Summary
여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.
Abstract
마그네틱 비즈와 자동화된 DNA 추출 기기를 사용하여 최근에 발표된 DNA 추출 프로토콜은 다운스트림 전체 게놈 시퀀싱에 충분한 잘 보존된 개별 모기로부터 고품질 및 수량 DNA를 추출할 수 있음을 시사했습니다. 그러나 고가의 자동화 된 DNA 추출 기기에 대한 의존은 많은 실험실에서 금지 될 수 있습니다. 여기서, 연구 결과는 저중간 처리량에 적합한 예산 친화적인 자기 비드 기지를 둔 DNA 추출 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 Aedes aegypti 모기 견본을 사용하여 성공적으로 시험되었습니다. 고품질 DNA 추출과 관련된 비용 절감은 자원 제한된 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시킬 것이다.
Introduction
최근 개선된 DNA 추출 프로토콜1의 개발로 전체 게놈 시퀀싱2,3,4,5,6을포함하는 많은 고충격 다운스트림 연구를허용하고있다. 이 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 개별 모기 샘플에서 신뢰할 수있는 DNA 수율을 제공하므로 필드 수집에서 충분한 수의 샘플을 획득하는 데 드는 비용과 시간을 줄입니다.
인구와 조경 유전체학의 최근 발전은 전체 게놈 시퀀싱의 비용 감소와 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이전 DNA 추출 프로토콜1은 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 효율성을 증가하지만, 자금이없는 작은 실험실 / 연구는 프로토콜 (예를 들어, 특수 기기의 비용)을 구현하는 비용으로 인해 이러한 새로운 강력한 풍경 및 인구 유전체 학 도구를 사용하지 않을 수 있습니다.
여기서, 수정된 DNA 추출 프로토콜은 Neiman외. 1과 유사한 자기 비드 추출 단계를 사용하여 고순도 DNA를 얻지만 조직 용해 및 DNA 추출을 위한 고비용 기기에 의존하지 않는다는 것을 제시한다. 이 프로토콜은 고품질 DNA의 >10 ng를 요구하는 실험에 적합합니다.
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Protocol
1. DNA 추출 전에 일반 샘플 저장 및 준비
- 샘플을 조직을 부드럽게 하기 위해 >70% 알코올에 저장된 경우 4°C에서 1시간(또는 하룻밤)에 100 μL PCR 급 수분으로 샘플을 수화한다.
2. 샘플 중단
- 인큐베이터 또는 흔들림 열 블록을 56°C에서 설정합니다.
- 단백질 효소 K (PK) 버퍼/ 효소 믹스를 만듭니다. 단백질제 K(100 mg/mL)의 2μL과 98μL의 단백질제 K 버퍼(총 100μL)는 각 개별 모기 추출에 필요합니다. 여러 시편에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 시편에 대한 결합)을 ~15% 증가시합니다.
- 추출 하기 전에 샘플 수화 된 경우, 각 샘플 튜브에서 물을 폐기.
- 모기 조직을 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 PK 완충 /효소 혼합물의 100 μL을 추가하십시오.
- 마이크로 원심 분리기 튜브 유봉을 사용하여 조직을 균질화합니다.
- 실온에서 9,600 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
- 56°C에서 2-3h의 시료를 배양한다.
- 인큐베이션 하는 동안, DNA 추출 단계(단계 3)를 사용하여 다른 시약을 준비한다.
3. DNA 추출
- 마그네틱 비드 마스터 믹스를 만드세요. 각 샘플에 대해, 용해 버퍼 100 μL, 이소프로판올 100 μL, 자기 비드 15 μL(총 215 μL)를 혼합합니다. 여러 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 표본에 대한 결합)을 ~20% 증가시합니다.
- 인큐베이션 시간(2.7단계)이 끝나면 각 리세이트를 깨끗한 미세원심분리기 튜브 또는 파이펫을 사용하여 마이크로플레이트로 옮김한다.
- 각 샘플에 마그네틱 비드 마스터 믹스의 100 μL lysate 및 215 μL을 추가합니다.
- 파이펫을 사용하여 10-20 s에 잘 섞은 다음 실온에서 10 분 동안 방치하십시오. 간으로 튜브를 부드럽게 흔들어 자기 구슬과 DNA의 결합을 최대화합니다.
- 자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 놓고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.
- 파이펫을 사용하여 튜브 / 접시에서 액체를 버리십시오. 상체를 제거할 때 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 만지거나 방해하지 않도록 하십시오.
- 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 325 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.
- 피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
- 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
- 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.
- 피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.
- 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
- 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 샘플에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.
- 철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
- 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
- 튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.
- 철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.
- 3.5-3.6 단계를 반복합니다.
- 자기 비드 분리기에서 튜브 /플레이트를 이동하고 각 우물에 용출 버퍼 100 μL을 추가합니다.
- 철저히 섞어서 실온에서 2분 동안 배양하십시오.
- 자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 이동하고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.
- 새로운 깨끗한 0.5 마이크로 센심 분리기 튜브 또는 마이크로 플레이트에 피펫.
- DNA 샘플을 4°C(최대 1주) 또는 -80°C로 저장합니다. 마이크로 플레이트를 사용하는 경우 파라필름으로 덮습니다.
- 적절한 방법을 사용하여 DNA 수율을 결정합니다.
참고: 이 연구에서는 260/280 nm에서 DNA 불소계 판독 및 흡광도를 활용했습니다.
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Representative Results
개별 모기 헤드/흉부 조직당 평균 DNA 수율은 용출 버퍼 100μL을 사용하여 용출할 때 형광계를 사용하여 측정된 4.121 ng/μL(N= 92, 표준 편차 3.513)이었다. 이는 전체 게놈 라이브러리 시공1,7에필요한 10-30 ng 게놈 DNA 입력 요구 사항에 충분합니다. DNA의 양은 모기 체 크기와 보존 조건에 따라 0.3-29.7 ng/μL 사이에서 다를 수 있습니다. 높은 가변성 중 일부는 연구에 사용되는 자기 구슬의 특성 때문입니다. 자기 구슬의 다른 브랜드는 이전 보고서1에표시된 바와 같이, 더 일관된 농도를 생성 할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 모기 종 크기가 다르고 DNA 수율은 그 개별 및 종 크기 범위에 의존한다는 것을 주의해야 합니다. DNA 농도가 일반적인 범위 이하인 경우, 단백질Ae K 반응(step 2.7)에서 잠복기를 조정할 수 있지만, 이 연장은 더 이상 16h 이상이어야 한다. 더욱이, 단백질제 K 및/또는 리시스 완충제 브랜드를 전환하면 DNA 수율1에상당한 영향을 미칠 수 있다.
0.5 mM EDTA를 가진 용출 완충에서 최종 DNA의 전형적인 마이크로볼륨 불소계 판독은 도 1에도시된다. 260/280 nm의 평균 흡광도 비율은 2.3(표준 편차 = 0.071)이었다. 데이터는 전체 게놈 시퀀싱3,4에대한 이전 연구에서 사용된 샘플로부터 일관되게 하였다.
추출에 대한 일반적인 시약 및 소모품 비용은 약 $9.50/샘플입니다. 이러한 비용 추정에는 재료 표에나열된 시약및 추출에 필요한 파이펫 팁, 튜브 및 장갑과 같은 기타 소모품이 포함됩니다. 시약 및 소모성 비용은 일반적인 자기 비드 기반 추출방법(표 1)과동일합니다. 비용은 주어진 제품에 사용할 수있는 대량 구매 할인에 따라 다소 다를 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 비용 이점은 자동화 된 DNA 추출 기기를 필요로하지 에서 비롯됩니다.
그림 1: 불소계 출력. 0.5 mM EDTA를 가진 용출 완충에서 용출 완충에서 용출된 모기 DNA의 전형적인 DNA 불소계 출력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 다른 추출 방법에 대한 비용 분석. 표에는 다른 추출 방법에 대해 하루 동안 처리된 샘플의 비용과 수가 나열됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 다른 곤충 종에 맞게 조정할 수 있다. Nieman 외1에 도입 된 프로토콜의원래 버전은 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, 아노펠레스 아라비엔시스, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tutaabluta, 및 Kepereria,90. 이 프로토콜은 이러한 프로토콜뿐만 아니라 다른 절지동물을 위해 작동 할 것으로 예상된다.
이상적으로, 견본은 DNA 추출의 앞에 4°C에서 70%-80% 에탄올에 저장되어야 합니다. 전형적으로, 80% 에탄올은 아프리카에서 모기 샘플을 저장하는 데 사용됩니다. 고온 조건은 에탄올의 증발을 가속화하고 에탄올 함량이 의도한 내용(70%)보다 낮게 만들 수 있습니다. 100% 에탄올, 변성 알코올, 75%-90% 이소프로판올 또는 마찰 알코올에 저장된 샘플은 Nieman 외1 프로토콜을 사용하여 성공적인 전체 게놈 시퀀싱을 초래하고 있으며, 이 프로토콜이 동등하게 잘 수행될 것으로 예상된다. 여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 실리카에 건조하고 -20°C에서 냉동된 샘플에서도 시험되었다. 그러나 >6-12개월 동안 보관할 때 실패할 확률이 15%-30%로 높았으며, 이는 이상적인 저장 조건보다 적다는 것을 시사합니다.
물리적 시료 중단 없이 DNA 추출이 실패(33%)1의확률이 높기 때문에, 이 프로토콜은 수동 물리적 중단 기술(단계 2.5)을 통합한다. 또한 조직 용해 기기1에강철 구슬을 사용하여 샘플 중단을 달성 할 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 DNA 추출을 위한 시약 및 소모성 비용은 사용 가능한 다른 추출방법(표 1)과비교된다. 그러나, 여기서 설명된 프로토콜은 자동화된 DNA 추출 기기를 필요로 하지 않는다. DNA 추출 처리에 관여하는 수동 노동때문에, 한 사람은 일반적으로 12-16 의 샘플을 처리하고 하루에 DNA 정량화로 끝낼 수 있습니다. 이것은 자동화된 DNA 추출 설치가 하루에 처리할 수 있는 것보다 훨씬 적습니다. 따라서 프로토콜을 선택할 때 샘플 처리 용량을 고려해야 합니다. 그러나 이 프로토콜이 제공하는 낮은 비용 임계값은 많은 리소스 제한된 실험실및 연구를 통해 고처리량 시퀀싱 기술을 활용할 수 있어야 합니다.
Nieman외. 1 및 이 프로토콜 모두에서 용출 버퍼는 다운스트림 분석에 따라 일반적인 TE 버퍼, 10m Tris-Cl 또는 물로 대체될 수 있다. 일부 EDTA를 함유하는 용출 완충제는 효소 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 일반적인 효소 전단 기반 gDNA 라이브러리 준비 프로토콜에는 EDTA에 의한 효소 억제를 보완하기 위해 추가된 컨디셔닝 솔루션 또는 강화제가 포함됩니다. 또한 EDTA가 230 nm 파장11에서흡광도를 변경할 수 있음을 고려해야합니다. 예를 들어, EDTA의 높은 농도는 도 1에 표시된 것보다 220-240 nm 파장 사이의 더 높은 흡광도 값을 생성할 것이다(데이터는 도시되지 않음).
이 프로토콜은 최소한의 분자 생물학 도구를 사용하여 실험실에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 게놈 추출과 관련된 비용 임계값을 줄이고 자원 제한 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시키려합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 미국이 자금을 지원하는 벡터 매개 질병에 대한 우수의 태평양 남서부 지역 센터의 자금 지원을 인정합니다. 질병통제예방센터(협력계약 1U01CK0000516), CDC 보조금 NU50CK000420-04-04, USDA 국립식품농업연구소(해치 프로젝트 1025565), UF/IFAS 플로리다 메디컬 곤충학 연구소 펠로우십 Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC 단계 II 보조금(AWD05009_MOD0030), 플로리다 보건부(CoQ) 이 문서의 결과와 결론은 저자의 결과이며 반드시 미국 어류 및 야생 동물 서비스의 견해를 나타내지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
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