Summary
Beskrevet her er en DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler til at producere DNA-ekstraktioner af høj kvalitet fra myg. Disse ekstraktioner er velegnede til en downstream næste generations sekventeringsmetode.
Abstract
En nyligt offentliggjort DNA-ekstraktionsprotokol ved hjælp af magnetiske perler og et automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument antydede, at det er muligt at udtrække DNA af høj kvalitet og mængde fra en velbevaret individuel myg, der er tilstrækkelig til downstream hele genomsekvensering. Afhængighed af et dyrt automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument kan dog være uoverkommeligt for mange laboratorier. Her giver undersøgelsen en budgetvenlig magnetisk-perlebaseret DNA-ekstraktionsprotokol, som er velegnet til lav til medium gennemløb. Protokollen beskrevet her blev med succes testet ved hjælp af individuelle Aedes aegypti myg prøver. De reducerede omkostninger forbundet med dna-ekstraktion af høj kvalitet vil øge anvendelsen af høj gennemløbssekvensering på ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser.
Introduction
Den seneste udvikling af en forbedret DNA-ekstraktionsprotokol1 har gjort det muligt at se mange undersøgelser af nedstrøms med stor effekt , der omfatter hele genomsekvensering2,3,4,5,6. Denne magnetiske perlebaserede DNA-ekstraktionsprotokol giver pålideligt DNA-udbytte fra individuelle mygprøver, hvilket igen reducerer omkostningerne og tiden forbundet med at erhverve et tilstrækkeligt antal prøver fra feltsamlinger.
De seneste fremskridt inden for befolknings- og landskabsgenomik hænger direkte sammen med faldende omkostninger ved helgenomsekvensering. Selvom den tidligere DNA-ekstraktionsprotokol1 øger effektiviteten forbundet med høj gennemløbssekvensering, kan mindre laboratorier / undersøgelser uden midler fravælge at bruge disse nye kraftfulde landskabs- og populationsgenomikværktøjer på grund af omkostningerne ved at implementere protokollen (f.eks. omkostninger til specialiserede instrumenter).
Her præsenteres en modificeret DNA-ekstraktionsprotokol, der bruger et lignende magnetisk perleekstraktionstrin som Neiman et al.1 for at opnå DNA med høj renhed, men ikke er afhængig af dyre instrumenter til væv lysis og DNA-ekstraktion. Denne protokol er velegnet til eksperimenter, der kræver >10 ng dna af høj kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generel opbevaring af prøver og præparater inden DNA-ekstraktion
- Prøven inddamsprøven i vand af 100 μL PCR-kvalitet i 1 time (eller natten over) ved 4 °C, hvis prøven er opbevaret i > 70% alkohol for at blødgøre vævet.
2. Afbrydelse af stikprøven
- Sæt en inkubator eller rystende varmeblok ved 56 °C.
- Lav proteinase K (PK) buffer/enzym mix. Der kræves 2 μL Proteinase K (100 mg/mL) og 98 μL Proteinase K Buffer (i alt 100 μL) for hver enkelt mygekstraktion. For at forberede en masterblanding til flere prøver skal du øge den samlede mængde (kombineret for alle individuelle prøver) med ~15% for at sikre tilgængeligheden af tilstrækkelig volumen.
- Hvis prøverne blev hydreret inden ekstraktionen, kasseres vand fra hvert prøveglas.
- I et mikrocentrifugerør på 1,5 mL, der indeholder myggevæv, tilsættes 100 μL PK-buffer/enzymblanding.
- Homogenisere vævet ved hjælp af mikrocentrifuge rør pestle.
- Centrifuger prøverne i 1 min ved 9.600 x g ved stuetemperatur.
- Prøven inkuberes i 2-3 timer ved 56 °C.
- Under inkubationen skal de øvrige reagenser fremstilles ved hjælp af DNA-ekstraktionstrinnet (trin 3).
3. DNA-ekstraktion
- Lav en magnetisk perle master mix. For hver prøve blandes 100 μL lysisbuffer, 100 μL Isopropanol og 15 μL magnetiske perler (i alt 215 μL). For at forberede en master mix for flere reaktioner, øge den samlede mængde (kombineret for alle individuelle prøver) med ~ 20% for at sikre tilgængeligheden af tilstrækkelig volumen.
- Efter inkubationstiden (trin 2.7) overføres hvert lysat til et rent mikrocentrifugerør eller en mikropladebrønd ved hjælp af pipette.
- Der tilsættes 100 μL lysat og 215 μL af den magnetiske perlemasterblanding til hver prøve.
- Brug en pipette til at blande det godt i 10-20 s og lad det derefter stå i 10 minutter ved stuetemperatur. Ryst forsigtigt røret lejlighedsvis for at maksimere bindingen af magnetiske perler og DNA.
- Placer røret/pladen på den magnetiske perleseparator, og vent, indtil opløsningen er klar.
- Smid væsken fra røret/pladen ved hjælp af pipetten. Når du fjerner supernatanten, skal du prøve ikke at røre ved eller forstyrre de magnetiske perler, der holder DNA'et.
- Røret/pladen flyttes væk fra magnetisk perleseparator, og der tilsættes 325 μL vaskebuffer 1 til hver brønd.
- Bland grundigt ved pipettering og inkuber i 1 minut ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.5-3.6.
- Røret/pladen flyttes væk fra magnetisk perleseparator, og der tilsættes 250 μL vaskebuffer 1 til hver brønd.
- Bland grundigt ved pipettering og inkuber i 1 minut ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.5-3.6.
- Røret/pladen flyttes væk fra magnetisk perleseparator, og der tilsættes 250 μL vaskebuffer 2 til hver prøve.
- Bland grundigt og inkuber i 1 minut ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.5-3.6.
- Røret/pladen flyttes væk fra magnetisk perleseparator, og der tilsættes 250 μL vaskebuffer 2 til hver brønd.
- Bland grundigt og inkuber i 1 minut ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.5-3.6.
- Røret/pladen flyttes væk fra den magnetiske perleseparator, og der tilsættes 100 μL elueringsbuffer til hver brønd.
- Bland grundigt og inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Flyt røret/pladen over på den magnetiske perleseparator, og vent, indtil opløsningen er klar.
- Pipetter supernatanten til et nyt rent 0,5 mikrocentrifugerør eller mikropladebrønd.
- DNA-prøver opbevares ved 4 °C (op til 1 uge) eller -80 °C. Hvis der anvendes en mikroplade, skal den dækkes med parafilm.
- Bestem DNA-udbyttet ved hjælp af en passende metode.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev DNA-fluorometeraflæsning og absorbans ved 260/280 nm udnyttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det gennemsnitlige DNA-udbytte pr. enkelt myghoved/brystkassevæv var 4,121 ng/μL (N = 92, standardafvigelse 3,513) målt ved hjælp af et fluorometer ved eluering ved hjælp af 100 μL elueringsbuffer. Dette er tilstrækkeligt til de 10-30 ng genomiske DNA-inputkrav, der er nødvendige for hele genombibliotekets konstruktion1,7. Mængden af DNA kan variere mellem 0,3-29,7 ng/μL afhængigt af myggenes kropsstørrelse og bevaringsforhold. Nogle af de høje variabilitet skyldes det karakteristiske ved magnetiske perler, der anvendes i undersøgelsen. Forskellige mærker af magnetiske perler kan producere mere konsistente koncentrationer, som angivet i den foregående rapport1. Det skal også bemærkes, at forskellige mygarter varierer i størrelse, og at DNA-udbyttet er afhængigt af disse individuelle og arters størrelsesintervaller. Hvis DNA-koncentrationen er under de typiske intervaller, kan man justere inkubationsperioden i proteinase K-reaktionen (trin 2.7), men denne udvidelse bør ikke være længere end 16 timer. Desuden kan skift af proteinase K og/eller lysis buffer mærker have betydelig indvirkning på DNA udbytte1.
Den typiske mikrovolumefluorometeraflæsning af den endelige DNA-udløsningsbuffer med 0,5 mM EDTA er vist i figur 1. Det gennemsnitlige absorbansforhold for 260/280 nm var 2,3 (standardafvigelse = 0,071). Dataene var konsistente fra de prøver , der blev anvendt i de tidligere undersøgelser for hele genomsekvensering3,4.
Typisk reagens og forbrugsstoffer omkostninger til udvinding er omkring $ 9,50/prøve. Disse omkostningsoverslag omfatter reagenser, der er opført i materialeoversigten, og andre forbrugsstoffer såsom pipettespidser, rør og handsker, der er nødvendige for ekstraktion. Reagens- og forbrugsomkostningerne svarer til enhver typisk magnetisk perlebaseret ekstraktionsmetode(tabel 1). Omkostningerne kan variere noget afhængigt af bulk køb rabatter til rådighed for et givet produkt. Den største omkostningsfordel ved denne protokol kommer fra ikke at kræve det automatiserede DNA-ekstraktionsinstrument.
Figur 1: Fluorometeroutput. Typisk DNA-fluorometer output af myg DNA elueret i elution buffer med 0,5 mM EDTA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Omkostningsanalyse for forskellige udvindingsmetoder. Tabellen viser omkostningerne og antallet af prøver, der behandles på én arbejdsdag for forskellige ekstraktionsmetoder. Klik her for at hente denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokol kan tilpasses andre insektarter. Den oprindelige version af protokollen indført i Nieman et al.1 er blevet testet på flere arter, herunder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta og Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Det forventes, at denne protokol vil arbejde for disse såvel som andre leddyr.
Ideelt set bør prøver opbevares i 70-80% ethanol ved 4 °C før DNA-ekstraktion. Typisk bruges 80% ethanol til opbevaring af mygprøver i Afrika. Høje temperaturforhold kan fremskynde fordampning af ethanol og gøre ethanolindholdet lavere end det, der er beregnet til (70 %). Prøver lagret i 100% ethanol, denatureret alkohol, 75%-90% isopropanol eller sprit har også resulteret i en vellykket hel genom sekventering ved hjælp af Nieman et al.1 protokollen, og det forventes, at denne protokol ville klare sig lige så godt. Den her beskrevne DNA-ekstraktionsprotokol er også blevet afprøvet på prøver, der opbevares tørre i silica og nedfryses ved -20 °C. Der var dog en højere (15%-30%) chance for fejl, når de opbevares i >6-12 måneder, hvilket tyder på, at disse var mindre end ideelle opbevaringsforhold.
Da DNA-ekstraktion uden afbrydelse af fysiske prøver har større chance for svigt (33%)1, indeholder denne protokol en manuel fysisk forstyrrelsesteknik (trin 2.5). Prøveforstyrrelser kan også opnås ved hjælp af stålperler på et vævslyisinstrument1.
Reagenser og forbrugsomkostninger ved DNA-ekstraktion ved hjælp af denne protokol kan sammenlignes med andre tilgængelige ekstraktionsmetoder (tabel 1). Den protokol, der er beskrevet her, kræver dog ikke et automatiseret DNA-ekstraktionsinstrument. På grund af manuelt arbejde involveret i behandling af DNA-ekstraktion kan en person typisk behandle 12-16 prøver og afslutte med DNA-kvantificering på en dag. Dette er betydeligt mindre end hvad automatiseret DNA-ekstraktionsopsætning kan behandle om dagen. Når du vælger en protokol, bør der således tages hensyn til prøvebehandlingskapaciteten. Den lavere omkostningsgrænse, som denne protokol tilbyder, bør dog gøre det muligt for mange ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser at udnytte sig inden for sekventeringsteknologi med høj overførselshastighed.
I både Nieman et al.1 og denne protokol kan elueringsbuffer erstattes med den typiske TE-buffer, 10 mM Tris-Cl eller vand afhængigt af downstream-analysen. En elueringsbuffer, der indeholder en EDTA, kan påvirke enzymeffektiviteten. Typiske enzymatiske shearing-baserede gDNA bibliotek forberedelse protokoller omfatter conditioning løsninger eller smagsforstærkere tilføjet for at kompensere for enzym hæmning af EDTA. Det bør også tages i betragtning , at EDTA kan ændre absorbansen ved 230 nm bølgelængde11. Højere koncentrationer af EDTA ville f.eks.
Denne protokol kan let tilpasses laboratorier med minimal molekylærbiologi værktøjer. Den protokol, der er beskrevet her, forsøger at reducere omkostningstærsklerne forbundet med genomudvinding og derved øge anvendelsen af høj gennemløbssekvensering på ressourcebegrænsede laboratorier og undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender finansiering støtte fra Pacific Southwest Regional Center of Excellence for vektor-bårne sygdomme finansieret af den amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse (Samarbejdsaftale 1U01CK000516), CDC tilskud NU50CK000420-04-04, USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch projekt 1025565), UF / IFAS Florida Medical Entomology Laboratory stipendium til Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Fase II tilskud (AWD05009_MOD0030), og Florida Department of Health (Kontrakt CODQJ). Resultaterne og konklusionerne i denne artikel er dem af forfatteren (r) og ikke nødvendigvis repræsenterer de synspunkter, som den amerikanske Fish and Wildlife Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
