Summary
Qui descritto è un protocollo di estrazione del DNA che utilizza perline magnetiche per produrre estrazioni di DNA di alta qualità dalle zanzare. Queste estrazioni sono adatte per un approccio di sequenziamento di nuova generazione a valle.
Abstract
Un protocollo di estrazione del DNA recentemente pubblicato che utilizza perline magnetiche e uno strumento automatizzato di estrazione del DNA hanno suggerito che è possibile estrarre DNA di alta qualità e quantità da una zanzara individuale ben conservata sufficiente per il sequenziamento dell'intero genoma a valle. Tuttavia, la dipendenza da un costoso strumento automatizzato di estrazione del DNA può essere proibitiva per molti laboratori. Qui, lo studio fornisce un protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche budget-friendly, adatto per una produttività da bassa a media. Il protocollo qui descritto è stato testato con successo utilizzando singoli campioni di zanzare Aedes aegypti. La riduzione dei costi associati all'estrazione del DNA di alta qualità aumenterà l'applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.
Introduction
Il recente sviluppo di un protocollo di estrazione del DNAmigliorato 1 ha permesso molti studi a valle ad alto impatto che coinvolgono il sequenziamento dell'interogenoma 2,3,4,5,6. Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche fornisce una resa affidabile del DNA da singoli campioni di zanzara, che a sua volta riduce il costo e il tempo associati all'acquisizione di un numero sufficiente di campioni dalle raccolte sul campo.
I recenti progressi nella genomica della popolazione e del paesaggio sono direttamente correlati con la diminuzione dei costi del sequenziamento dell'intero genoma. Sebbene il precedente protocollo di estrazione del DNA1 aumenti l'efficienza associata al sequenziamento ad alta produttività, laboratori / studi più piccoli senza i fondi possono scegliere di non utilizzare questi nuovi potenti strumenti genomici per il paesaggio e la popolazione a causa dei costi di implementazione del protocollo (ad esempio, i costi degli strumenti specializzati).
Qui viene presentato un protocollo di estrazione del DNA modificato che utilizza una fase di estrazione del tallone magnetico simile a Quella di Neiman etal. Questo protocollo è adatto per esperimenti che richiedono >10 ng di DNA di alta qualità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Conservazione generale del campione e preparati prima dell'estrazione del DNA
- Idratare il campione in acqua pcr da 100 μL per 1 h (o durante la notte) a 4 °C se il campione è stato conservato in alcool >70% per ammorbidire il tessuto.
2. Interruzione del campione
- Impostare un incubatore o un blocco termico a tremante a 56 °C.
- Fare proteinasi K (PK) tampone/enzima miscela. Per ogni singola estrazione di zanzare sono necessari 2 μL di Proteinasi K (100 mg/mL) e 98 μL di Proteinasi K Buffer (totale 100 μL). Per preparare un mix master per più campioni, aumentare la quantità totale (combinata per tutti i singoli campioni) di ~ 15% per garantire la disponibilità di un volume adeguato.
- Se i campioni sono stati idratati prima dell'estrazione, scartare l'acqua da ciascun tubo campione.
- In un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml contenente tessuto di zanzara, aggiungere 100 μL di miscela tampone/enzima PK.
- Omogeneizzare il tessuto utilizzando il pestello del tubo di microcentrifugo.
- Centrifugare i campioni per 1 minuto a 9.600 x g a temperatura ambiente.
- Incubare il campione per 2-3 ore a 56 °C.
- Durante l'incubazione, preparare gli altri reagenti utilizzando la fase di estrazione del DNA (fase 3).
3. Estrazione del DNA
- Crea un mix magnetico di perline. Per ogni campione, mescolare 100 μL di tampone dilisi, 100 μL di isopropanolo e 15 μL di perline magnetiche (totale 215 μL). Per preparare un mix master per reazioni multiple, aumentare la quantità totale (combinata per tutti i singoli campioni) di ~ 20% per garantire la disponibilità di un volume adeguato.
- Dopo il tempo di incubazione (fase 2.7), trasferire ogni lisato in un tubo di microcentrifugo pulito o in un pozzo di micropiatta usando pipetta.
- Aggiungere 100 μL di lysate e 215 μL della miscela magnetica di perline master ad ogni campione.
- Utilizzare una pipetta per mescolarla bene per 10-20 s e quindi lasciarla riposare per 10 minuti a temperatura ambiente. Agitare delicatamente il tubo di tanto in tanto per massimizzare il legame di perline magnetiche e DNA.
- Posizionare il tubo/piastra sul separatore magnetico delle perline e attendere che la soluzione sia libera.
- Scartare il liquido dal tubo/piastra utilizzando pipetta. Quando si rimuove il supernatante, cercare di non toccare o disturbare le perline magnetiche che tengono il DNA.
- Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 325 μL di tampone di lavaggio 1 ad ogni pozzo.
- Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
- Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 1 ad ogni pozzo.
- Mescolare accuratamente con pipettazione e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
- Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 2 a ciascun campione.
- Mescolare accuratamente e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
- Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio 2 ad ogni pozzo.
- Mescolare accuratamente e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6.
- Spostare il tubo/piastra lontano dal separatore magnetico delle perline e aggiungere 100 μL di tampone di eluizione a ciascun pozzo.
- Mescolare accuratamente e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Spostare il tubo/piastra sul separatore di perline magnetiche e attendere che la soluzione sia libera.
- Pipettare il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo pulito da 0,5 o in un pozzo di micropiatta.
- Conservare campioni di DNA a 4 °C (fino a 1 settimana) o -80 °C. Se viene utilizzata una micropiatta, coprirla con un parafilm.
- Determinare le rese del DNA utilizzando qualsiasi metodo appropriato.
NOTA: In questo studio sono stati utilizzati la lettura e l'assorbanza del fluorometro del DNA a 260/280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La resa media del DNA per singolo tessuto testa di zanzara/torace era di 4,121 ng/μL (N = 92, deviazione standard 3.513) misurata utilizzando un fluorometro se eluita utilizzando 100 μL di tampone di eluizione. Questo è sufficiente per i requisiti di input di DNA genomico da 10-30 ng necessari per la costruzione dell'intera libreriadel genoma 1,7. La quantità di DNA può variare tra 0,3-29,7 ng / μL a seconda delle dimensioni del corpo della zanzara e delle condizioni di conservazione. Parte dell'elevata variabilità è dovuta alla caratteristica delle perline magnetiche utilizzate nello studio. Diverse marche di perline magnetiche possono produrre concentrazioni più consistenti, come indicato nella precedente relazione1. Va anche notato che diverse specie di zanzare differiscono per dimensioni e che la resa del DNA dipende da quelle gamme di dimensioni individuali e specie. Se la concentrazione di DNA è inferiore agli intervalli tipici, si può regolare il periodo di incubazione nella reazione della proteinasi K (fase 2.7), ma questa estensione non deve essere superiore a 16 h. Inoltre, la commutazione delle marche di tampone proteica K e/o lysis può avere un impatto significativo sulla resa del DNA1.
La tipica lettura del fluorometro a microvolume del DNA finale nel tampone di eluizione con EDTA da 0,5 mM è illustrata nella figura 1. Il rapporto medio di assorbanza per 260/280 nm era di 2,3 (deviazione standard = 0,071). I dati sono stati coerenti con i campioni utilizzati negli studi precedenti per il sequenziamento dell'interogenoma 3,4.
Il costo tipico del reagente e dei materiali di consumo per l'estrazione è di circa $ 9,50 / campione. Queste stime dei costi includono reagenti elencati nella tabella dei materialie altri materiali di consumo come punte di pipette, tubi e guanti necessari per l'estrazione. Il costo del reagente e del materiale di consumo è equivalente a qualsiasi metodo tipico di estrazione a base di perline magnetiche(tabella 1). Il costo può variare leggermente a seconda degli sconti di acquisto all'ingrosso disponibili per un determinato prodotto. Il principale vantaggio in termini di costi di questo protocollo deriva dal fatto che non è necessario lo strumento di estrazione automatica del DNA.
Figura 1: Uscita fluorometro. Tipica produzione di DNA fluorometro del DNA di zanzara eluito nel tampone di eluizione con EDTA da 0,5 mM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Analisi dei costi per i diversi metodi di estrazione. La tabella elenca i costi e il numero di campioni elaborati in un giorno lavorativo per diversi metodi di estrazione. Clicca qui per scaricare questa Tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo qui descritto può essere adattato per altre specie di insetti. La versione originale del protocollo introdotto in Nieman etal. An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta e Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Si prevede che questo protocollo funzionerà sia per questi che per altri artropodi.
Idealmente, i campioni devono essere conservati in etanolo al 70%-80% a 4 °C prima dell'estrazione del DNA. In genere, l'80% di etanolo viene utilizzato per conservare campioni di zanzara in Africa. Le condizioni ad alta temperatura potrebbero accelerare l'evaporazione dell'etanolo e rendere il contenuto di etanolo inferiore a quello previsto (70%). Campioni conservati in etanolo al 100%, alcol denaturato, isopropanolo al 75-90% o alcol sfregamento hanno anche portato al successo del sequenziamento dell'intero genoma utilizzando il protocollo Nieman etal. Il protocollo di estrazione del DNA qui descritto è stato provato anche su campioni conservati asciutti in silice e congelati a -20 °C. Tuttavia, c'era una maggiore probabilità (15%-30%) di fallimento se conservati per >6-12 mesi, suggerendo che queste erano condizioni di archiviazione non ideali.
Poiché l'estrazione del DNA senza interruzione fisica del campione ha maggiori possibilità di guasto (33%)1, questo protocollo incorpora una tecnica di interruzione fisica manuale (fase 2.5). L'interruzione del campione può essere ottenuta anche utilizzando perline d'acciaio su uno strumento di lisitissutale 1.
I reagenti e i costi di consumo per l'estrazione del DNA mediante questo protocollo sono paragonabili ad altri metodi di estrazione disponibili(tabella 1). Tuttavia, il protocollo qui descritto non richiede uno strumento di estrazione automatica del DNA. A causa del lavoro manuale coinvolto nell'elaborazione dell'estrazione del DNA, una persona può in genere elaborare 12-16 campioni e finire con la quantificazione del DNA in un giorno. Questo è significativamente inferiore a ciò che la configurazione automatizzata dell'estrazione del DNA può elaborare al giorno. Pertanto, quando si sceglie un protocollo, si dovrebbe prendere in considerazione la capacità di elaborazione del campione. Tuttavia, la soglia di costo inferiore offerta da questo protocollo dovrebbe consentire a molti laboratori e studi limitati alle risorse di sfruttare la tecnologia di sequenziamento ad alta produttività.
Sia nel Nieman etal. Un tampone di eluizione contenente un certo EDTA può influire sull'efficienza enzimatica. I tipici protocolli di preparazione della libreria gDNA a base di shearing enzimatico includono soluzioni di condizionamento o esaltatori aggiunti per compensare l'inibizione enzimatica da parte dell'EDTA. Va anche considerato che l'EDTA può modificare l'assorbanza a 230 nm di lunghezzad'onda 11. Ad esempio, concentrazioni più elevate di EDTA creerebbero un valore di assorbanza più elevato tra 220-240 nm di lunghezza d'onda rispetto a quello mostrato nella figura 1 (dati non mostrati).
Questo protocollo può essere facilmente adattato ai laboratori con strumenti minimi di biologia molecolare. Il protocollo qui descritto tenta di ridurre le soglie di costo associate all'estrazione del genoma e quindi aumentare l'applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno finanziario del Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finanziato dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (Accordo di cooperazione 1U01CK000516), sovvenzione CDC NU50CK000420-04-04, l'USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), la borsa di studio UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory a Tse-Yu Chen, la sovvenzione NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) e il Florida Department of Health (Contract CODQJ). I risultati e le conclusioni di questo articolo sono quelli dell'autore o degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del Servizio pesce e fauna selvatica degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
