Summary
الموصوف هنا هو بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي لإنتاج استخراج الحمض النووي عالية الجودة من البعوض. هذه الاستخراجات مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي من المصب.
Abstract
اقترح بروتوكول استخراج الحمض النووي الذي نشر مؤخرا باستخدام الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الآلي أنه من الممكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية من بعوضة فردية محفوظة جيدا كافية لتسلسل الجينوم الكامل في المصب. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على أداة استخراج الحمض النووي الآلية باهظة الثمن مانعة بالنسبة للعديد من المختبرات. هنا ، توفر الدراسة بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على حبة مغناطيسية صديقة للميزانية ، وهو مناسب للنسب المنخفضة إلى المتوسطة. تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا بنجاح باستخدام عينات البعوض Aedes aegypti الفردية. سيؤدي انخفاض التكاليف المرتبطة باستخراج الحمض النووي عالي الجودة إلى زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.
Introduction
وقد سمح التطور الأخير لبروتوكول استخراج الحمض النووي المحسن1 بالعديد من الدراسات عالية التأثير في المصب التي تنطوي على تسلسل الجينوم الكامل2و3و4و5و6. يوفر بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي هذا غلة الحمض النووي الموثوقة من عينات البعوض الفردية ، مما يقلل بدوره من التكلفة والوقت المرتبط بالحصول على عدد كاف من العينات من مجموعات الحقول.
وترتبط التطورات الأخيرة في علم الجينوم السكاني والمناظر الطبيعية ارتباطا مباشرا بانخفاض تكاليف تسلسل الجينوم بأكمله. على الرغم من أن بروتوكول استخراج الحمض النووي السابق1 يزيد من الكفاءة المرتبطة بالتسلسل الإنتاجي العالي ، إلا أن المختبرات / الدراسات الأصغر بدون الأموال قد تختار عدم استخدام هذه المناظر الطبيعية القوية الجديدة وأدوات الجينوم السكاني بسبب تكاليف تنفيذ البروتوكول (على سبيل المثال ، تكاليف الأدوات المتخصصة).
هنا، يتم تقديم بروتوكول استخراج الحمض النووي المعدلة التي تستخدم خطوة استخراج حبة مغناطيسية مماثلة نيمان وآخرون1 للحصول على الحمض النووي عالية النقاء ولكن لا تعتمد على أدوات عالية التكلفة لتحلل الأنسجة واستخراج الحمض النووي. هذا البروتوكول مناسب للتجارب التي تتطلب >10 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تخزين العينات العامة والاستعدادات قبل استخراج الحمض النووي
- هيدرات العينة في 100 ميكرولتر من الماء PCR الصف لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجة مئوية إذا تم تخزين العينة في الكحول >70٪ لتنعيم الأنسجة.
2. تعطيل العينة
- تعيين حاضنة أو اهتزاز كتلة الحرارة في 56 درجة مئوية.
- جعل البروتين K (PK) العازلة / مزيج الانزيم. مطلوب 2 ميكرولتر من البروتين K (100 ملغم / مل) و 98 ميكرولتر من البروتين K العازلة (مجموع 100 ميكرولتر) لكل استخراج البعوض الفردية. لإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 15٪ لضمان توافر حجم كاف.
- إذا كانت العينات رطبة قبل الاستخراج، فتخلص من المياه من كل أنبوب عينة.
- في أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على أنسجة البعوض، أضف 100 ميكرولتر من مزيج PK العازل/الإنزيم.
- تجانس الأنسجة باستخدام الحشرات أنبوب الطرد الدقيق.
- طرد العينات لمدة دقيقة واحدة في 9600 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان العينة لمدة 2-3 ساعة عند 56 درجة مئوية.
- أثناء الحضانة، قم بإعداد الكواشف الأخرى باستخدام خطوة استخراج الحمض النووي (الخطوة 3).
3. استخراج الحمض النووي
- جعل مزيج رئيسي حبة المغناطيسي. لكل عينة، اخلط 100 ميكرولتر من حاجز التحلل، و100 ميكرولتر من الإيزوبروبانول، و15 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (إجمالي 215 ميكرولتر). لإعداد مزيج رئيسي لتفاعلات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 20٪ لضمان توافر حجم كاف.
- بعد وقت الحضانة (الخطوة 2.7)، قم بنقل كل lysate إلى أنبوب طرد دقيق نظيف أو بئر ميكروبليت باستخدام ماصة.
- إضافة 100 μL lysate و 215 ميكرولتر من مزيج حبة مغناطيسية رئيسية لكل عينة.
- استخدام ماصة لخلط جيدا لمدة 10-20 ق ثم السماح لها الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هز الأنبوب برفق في بعض الأحيان لتحقيق أقصى قدر من الربط بين الخرز المغناطيسي والحمض النووي.
- ضع الأنبوب/اللوحة على فاصل الخرز المغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا.
- تجاهل السائل من أنبوب / لوحة باستخدام ماصة. عند إزالة الناطقة الفائقة، حاول عدم لمس أو إزعاج الخرز المغناطيسي الذي يحمل الحمض النووي.
- نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 325 ميكرولتر من العازلة الغسيل 1 إلى كل بئر.
- تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات 3.5-3.6.
- نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 1 إلى كل بئر.
- تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات 3.5-3.6.
- حرك الأنبوب/الصفيحة بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي وأضف 250 ميكرولتر من عازل الغسيل 2 إلى كل عينة.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات 3.5-3.6.
- نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 2 إلى كل بئر.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات 3.5-3.6.
- نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة elution إلى كل بئر.
- تخلط جيدا واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تحريك أنبوب / لوحة على فاصل حبة المغناطيسي والانتظار حتى الحل واضح.
- ماصة العملاقة في أنبوب جديد نظيف 0.5 ميكروسينتريف أو microplate جيدا.
- تخزين عينات الحمض النووي في 4 °C (تصل إلى 1 أسبوع) أو -80 °C. إذا كان يتم استخدام لوحة صغيرة، وتغطية ذلك مع parafilm.
- تحديد غلة الحمض النووي باستخدام أي طريقة مناسبة.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام قراءة الحمض النووي للفلورومتر وامتصاصه عند 260/280 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان متوسط غلة الحمض النووي لكل رأس البعوض الفردية / أنسجة الصدر 4.121 نانوغرام / ميكرولتر (N = 92، الانحراف المعياري 3.513) تقاس باستخدام مقياس الفلورومتر عند التملبد باستخدام 100 ميكروغرام من العازلة elution. وهذا يكفي ل10-30 نانوغرام متطلبات إدخال الحمض النووي الجينوم اللازمة لبناء مكتبة الجينوم كله1،7. يمكن أن تتراوح كمية الحمض النووي بين 0.3-29.7 نانوغرام / ميكرولتر اعتمادا على حجم جسم البعوض وظروف الحفظ. ويرجع بعض التباين العالي إلى سمة الخرز المغناطيسي المستخدم في الدراسة. قد تنتج ماركات مختلفة من الخرز المغناطيسي تركيزات أكثر اتساقا ، كما هو مبين في التقرير السابق1. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن أنواع البعوض المختلفة تختلف في الحجم وأن إنتاج الحمض النووي يعتمد على نطاقات حجم الأفراد والأنواع. إذا كان تركيز الحمض النووي أقل من النطاقات النموذجية ، فقد يعدل المرء فترة الحضانة في تفاعل proteinase K (الخطوة 2.7) ، ولكن يجب ألا يزيد هذا التمديد عن 16 ساعة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون للتبديل العلامات التجارية العازلة proteinase K و / أو تحلل تأثير كبير على العائد الحمض النووي1.
تظهر قراءة مقياس الفلورومتر الدقيق النموذجي للحمض النووي النهائي في المخزن المؤقت لل elution مع 0.5 m M EDTA في الشكل 1. وكان متوسط نسبة الامتصاص ل260/280 نانومتر 2.3 (الانحراف المعياري = 0.071). كانت البيانات متسقة من العينات المستخدمة في الدراسات السابقة لتسلسل الجينوم كله3،4.
الكاشف نموذجية وتكلفة قابلة للاستهلاك لاستخراج حوالي 9.50 دولار / عينة. وتشمل تقديرات التكاليف هذه الكواشف المدرجة في جدول المواد، وغيرها من المواد الاستهلاكية مثل نصائح ماصة ، أنابيب ، والقفازات اللازمة لاستخراج. الكواشف والتكلفة الاستهلاكية هي ما يعادل أي نموذجية المغناطيسية حبة القائمة على طريقة استخراج(الجدول 1). قد تختلف التكلفة إلى حد ما اعتمادا على خصومات الشراء بالجملة المتاحة لأي منتج معين. تأتي الفائدة الرئيسية من تكلفة هذا البروتوكول من عدم الحاجة إلى أداة استخراج الحمض النووي الآلية.
الشكل 1: خرج الفلورومتر. إنتاج نموذجي من الحمض النووي فلومتر الحمض النووي البعوض eluted في العازلة elution مع EDTA 0.5 mM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تحليل التكاليف لطرق الاستخراج المختلفة. يسرد الجدول التكاليف وعدد العينات التي تمت معالجتها في يوم عمل واحد لطرق استخراج مختلفة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لأنواع الحشرات الأخرى. وقد تم اختبار النسخة الأصلية من البروتوكول الذي تم تقديمه في نيمان وآخرون1 على أنواع متعددة، بما في ذلك Aedes aegypti، Ae. busckii، Ae. taeniorhynchus، Anopheles arabiensis، An. coluzzii، An. coustani, An. دارلينجي, An. funestus, An. غامبي, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, CX. theileri, Drosophila سوزوكي, كريسوميلا aeneicollis توتا absoluta, وكيفيريا lycopersicella2,8,9,10. ومن المتوقع أن يعمل هذا البروتوكول لهذه فضلا عن المفصليات الأخرى.
من الناحية المثالية ، يجب تخزين العينات في الإيثانول بنسبة 70٪ -80٪ عند 4 درجات مئوية قبل استخراج الحمض النووي. عادة، يستخدم الإيثانول 80٪ لتخزين عينات البعوض في أفريقيا. ويمكن أن تؤدي ظروف درجات الحرارة المرتفعة إلى تسريع تبخر الإيثانول وجعل محتوى الإيثانول أقل مما هو مقصود (70٪). كما أدت العينات المخزنة في الإيثانول بنسبة 100٪ أو الكحول المشوه أو 75٪ -90٪ من الأيزوبروبانول أو فرك الكحول إلى تسلسل الجينوم الكامل الناجح باستخدام بروتوكول نيمان وآخرون1 ، ومن المتوقع أن يؤدي هذا البروتوكول بشكل جيد بنفس القدر. كما تمت محاولة بروتوكول استخراج الحمض النووي الموصوف هنا على عينات مخزنة جافة في السيليكا ومجمدة عند -20 درجة مئوية. ومع ذلك، كانت هناك فرصة أعلى (15٪-30٪) للفشل عند تخزينها لمدة >6-12 شهرا، مما يشير إلى أن هذه كانت أقل من ظروف التخزين المثالية.
كما استخراج الحمض النووي دون تعطيل العينة المادية لديه فرصة أكبر للفشل (33٪)1، وهذا البروتوكول يتضمن تقنية تعطيل المادية اليدوية (الخطوة 2.5). ويمكن أيضا أن يتحقق تعطيل العينة باستخدام الخرز الصلب على أداة تحلل الأنسجة1.
الكواشف والتكلفة الاستهلاكية لاستخراج الحمض النووي باستخدام هذا البروتوكول قابلة للمقارنة مع طرق الاستخراج الأخرى المتاحة(الجدول 1). ومع ذلك، فإن البروتوكول الموصوف هنا لا يتطلب أداة آلية لاستخراج الحمض النووي. بسبب العمل اليدوي المشارك في معالجة استخراج الحمض النووي ، يمكن لشخص واحد عادة معالجة عينات 12-16 والانتهاء من تحديد كمي الحمض النووي في يوم واحد. هذا هو أقل بكثير مما يمكن أن عملية الإعداد استخراج الحمض النووي الآلي يوميا. وبالتالي، عند اختيار بروتوكول، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار قدرة معالجة العينة. ومع ذلك، فإن عتبة التكلفة المنخفضة التي يوفرها هذا البروتوكول ينبغي أن تمكن العديد من المختبرات والدراسات المحدودة الموارد من الاستفادة من تكنولوجيا التسلسل عالية الإنتاجية.
في كل من نيمان وآخرون1 وهذا البروتوكول، يمكن استبدال المخزن المؤقت elution مع المخزن المؤقت TE نموذجي، 10 mM تريس-Cl، أو المياه اعتمادا على تحليل المصب. قد يؤثر المخزن المؤقت elution الذي يحتوي على بعض EDTA على كفاءة الإنزيم. نموذجية الأنزيمية القص القائم على بروتوكولات إعداد مكتبة gDNA تشمل حلول تكييف أو القدرة المضافة للتعويض عن تثبيط الانزيم من قبل EDTA. وينبغي أيضا أن تعتبر أن EDTA قد تغير الامتصاص في الطول الموجي 230 نانومتر11. فعلى سبيل المثال، فإن التركيزات الأعلى من EDTA من شأنها أن تخلق قيمة امتصاص أعلى بين الطول الموجي 220-240 نانومتر من تلك الموضحة في الشكل 1 (البيانات غير مبينة).
يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع المختبرات مع الحد الأدنى من أدوات البيولوجيا الجزيئية. ويحاول البروتوكول الموصوف هنا خفض عتبات التكلفة المرتبطة باستخراج الجينوم وبالتالي زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نعترف بدعم التمويل من مركز جنوب غرب المحيط الهادئ الإقليمي للتميز للأمراض المنقولة بالنواقل الممول من المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (الاتفاقية التعاونية 1U01CK000516)، منحة CDC NU50CK000420-04-04، المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأميركية (مشروع هاتش 1025565)، وزمالة مختبر الحشرات الطبية في فلوريدا UF/IFAS إلى Tse-Yu Chen، ومنحة المرحلة الثانية من المرحلة الثانية من اتفاقية الأمن القومي CAMTech CAMTech (AWD05009_MOD0030)، ووزارة الصحة في فلوريدا (CONTRACT CODQJ). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المقالة هي تلك التي المؤلف (ق) ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر دائرة الأسماك والحياة البرية في الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
