuncellelinjer. Vi designede et tofarvet reportersystem til at berige celler transfected med plasmider, der udtrykker CRISPR / Cas9 (DsRed2) og en rekombinant DNA-skabelon (EBFP2), som kan isoleres ved cellesortering. Efter denne protokol opnåede vi flere knock-in linjer af den menneskelige T-cellelinje Jurkat og murine makrofag RAW264.7 til funktionelle analyser af dårligt studerede proteiner.
Som et eksempel viser vi i denne protokol, hvordan man får knock-in RAW264.7 makrofager, der stabilt udtrykker human ACE2 (en receptor af SARS-Cov-2)22. Fordi medfødte immunceller er involveret i patogenesen af Covid-1923,24 og human ACE2 betragtes som en vigtig receptor, der kræves for viral indrejse i celler før replikation, makrofager med knock-in af menneskelige ACE2 kan tjene som et nyttigt redskab til mekanistiske undersøgelser af viral multiplikation inde makrofager. Parallelt, vi også præsentere et eksempel på knock-in af et gen på den menneskelige ROSA26 græshoppe til at udtrykke RASGRP1 protein, som blev smeltet på sin amino endestation med en affinitet Twin-Strep-tag (OST). T-celler er centrale målceller i immunterapier, og et stigende antal undersøgelser har fokuseret på manipulation af deres reaktionsevne over for kræft25,26. Som Rasgrp1 er kendt for at være en vigtig signalering molekyle nedstrøms af T-celle receptor og dens interactors er ikke godt belyst27, OST-RASGRP1 knock-in model giver grundlaget for at identificere interactors regulerer reaktionen af T-celler til tumorer og infektion. Samlet set kan disse værktøjer bruges til Covid-19-studier og opdagelsen af nye molekyler, der interagerer med Rasgrp1.
I vores eksperimenter demonstrerede vi, hvordan man udfører knock-in redigering i immunceller fra konstruktionsdesign til knock-in cellescreening og validering ved hjælp af menneskelige Jurkat T-celler og murin RAW264.7 makrofager som eksempler. Både T-celle- og makrofagscellelinjer er modstandsdygtige over for transfection36,37; Problemet med lav effektivitet af CRISPR/Cas9-levering kan imidlertid løses ved hjælp af fluorescerende journalister kombineret me…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker flowcytometrikernefaciliteten på Xinxiang Medical University. Udviklingen af en sådan teknologi er blevet støttet af NSFC-tilskud 81601360 til LZ, 81471595 og 32070898 til YL. Arbejdet er også støttet af Foundation of Henan Educational Committee No. 21IRTSTHN030.
Amersham Imager 600 | Ge Healthcare | imaging of chemiluminescence | |
Ampicillin, sodium salt | MP Biomedicals | 194526 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074 | at 1/5000 dilution |
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1 | Merck | MABS146 | 1.0 μg/mL of working concentration |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
β-Actin (D6A8) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 8457 | at 1/1000 dilution |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | |
BbsI-HF | New England BioLabs | R3539S | |
Cellometer Mini Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | ||
E.coli DH5α Competent Cells | Takara | 9057 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | MP Biomedicals | 196055 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | cell culture reagent |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14200075 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | HyClone | SH30022.01 | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
FACSAria™ Fusion | BD Biosciences | equipped with biosafety cabinet | |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | ||
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tube | BD Biosciences | 352003 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
FlowJo version 10.7 | BD Biosciences | ||
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 5174 | at 1/1000 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | ThermoFisher Scientific | 31430 | at 1/5000 dilution |
Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
Immobilon-PSQ PVDF Membrane | Millipore | ISEQ00010 | |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/ |
Kanamycin sulfate | MP Biomedicals | 194531 | |
LB agar powder | ThermoFisher Scientific | 22700041 | |
Multi-channel Pipette (30-300 μL) | Eppendorf, or similar | ||
Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 10 μL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master Mix | New England BioLabs | (M0489) | for high GC% template |
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | ThermoFisher Scientific | 26616 | |
Pipette tip 0.1-20µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.005 | |
Pipette tip 2-200µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.021 | |
Pipette tip 50-1000µl | Eppendorf, or similar | 0030 075.064 | |
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
pX458-DsRed2 | Addgene | 112219 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | purify plasmid from restriction digestion |
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England BioLabs | M0494S | |
RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | https://www.atcc.org/ |
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)] | Abcam | ab108252 | at 1/1000 dilution |
RPMI 1640 Medium | HyClone | SH30027.01 | |
Strep-Tactin Sepharose beads | IBA Lifesciences | 2-1201-010 | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | S34859 | |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-Rad | ||
1.5 mL microtubes, PCR-clean | Eppendorf, or similar | 0030 125.215 | |
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | |
96-well Clear Round Bottom TC-treated Microplate | Corning | 3799 |