Summary
Beskrivs här är ett DNA-extraktionsprotokoll med magnetiska pärlor för att producera högkvalitativa DNA-extraktioner från myggor. Dessa extraktioner är lämpliga för en nedströms nästa generations sekvenseringsmetod.
Abstract
Ett nyligen publicerat DNA-extraktionsprotokoll med magnetiska pärlor och ett automatiserat DNA-extraktionsinstrument föreslog att det är möjligt att extrahera högkvalitativt och mängd-DNA från en välbevarad individuell mygga som är tillräcklig för nedströms hel genomsekvensering. Att förlita sig på ett dyrt automatiserat DNA-extraktionsinstrument kan dock vara oöverkomligt för många laboratorier. Här ger studien ett budgetvänligt magnetiskt pärlbaserat DNA-extraktionsprotokoll, som är lämpligt för låg till medelhög genomströmning. Protokollet som beskrivs här testades framgångsrikt med hjälp av enskilda Aedes aegypti myggprover. De minskade kostnaderna i samband med DNA-extraktion av hög kvalitet kommer att öka tillämpningen av hög genomströmningssekvensering på resursbegränsade laboratorier och studier.
Introduction
Den senaste utvecklingen av ett förbättratDNA-extraktionsprotokoll 1 har möjlig tillåtit många nedströmsstudier som involverar helagenomsekvensering 2,3,4,5,6. Detta magnetiska pärlbaserade DNA-extraktionsprotokoll ger tillförlitlig DNA-avkastning från enskilda myggprover, vilket i sin tur minskar kostnaden och tiden i samband med att förvärva ett tillräckligt antal prover från fältsamlingar.
Den senaste tidens framsteg inom befolknings- och landskapsgenomik korreleras direkt med minskande kostnader för hela genomsekvensering. Även om det tidigareDNA-extraktionsprotokollet 1 ökar effektiviteten i samband med sekvensering med hög genomströmning, kan mindre laboratorier /studier utan medel välja bort att använda dessa nya kraftfulla landskaps- och befolkningsgenomikverktyg på grund av kostnader för att implementera protokollet (t.ex. kostnader för specialiserade instrument).
Här presenteras ett modifierat DNA-extraktionsprotokoll som använder ett liknande magnetiskt pärlextraktionssteg som Neiman et al.1 för att erhålla DNA med hög renhet men inte förlitar sig på högkostnadsinstrument för vävnadslys och DNA-extraktion. Detta protokoll är lämpligt för experiment som > 10 ng högkvalitativt DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmän provtagning och preparat före DNA-extraktion
- Hydrera provet i 100 μL PCR-vatten i 1 timme (eller över natten) vid 4 °C om provet har lagrats i >70% alkohol för att mjuka upp vävnaden.
2. Avbrott i urvalet
- Ställ in en inkubator eller ett skakvärmeblock vid 56 °C.
- Gör proteinas K (PK) buffert/enzymblandning. 2 μL Proteinas K (100 mg/ml) och 98 μL Proteinase K-buffert (totalt 100 μL) krävs för varje enskild myggextraktion. För att förbereda en huvudblandning för flera exemplar, öka den totala mängden (kombinerad för alla enskilda exemplar) med ~ 15% för att säkerställa tillgången till tillräcklig volym.
- Om proverna hydratiserades före extraktionen, kassera vatten från varje provrör.
- I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller myggvävnad, tillsätt 100 μL PK-buffert/enzymblandning.
- Homogenisera vävnaden med hjälp av mikrocentrifugrörspråck.
- Centrifugera proverna i 1 min vid 9 600 x g vid rumstemperatur.
- Inkubera provet i 2-3 timmar vid 56 °C.
- Under inkubationen bereder du de andra reagenserna med hjälp av DNA-extraktionssteget (steg 3).
3. DNA-extraktion
- Gör en magnetisk pärlmästareblandning. För varje prov, blanda 100 μL lysbuffert, 100 μL Isopropanol och 15 μL magnetiska pärlor (totalt 215 μL). För att förbereda en huvudblandning för flera reaktioner, öka den totala mängden (kombinerad för alla enskilda exemplar) med ~ 20% för att säkerställa tillgången till tillräcklig volym.
- Efter inkubationstiden (steg 2.7) överför du varje lysat till ett rent mikrocentrifugrör eller en mikroplatta med pipett.
- Tillsätt 100 μL lysat och 215 μL av magnetpärlorna till varje prov.
- Använd en pipett för att blanda den väl i 10-20 s och låt den sedan stå i 10 minuter vid rumstemperatur. Skaka försiktigt röret ibland för att maximera bindningen av magnetiska pärlor och DNA.
- Placera röret/plattan på magnetplåtavskiljaren och vänta tills lösningen är klar.
- Kassera vätskan från röret/plattan med pipett. När du tar bort supernatanten, försök att inte röra eller störa de magnetiska pärlor som håller DNA.
- Flytta röret/plattan bort från magnetpärlavskiljaren och tillsätt 325 μL tvättbuffert 1 till varje brunn.
- Blanda noggrant genom pipetting och inkubera i 1 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.5-3.6.
- Flytta röret/plattan bort från magnetpärlaavskiljaren och tillsätt 250 μL tvättbuffert 1 till varje brunn.
- Blanda noggrant genom pipetting och inkubera i 1 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.5-3.6.
- Flytta röret/plattan bort från magnetpärlavskiljaren och tillsätt 250 μL tvättbuffert 2 till varje prov.
- Blanda noggrant och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.5-3.6.
- Flytta röret/plattan bort från magnetpärlavskiljaren och tillsätt 250 μL tvättbuffert 2 till varje brunn.
- Blanda noggrant och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.5-3.6.
- Flytta röret/plattan bort från magnetpärlavskiljaren och tillsätt 100 μL elueringsbuffert till varje brunn.
- Blanda noggrant och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Flytta röret/plattan över på magnetplåtavskiljaren och vänta tills lösningen är klar.
- Pipetten supernaten till ett nytt rent 0,5 mikrocentrifugrör eller mikroplatta väl.
- Förvara DNA-prover vid 4 °C (upp till 1 vecka) eller -80 °C. Om en mikroplatta används, täck den med parafilm.
- Bestäm DNA-utbytena med vilken metod som helst.
OBS: I denna studie användes DNA-fluorometeravläsning och absorbans vid 260/280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det genomsnittliga DNA-utbytet per enskilt mygghuvud/bröstkorgsvävnad var 4,121 ng/μL (N = 92, standardavvikelse 3,513) mätt med hjälp av en fluorometer när den eluterades med 100 μL elueringsbuffert. Detta är tillräckligt för de 10-30 ng genomiska DNA-indatakrav som krävs för hela genombibliotekskonstruktion1,7. Mängden DNA kan variera mellan 0,3-29,7 ng/μL beroende på myggkroppens storlek och bevarandeförhållanden. En del av den höga variationen beror på egenskapen hos magnetiska pärlor som används i studien. Olika märken av magnetiska pärlor kan ge mer konsekventa koncentrationer, vilket anges i föregående rapport1. Det bör också noteras att olika myggarter skiljer sig åt i storlek och att DNA-utbytet är beroende av dessa individuella och artstorleksintervall. Om DNA-koncentrationen ligger under de typiska intervallen kan man justera inkubationstiden i proteinas K-reaktionen (steg 2.7), men denna förlängning bör inte vara längre än 16 timmar. Dessutom kan byte av proteinas K och/eller lysbuffertmärken ha betydande inverkan på DNA-utbytet1.
Den typiska mikrovolumfluorometeravläsningen av det slutliga DNA i elueringsbuffert med 0,5 mM EDTA visas i figur 1. Det genomsnittliga absorbansförhållandet för 260/280 nm var 2,3 (standardavvikelse = 0,071). Uppgifterna överensstämde med de prover som använts i de tidigare studierna för helgenomsekvensering3,4.
Typisk reagens och förbrukningskostnad för extraktion är cirka $ 9.50 / prov. Dessa kostnadsberäkningar inkluderar reagenser som anges i materialförteckningenoch andra förbrukningsvaror som pipettspetsar, rör och handskar som behövs för extraktion. Reagens- och förbrukningskostnaden motsvarar alla typiska magnetiska pärlor(tabell 1). Kostnaden kan variera något beroende på bulkköpsrabatter som är tillgängliga för en viss produkt. Den största kostnadsnyttan med detta protokoll kommer från att inte kräva det automatiserade DNA-extraktionsinstrumentet.
Figur 1:Fluorometerutgång. Typisk DNA-fluorometerproduktion av mygg-DNA eluterad i elueringsbuffert med 0,5 mM EDTA. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 1: Kostnadsanalys för olika extraktionsmetoder. Tabellen visar kostnader och antalet prover som bearbetas på en arbetsdag för olika extraktionsmetoder. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här kan anpassas för andra insektsarter. Den ursprungliga versionen av protokollet som infördes i Nieman et al.1 har testats på flera arter, inklusive Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta och Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Det förväntas att detta protokoll kommer att fungera för dessa såväl som andra leddjur.
Helst bör prover lagras i 70-80% etanol vid 4 °C före DNA-extraktion. Vanligtvis används 80% etanol för lagring av myggprover i Afrika. Högtemperaturförhållanden kan påskynda avdunstning av etanol och göra etanolhalten lägre än vad som är avsett (70%). Prover lagrade i 100% etanol, denaturerad alkohol, 75%-90% isopropanol eller gnidning alkohol har också resulterat i framgångsrik hel genomsekvensering med Nieman et al.1 protokollet, och det förväntas att detta protokoll skulle fungera lika bra. DNA-extraktionsprotokollet som beskrivs här har också provats på prover som lagrats torra i kiseldioxid och frysts vid -20 °C. Det fanns dock en högre (15%-30%) risk för fel när de lagrades i >6-12 månader, vilket tyder på att dessa var mindre än idealiska lagringsförhållanden.
Eftersom DNA-extraktion utan fysisk provstörning har större risk för fel (33%)1, innehåller detta protokoll en manuell fysisk störningsteknik (steg 2.5). Provavbrott kan också uppnås med hjälp av stålpärlor på ett vävnadslysinstrument1.
Reagenser och förbrukningsbara kostnader för DNA-extraktion med detta protokoll är jämförbara med andra tillgängliga extraktionsmetoder (tabell 1). Det protokoll som beskrivs här kräver dock inte ett automatiserat DNA-extraktionsinstrument. På grund av manuellt arbete som är involverat i bearbetning av DNA-extraktion kan en person vanligtvis bearbeta 12-16 prover och avsluta med DNA-kvantifiering på en dag. Detta är betydligt mindre än vad automatiserad DNA-extraktionsinstallation kan bearbeta per dag. Vid valet av protokoll bör därför provtagningskapaciteten beaktas. Den lägre kostnadströskeln som detta protokoll erbjuder bör dock göra det möjligt för många resursbegränsade labb och studier att utnyttja sekvenseringsteknik med hög genomströmning.
I både Nieman et al.1 och detta protokoll kan elueringsbufferten ersättas med den typiska TE-bufferten, 10 mM Tris-Cl, eller vatten beroende på nedströmsanalysen. En elueringsbuffert som innehåller vissa EDTA kan påverka enzymeffektiviteten. Typiska enzymatiska shearing-baserade gDNA bibliotek förberedelse protokoll inkluderar konditionering lösningar eller förstärkare läggs till för att kompensera för enzym hämning av EDTA. Det bör också anses att EDTA kan ändra absorbansen vid 230 nm våglängd11. Högre koncentrationer av EDTA skulle till exempel skapa ett högre absorbansvärde mellan 220–240 nm våglängd än vad som visas i figur 1 (data visas inte).
Detta protokoll kan enkelt anpassas till laboratorier med minimala molekylärbiologiska verktyg. Protokollet som beskrivs här försöker minska kostnadströsklarna i samband med genomutvinning och därmed öka tillämpningen av hög genomströmningssekvensering på resursbegränsade laboratorier och studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar finansieringsstöd från Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finansierat av U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC beviljar NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch Project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) och Florida Department of Health (Contract CODQJ). Resultaten och slutsatserna i denna artikel är författarens och representerar inte nödvändigtvis synpunkterna från U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
