Summary
Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.
Abstract
Ein kürzlich veröffentlichtes DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen und einem automatisierten DNA-Extraktionsinstrument deutete darauf hin, dass es möglich ist, qualitativ hochwertige und quantitativ DNA aus einer gut erhaltenen einzelnen Mücke zu extrahieren, die für die nachgelagerte Sequenzierung des gesamten Genoms ausreicht. Die Abhängigkeit von einem teuren automatisierten DNA-Extraktionsinstrument kann jedoch für viele Labore unerschwinglich sein. Hier liefert die Studie ein budgetfreundliches magnetperlenbasiertes DNA-Extraktionsprotokoll, das für niedrigen bis mittleren Durchsatz geeignet ist. Das hier beschriebene Protokoll wurde erfolgreich mit einzelnen Aedes aegypti Mückenproben getestet. Die reduzierten Kosten, die mit einer qualitativ hochwertigen DNA-Extraktion verbunden sind, werden die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung in ressourcenbeschmierten Laboren und Studien erhöhen.
Introduction
Die jüngste Entwicklung eines verbesserten DNA-Extraktionsprotokolls1 hat viele hochwirbende nachgelagerte Studien mit der Sequenzierung des gesamten Genoms2,3,4,5,6ermöglicht. Dieses auf magnetischen Perlen basierende DNA-Extraktionsprotokoll bietet eine zuverlässige DNA-Ausbeute aus einzelnen Mückenproben, was wiederum die Kosten und den Zeitaufwand reduziert, die mit der Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von Proben aus Feldsammlungen verbunden sind.
Jüngste Fortschritte in der Populations- und Landschaftsgenomik stehen in direktem Zusammenhang mit sinkenden Kosten für die Sequenzierung des gesamten Genoms. Obwohl das vorherige DNA-Extraktionsprotokoll1 die Effizienz im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung erhöht, können kleinere Labore / Studien ohne die Mittel die Verwendung dieser neuen leistungsstarken Landschafts- und Populationsgenomik-Tools aufgrund der Kosten für die Implementierung des Protokolls (z. B. Kosten für spezialisierte Instrumente) ablehnen.
Hier wird ein modifiziertes DNA-Extraktionsprotokoll vorgestellt, das einen ähnlichen magnetischen Perlenextraktionsschritt wie Neiman et al.1 verwendet, um hochreine DNA zu erhalten, aber nicht auf kostenintensive Instrumente für die Gewebelyse und DNA-Extraktion angewiesen ist. Dieses Protokoll eignet sich für Experimente, die >10 ng hochwertiger DNA erfordern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allgemeine Probenlagerung und Vorbereitung vor der DNA-Extraktion
- Hydratisieren Sie die Probe in 100 μL PCR-Wasser für 1 h (oder über Nacht) bei 4 °C, wenn die Probe in >70% Alkohol gelagert wurde, um das Gewebe weicher zu machen.
2. Unterbrechung der Probe
- Stellen Sie einen Inkubator oder Schüttelwärmeblock auf 56 °C ein.
- Machen Sie Proteinase K (PK) Puffer / Enzym-Mix. Für jede einzelne Mückenextraktion werden 2 μL Proteinase K (100 mg/ml) und 98 μL Proteinase K Buffer (insgesamt 100 μL) benötigt. Um einen Master-Mix für mehrere Proben vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 15%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
- Wenn die Proben vor der Extraktion hydratisiert wurden, entsorgen Sie Wasser aus jedem Probenröhrchen.
- In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Mückengewebe 100 μL PK-Puffer/Enzym-Mix hinzufügen.
- Homogenisieren Sie das Gewebe mit Mikrozentrifugen-Schlauchstößel.
- Zentrifugiert die Proben für 1 min bei 9.600 x g bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Probe für 2-3 h bei 56 °C.
- Bereiten Sie während der Inkubation die anderen Reagenzien mit dem DNA-Extraktionsschritt (Schritt 3) vor.
3. DNA-Extraktion
- Machen Sie eine magnetische Perlen-Master-Mischung. Mischen Sie für jede Probe 100 μL Lysepuffer, 100 μL Isopropanol und 15 μL magnetische Perlen (insgesamt 215 μL). Um eine Mastermischung für mehrere Reaktionen vorzubereiten, erhöhen Sie die Gesamtmenge (kombiniert für alle Einzelproben) um ~ 20%, um die Verfügbarkeit eines ausreichenden Volumens zu gewährleisten.
- Nach der Inkubationszeit (Schritt 2.7) wird jedes Lysat mittels Pipette in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Mikroplattenbohrung gegeben.
- Zu jeder Probe werden 100 μL Lysat und 215 μL der magnetischen Perlen-Mastermischung hinzugefügt.
- Verwenden Sie eine Pipette, um es für 10-20 s gut zu mischen und lassen Sie es dann für 10 min bei Raumtemperatur stehen. Schütteln Sie die Röhre gelegentlich vorsichtig, um die Bindung von Magnetischen Perlen und DNA zu maximieren.
- Legen Sie das Rohr/die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
- Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr/der Platte mit einer Pipette. Versuchen Sie beim Entfernen des Überstands, die magnetischen Perlen, die die DNA halten, nicht zu berühren oder zu stören.
- Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 325 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
- Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
- Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 1 zu jeder Vertiefung hinzu.
- Gründlich durch Pipettieren mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
- Bewegen Sie das Röhrchen/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Probe 250 μL Waschpuffer 2 hinzu.
- Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
- Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie 250 μL Waschpuffer 2 zu jeder Vertiefung hinzu.
- Gründlich mischen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.6.
- Bewegen Sie das Rohr/die Platte vom magnetischen Perlenabscheider weg und fügen Sie jeder Vertiefung 100 μL Elutionspuffer hinzu.
- Gründlich mischen und 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Bewegen Sie das Rohr/ die Platte auf den magnetischen Perlenabscheider und warten Sie, bis die Lösung klar ist.
- Pipetetten Sie den Überstand in eine neue saubere 0,5-Mikrozentrifugenröhre oder Mikroplatten-Vertiefung.
- Lagern Sie DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) oder -80 °C. Wenn eine Mikroplatte verwendet wird, bedecken Sie sie mit Parafilm.
- Bestimmen Sie die DNA-Ausbeute mit einer geeigneten Methode.
HINWEIS: In dieser Studie wurden DNA-Fluorometer-Messwerte und Absorption bei 260/280 nm verwendet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die durchschnittliche DNA-Ausbeute pro einzelnem Mückenkopf/Thoraxgewebe betrug 4,121 ng/μL (N = 92, Standardabweichung 3,513), gemessen mit einem Fluorometer, wenn es mit 100 μL Elutionspuffer eluiert wurde. Dies ist ausreichend für die 10-30 ng genomischen DNA-Eingangsanforderungen, die für den Aufbau der gesamten Genombibliothek erforderlich sind1,7. Die Menge an DNA kann zwischen 0,3-29,7 ng / μL variieren, abhängig von der Körpergröße der Mücke und den Konservierungsbedingungen. Ein Teil der hohen Variabilität ist auf die Eigenschaft der in der Studie verwendeten magnetischen Perlen zurückzuführen. Verschiedene Marken magnetischer Perlen können konsistentere Konzentrationen erzeugen, wie im vorherigen Bericht1angegeben. Es sollte auch beachtet werden, dass sich verschiedene Mückenarten in der Größe unterscheiden und dass die DNA-Ausbeute von diesen individuellen und Artengrößenbereichen abhängt. Liegt die DNA-Konzentration unter den typischen Bereichen, kann man die Inkubationszeit in der Proteinase-K-Reaktion anpassen (Schritt 2.7), diese Verlängerung sollte jedoch nicht länger als 16 h betragen. Darüber hinaus kann der Wechsel der Proteinase-K- und/oder Lysepuffermarken erhebliche Auswirkungen auf dieDNA-Ausbeutehaben 1 .
Der typische Mikrovolumenfluorometerwert der endgültigen DNA im Elutionspuffer mit 0,5 mM EDTA ist in Abbildung 1 dargestellt. Das durchschnittliche Absorptionsverhältnis für 260/280 nm betrug 2,3 (Standardabweichung = 0,071). Die Daten stimmten mit den Proben überein, die in den vorherigen Studien für die Sequenzierung des gesamten Genoms verwendetwurden3,4.
Typische Reagenzien- und Verbrauchsmaterialkosten für die Extraktion betragen etwa 9,50 USD / Probe. Diese Kostenschätzungen umfassen Reagenzien, die in der Materialtabelleaufgeführt sind, und andere Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen, Schläuche und Handschuhe, die für die Extraktion benötigt werden. Die Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien entsprechen jeder typischen extraktionsmethode auf Magnetperlenbasis (Tabelle 1). Die Kosten können je nach Den für ein bestimmtes Produkt verfügbaren Mengenrabatten etwas variieren. Der größte Kostenvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass das automatisierte DNA-Extraktionsinstrument nicht erforderlich ist.
Abbildung 1:Fluorometerausgang. Typischer DNA-Fluorometerausgang von Mücken-DNA, die im Elutionspuffer mit 0,5 mM EDTA eluiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Kostenanalyse für verschiedene Extraktionsmethoden. Die Tabelle listet die Kosten und die Anzahl der an einem Arbeitstag verarbeiteten Proben für verschiedene Extraktionsmethoden auf. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll kann für andere Insektenarten angepasst werden. Die ursprüngliche Version des in Nieman et al.1 eingeführten Protokolls wurde an mehreren Arten getestet, darunter Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta und Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll sowohl für diese als auch für andere Arthropoden funktioniert.
Idealerweise sollten die Proben vor der DNA-Extraktion in 70%-80% Ethanol bei 4 °C gelagert werden. Typischerweise wird 80% Ethanol für die Lagerung von Mückenproben in Afrika verwendet. Hochtemperaturbedingungen könnten die Verdampfung von Ethanol beschleunigen und den Ethanolgehalt niedriger als beabsichtigt (70%) machen. Proben, die in 100% Ethanol, denaturiertem Alkohol, 75% -90% Isopropanol oder Reibalkohol gelagert wurden, haben ebenfalls zu einer erfolgreichen Sequenzierung des gesamten Genoms mit dem Nieman et al.1-Protokoll geführt, und es wird erwartet, dass dieses Protokoll ebenso gut funktionieren würde. Das hier beschriebene DNA-Extraktionsprotokoll wurde auch an Proben ausprobiert, die trocken in Kieselsäure gelagert und bei -20 °C eingefroren wurden. Es gab jedoch eine höhere (15%-30%) Ausfallwahrscheinlichkeit, wenn sie für >6-12 Monate gelagert wurde, was darauf hindeutet, dass dies weniger als ideale Lagerbedingungen waren.
Da die DNA-Extraktion ohne physische Probenstörung eine höhere Ausfallwahrscheinlichkeit hat (33%)1, beinhaltet dieses Protokoll eine manuelle physikalische Störungstechnik (Schritt 2.5). Die Probenunterbrechung kann auch mit Stahlperlen auf einem Gewebelyseinstrument erreicht werden1.
Die Reagenzien- und Verbrauchsmaterialkosten für die DNA-Extraktion mit diesem Protokoll sind vergleichbar mit anderen verfügbaren Extraktionsmethoden (Tabelle 1). Das hier beschriebene Protokoll erfordert jedoch kein automatisiertes DNA-Extraktionsinstrument. Aufgrund der manuellen Arbeit, die mit der Verarbeitung der DNA-Extraktion verbunden ist, kann eine Person typischerweise 12-16 Proben verarbeiten und mit der DNA-Quantifizierung an einem Tag abschließen. Dies ist deutlich weniger als das, was automatisierte DNA-Extraktionseinrichtungen pro Tag verarbeiten können. Daher sollte bei der Auswahl eines Protokolls die Probenverarbeitungskapazität berücksichtigt werden. Die niedrigere Kostenschwelle, die dieses Protokoll bietet, sollte es jedoch vielen Ressourcen begrenzten Laboren und Studien ermöglichen, die Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zu nutzen.
Sowohl im Nieman et al.1 als auch in diesem Protokoll kann der Elutionspuffer je nach nach nachgeschalteter Analyse durch den typischen TE-Puffer, 10 mM Tris-Cl, oder Wasser ersetzt werden. Ein Elutionspuffer, der etwas EDTA enthält, kann die Enzymeffizienz beeinflussen. Typische enzymatische Scherungs-basierte gDNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokolle umfassen Konditionierungslösungen oder Enhancer, die hinzugefügt werden, um die Enzymhemmung durch EDTA zu kompensieren. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass EDTA die Absorption bei 230 nm Wellenlänge11verändern kann. Beispielsweise würden höhere Konzentrationen von EDTA einen höheren Absorptionswert zwischen 220 und 240 nm Wellenlänge erzeugen als in Abbildung 1 gezeigt (Daten nicht gezeigt).
Dieses Protokoll kann leicht an Labore mit minimalen molekularbiologischen Werkzeugen angepasst werden. Das hier beschriebene Protokoll versucht, die mit der Genomextraktion verbundenen Kostenschwellen zu senken und dadurch die Anwendung der Hochdurchsatzsequenzierung auf ressourcenbegrente Labore und Studien zu erhöhen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, das von den U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), cdc grant NU50CK000420-04-04,04, dem USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory Fellowship an Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II Grant (AWD05009_MOD0030) und Florida Department of Health (Contract CODQJ) finanziert wird. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in diesem Artikel sind die des Autors /der Autoren und geben nicht unbedingt die Ansichten des U.S. Fish and Wildlife Service an.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
