Summary
Descrito aqui é um protocolo de extração de DNA usando contas magnéticas para produzir extrações de DNA de alta qualidade de mosquitos. Essas extrações são adequadas para uma abordagem de sequenciamento de próxima geração a jusante.
Abstract
Um protocolo de extração de DNA recentemente publicado usando contas magnéticas e um instrumento automatizado de extração de DNA sugeriu que é possível extrair DNA de alta qualidade e quantidade de um mosquito individual bem preservado suficiente para sequenciamento de genoma a jusante. No entanto, a dependência de um caro instrumento automatizado de extração de DNA pode ser proibitiva para muitos laboratórios. Aqui, o estudo fornece um protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas, que é adequado para baixo a médio rendimento. O protocolo descrito aqui foi testado com sucesso utilizando amostras individuais do mosquito Aedes aegypti. Os custos reduzidos associados à extração de DNA de alta qualidade aumentarão a aplicação de sequenciamento de alto rendimento a laboratórios e estudos limitados de recursos.
Introduction
O desenvolvimento recente de um protocolo de extração de DNAmelhorado 1 permitiu muitos estudos de alto impacto a jusante envolvendo sequenciamento de genoma inteiro2,3,4,5,6. Este protocolo de extração de DNA baseado em contas magnéticas fornece um rendimento de DNA confiável de amostras individuais de mosquitos, o que, por sua vez, reduz o custo e o tempo associados à aquisição de um número suficiente de amostras de coleções de campo.
Os recentes avanços na genômica populacional e paisagística estão diretamente correlacionados com a diminuição dos custos de sequenciamento de genomas inteiros. Embora o protocolo anterior de extração de DNA1 aumente a eficiência associada ao sequenciamento de alto rendimento, laboratórios/estudos menores sem os fundos podem optar por não usar essas novas poderosas ferramentas de genômica paisagística e populacional devido aos custos de implementação do protocolo (por exemplo, custos de instrumentos especializados).
Aqui, é apresentado um protocolo de extração de DNA modificado que usa um passo de extração de contas magnéticas semelhante ao Neiman et al.1 para obter DNA de alta pureza, mas não conta com instrumentos de alto custo para lise tecidual e extração de DNA. Este protocolo é adequado para experimentos que exigem >10 ng de DNA de alta qualidade.
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Protocol
1. Armazenamento geral de amostras e preparações antes da extração de DNA
- Hidrate a amostra em 100 μL de água de grau PCR por 1h (ou durante a noite) a 4 °C se a amostra tiver sido armazenada em >70% de álcool para suavizar o tecido.
2. Interrupção da amostra
- Coloque uma incubadora ou bloco de calor tremendo a 56 °C.
- Faça a mistura tampão/enzima proteinase K (PK). 2 μL de Proteinase K (100 mg/mL) e 98 μL de Proteinase K Buffer (total de 100 μL) é necessário para cada extração individual de mosquitos. Para preparar uma mistura mestre para várias amostras, aumente a quantidade total (combinada para todas as amostras individuais) em ~15% para garantir a disponibilidade de volume adequado.
- Se as amostras foram hidratadas antes da extração, descarte a água de cada tubo amostral.
- Em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo tecido de mosquito, adicione 100 μL de mistura de tampão/enzima PK.
- Homogeneize o tecido usando pilão de tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar as amostras por 1 min a 9.600 x g em temperatura ambiente.
- Incubar a amostra por 2-3 h a 56 °C.
- Durante a incubação, prepare os outros reagentes utilizando a etapa de extração de DNA (etapa 3).
3. Extração de DNA
- Faça uma mistura de mestre de contas magnéticas. Para cada amostra, misture 100 μL de tampão de lise, 100 μL de Isopropanol e 15 μL de contas magnéticas (total de 215 μL). Para preparar uma mistura mestre para múltiplas reações, aumente a quantidade total (combinada para todas as amostras individuais) em ~20% para garantir a disponibilidade de volume adequado.
- Após o tempo de incubação (etapa 2.7), transfira cada lise para um tubo de microcentrifuuge limpo ou um poço de microplacão usando pipeta.
- Adicione 100 μL de lysate e 215 μL da mistura mestre de contas magnéticas a cada amostra.
- Use uma pipeta para misturá-la bem por 10-20 s e depois deixe-a ficar por 10 minutos à temperatura ambiente. Agite suavemente o tubo ocasionalmente para maximizar a ligação de contas magnéticas e DNA.
- Coloque o tubo/placa no separador de contas magnéticas e espere até que a solução esteja clara.
- Descarte o líquido do tubo/placa usando pipeta. Ao remover o supernaspe, tente não tocar ou perturbar as contas magnéticas que seguram o DNA.
- Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 325 μL de tampão de lavagem 1 a cada poço.
- Misture bem por pipetar e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
- Repetir as etapas 3.5-3.6.
- Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 1 a cada poço.
- Misture bem por pipetar e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
- Repetir as etapas 3.5-3.6.
- Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 2 a cada amostra.
- Misture bem e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
- Repetir as etapas 3.5-3.6.
- Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 250 μL de tampão de lavagem 2 a cada poço.
- Misture bem e incubar por 1 min a temperatura ambiente.
- Repetir as etapas 3.5-3.6.
- Mova o tubo/placa para longe do separador de contas magnéticas e adicione 100 μL de tampão de eluição a cada poço.
- Misture bem e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente.
- Mova o tubo/placa sobre o separador de contas magnéticas e espere até que a solução esteja clara.
- Pipeta o supernante em um novo tubo de microcentrifuuagem limpo de 0,5 ou poço de microplacão.
- Armazene amostras de DNA a 4 °C (até 1 semana) ou -80 °C. Se uma microplacão estiver sendo usada, cubra-a com parafilme.
- Determine os rendimentos de DNA usando qualquer método apropriado.
NOTA: Neste estudo, foram utilizadas leitura e absorvância do fluorômetro de DNA a 260/280 nm.
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Representative Results
O rendimento médio de DNA por tecido de cabeça/tórax de mosquito individual foi de 4,121 ng/μL (N = 92, desvio padrão 3.513) medido utilizando um fluorômetro quando eluido usando 100 μL de tampão de elução. Isso é suficiente para os requisitos de entrada de DNA genômico de 10-30 ng necessários para toda a construção da biblioteca degenomas 1,7. A quantidade de DNA pode variar entre 0,3-29,7 ng/μL, dependendo do tamanho do corpo do mosquito e das condições de preservação. Parte da alta variabilidade deve-se à característica das contas magnéticas utilizadas no estudo. Diferentes marcas de contas magnéticas podem produzir concentrações mais consistentes, como indicado no relatório anterior1. Deve-se notar também que diferentes espécies de mosquitos diferem em tamanho e que o rendimento do DNA depende dessas faixas individuais e de tamanho das espécies. Se a concentração de DNA estiver abaixo das faixas típicas, pode-se ajustar o período de incubação na reação proteinase K (passo 2.7), mas essa extensão não deve ser superior a 16 h. Além disso, a troca das marcas de proteínas K e/ou tampão de lise pode ter impacto significativo no rendimento do DNA1.
A leitura típica do fluorômetro de microvolume do DNA final no buffer de eluição com 0,5 mM EDTA é mostrada na Figura 1. A razão média de absorvância para 260/280 nm foi de 2,3 (desvio padrão = 0,071). Os dados foram consistentes a partir das amostras utilizadas nos estudos anteriores para sequenciamento de genoma inteiro3,4.
O custo típico de reagente e consumível para extração é de cerca de US$ 9,50/amostra. Essas estimativas de custo incluem reagentes listados na Tabela de Materiaise outros consumíveis, como pontas de pipeta, tubos e luvas necessárias para extração. O reagente e o custo consumível são equivalentes a qualquer método típico de extração à base de contas magnéticas(Tabela 1). O custo pode variar um pouco dependendo dos descontos de compra em massa disponíveis para qualquer produto. O maior custo benefício deste protocolo vem da não exigência do instrumento automatizado de extração de DNA.
Figura 1: Saída do fluorômetro. Saída típica de fluorômetro de DNA de mosquitos elucidos em tampão de elução com 0,5 mM EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Análise de custos para diferentes métodos de extração. A tabela lista os custos e o número de amostras processadas em um dia útil para diferentes métodos de extração. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
O protocolo descrito aqui pode ser adaptado para outras espécies de insetos. A versão original do protocolo introduzido em Nieman et al.1 foi testada em várias espécies, incluindo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, e Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Espera-se que este protocolo funcione para estes, bem como outros artrópodes.
O ideal é que as amostras sejam armazenadas em 70%-80% de etanol a 4 °C antes da extração do DNA. Normalmente, 80% de etanol é usado para armazenar amostras de mosquitos na África. As condições de alta temperatura poderiam acelerar a evaporação do etanol e tornar o teor de etanol menor do que o pretendido (70%). Amostras armazenadas em 100% etanol, álcool desnaturado, 75%-90% isopropanol ou esfregar álcool também resultaram em sequenciamento de genoma inteiro bem sucedido usando o protocolo Nieman et al.1, e espera-se que este protocolo tenha um desempenho igualmente bom. O protocolo de extração de DNA descrito aqui também foi testado em amostras armazenadas secas em sílica e congeladas a -20 °C. No entanto, houve maior chance (15%-30%) de falha quando armazenados por >6-12 meses, sugerindo que estas eram condições de armazenamento inferiores às ideais.
Como a extração de DNA sem interrupção de amostra física tem maior chance de falha (33%)1,este protocolo incorpora uma técnica manual de interrupção física (etapa 2.5). A interrupção da amostra também pode ser alcançada usando contas de aço em um instrumento de lise tecidual1.
Os reagentes e o custo consumível para extração de DNA usando este protocolo são comparáveis com outros métodos de extração disponíveis(Tabela 1). No entanto, o protocolo descrito aqui não requer um instrumento automatizado de extração de DNA. Devido ao trabalho manual envolvido no processamento da extração de DNA, uma pessoa pode tipicamente processar 12-16 amostras e terminar com quantificação de DNA em um dia. Isso é significativamente menor do que o que a configuração automatizada de extração de DNA pode processar por dia. Assim, ao escolher um protocolo, a capacidade de processamento da amostra deve ser levada em conta. No entanto, o limite de custo mais baixo que este protocolo oferece deve permitir que muitos laboratórios e estudos limitados de recursos aproveitem a tecnologia de sequenciamento de alto rendimento.
Tanto no Nieman et al.1 quanto neste protocolo, o buffer de elução pode ser substituído pelo tampão de TE típico, 10 mM Tris-Cl ou água, dependendo da análise a jusante. Um tampão de eluição contendo algum EDTA pode afetar a eficiência da enzima. Protocolos típicos de preparação de biblioteca gDNA baseadas em tesouras enzimáticas incluem soluções de condicionamento ou aprimoramentos adicionados para compensar a inibição da enzima pelo EDTA. Deve-se considerar também que o EDTA pode alterar a absorvância em 230 nm comprimento de onda11. Por exemplo, concentrações mais altas de EDTA criariam um valor de absorção maior entre 220-240 nm comprimento de onda do que o mostrado na Figura 1 (dados não mostrados).
Este protocolo pode ser facilmente adaptado a laboratórios com ferramentas mínimas de biologia molecular. O protocolo descrito aqui tenta reduzir os limites de custo associados à extração de genomas e, assim, aumentar a aplicação de sequenciamento de alto rendimento para laboratórios e estudos limitados de recursos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos o apoio financeiro do Centro Regional de Excelência para Doenças Transmitidas por Vetores do Pacífico financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (Acordo Cooperativo 1U01CK000516), cdc conceder NU50CK000420-04-04, o USDA National Institute of Food and Agriculture (Projeto Hatch 1025565), uf/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) e Florida Department of Health (Contract CODQJ). As conclusões e conclusões deste artigo são dos autores e não representam necessariamente as opiniões do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
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- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
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