Summary
Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.
Abstract
Een onlangs gepubliceerd DNA-extractieprotocol met behulp van magnetische kralen en een geautomatiseerd DNA-extractie-instrument suggereerde dat het mogelijk is om DNA van hoge kwaliteit en kwantiteit te extraheren uit een goed bewaarde individuele mug die voldoende is voor downstream hele genoomsequencing. Vertrouwen op een duur geautomatiseerd DNA-extractie-instrument kan echter voor veel laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier biedt de studie een budgetvriendelijk dna-extractieprotocol op basis van magnetische kraal, dat geschikt is voor lage tot gemiddelde doorvoer. Het hier beschreven protocol is met succes getest met behulp van individuele Aedes aegypti muggenmonsters. De lagere kosten in verband met dna-extractie van hoge kwaliteit zullen de toepassing van hoge doorvoer sequencing op resource beperkte laboratoria en studies verhogen.
Introduction
Recente ontwikkeling van een verbeterd DNA-extractieprotocol1 heeft veel downstreamstudies met een hoge impact mogelijk gemaakt met hele genoomsequencing2,3,4,5,6. Dit magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen biedt een betrouwbare DNA-opbrengst van individuele muggenmonsters, wat op zijn beurt de kosten en tijd vermindert die gepaard gaan met het verkrijgen van een voldoende aantal monsters uit veldcollecties.
Recente vooruitgang in populatie- en landschapsgenomica is direct gecorreleerd met dalende kosten van hele genoomsequencing. Hoewel het vorige DNA-extractieprotocol1 de efficiëntie verhoogt die gepaard gaat met sequencing met hoge doorvoer, kunnen kleinere laboratoria / studies zonder de fondsen zich afmelden voor het gebruik van deze nieuwe krachtige landschaps- en populatiegenomicatools vanwege de kosten van de implementatie van het protocol (bijv. kosten van gespecialiseerde instrumenten).
Hier wordt een aangepast DNA-extractieprotocol gepresenteerd dat een vergelijkbare magnetische kraalextractiestap gebruikt als Neiman et al.1 om DNA met een hoge zuiverheid te verkrijgen, maar niet afhankelijk is van dure instrumenten voor weefsellysis en DNA-extractie. Dit protocol is geschikt voor experimenten waarbij >10 ng hoogwaardig DNA nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene monsteropslag en preparaten voorafgaand aan DNA-extractie
- Hydrateer het monster gedurende 1 uur (of 's nachts) bij 4 °C in 100 μL PCR-water als het monster is opgeslagen in >70% alcohol om het weefsel te verzachten.
2. Voorbeeld verstoring
- Zet een incubator of schudwarmteblok op 56 °C.
- Maak proteinase K (PK) buffer/enzymmix. 2 μL Proteïnase K (100 mg/ml) en 98 μL Proteinase K Buffer (totaal 100 μL) is vereist voor elke individuele muggenextractie. Om een mastermix voor meerdere specimens voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke specimens) met ~ 15% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.
- Als de monsters vóór de extractie zijn gehydrateerd, gooi dan water uit elke monsterbuis.
- Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met muggenweefsel 100 μL PK buffer/enzymmix toe.
- Homogeniseer het weefsel met behulp van microcentrifugebuis stamper.
- Centrifugeer de monsters gedurende 1 min bij 9.600 x g bij kamertemperatuur.
- Incubeer het monster gedurende 2-3 uur bij 56 °C.
- Bereid tijdens de incubatie de andere reagentia voor met behulp van de DNA-extractiestap (stap 3).
3. DNA-extractie
- Maak een magnetische kraal master mix. Meng voor elk monster 100 μL lysisbuffer, 100 μL Isopropanol en 15 μL magnetische kralen (totaal 215 μL). Om een mastermix voor meerdere reacties voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke exemplaren) met ~ 20% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.
- Breng na de incubatietijd (stap 2.7) elk lysaat over naar een schone microcentrifugebuis of een microplaatput met behulp van pipet.
- Voeg 100 μL lysaat en 215 μL van de magnetische kraal master mix toe aan elk monster.
- Gebruik een pipet om het goed te mengen voor 10-20 s en laat het vervolgens 10 minuten staan op kamertemperatuur. Schud de buis af en toe om de binding van magnetische kralen en DNA te maximaliseren.
- Plaats de buis/plaat op de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.
- Gooi de vloeistof met behulp van een pipet uit de buis/plaat. Probeer bij het verwijderen van het supernatant de magnetische kralen die het DNA vasthouden niet aan te raken of te verstoren.
- Beweeg de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 325 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.
- Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.5-3.6.
- Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.
- Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.5-3.6.
- Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elk monster.
- Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.5-3.6.
- Verplaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elke put.
- Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.5-3.6.
- Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elke put.
- Meng grondig en incubeer gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.
- Beweeg de buis/plaat over de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.
- Pipetteer de supernatant in een nieuwe schone 0,5 microcentrifugebuis of microplaatput.
- Bewaar DNA-monsters bij 4 °C (tot 1 week) of -80 °C. Als een microplaat wordt gebruikt, bedek deze dan met parafilm.
- Bepaal de DNA-opbrengsten met behulp van een geschikte methode.
OPMERKING: In deze studie werd gebruik gemaakt van DNA-fluorometermeting en absorptie bij 260/280 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gemiddelde DNA-opbrengst per individuele muggenkop/thoraxweefsel was 4,121 ng/μL (N = 92, standaardafwijking 3,513) gemeten met behulp van een fluorometer bij elutie met 100 μL elutiebuffer. Dit is voldoende voor de 10-30 ng genomische DNA-inputvereisten die nodig zijn voor de constructie van de gehele genoombibliotheek1,7. De hoeveelheid DNA kan variëren tussen 0,3-29,7 ng/μL, afhankelijk van de lichaamsgrootte en conserveringsomstandigheden van de mug. Een deel van de hoge variabiliteit is te wijten aan het kenmerk van magnetische kralen die in de studie worden gebruikt. Verschillende merken magnetische kralen kunnen consistentere concentraties produceren, zoals aangegeven in het vorige verslag1. Er moet ook worden opgemerkt dat verschillende muggensoorten verschillen in grootte en dat de DNA-opbrengst afhankelijk is van die individuele en soortgroottebereiken. Als de DNA-concentratie lager is dan de typische bereiken, kan men de incubatietijd in de proteïnase K-reactie aanpassen (stap 2.7), maar deze verlenging mag niet langer zijn dan 16 uur. Bovendien kan het overschakelen van de proteïnase K- en/of lysisbuffermerken een aanzienlijke impact hebben op de DNA-opbrengst1.
De typische microvolumefluorometeraflezing van het uiteindelijke DNA in elutiebuffer met 0,5 mM EDTA is weergegeven in figuur 1. De gemiddelde absorptieverhouding voor 260/280 nm was 2,3 (standaardafwijking = 0,071). De gegevens waren consistent uit de monsters die in de vorige studies werden gebruikt voor hele genoomsequencing3,4.
Typische reagens en verbruikskost voor extractie is ongeveer $ 9,50 / monster. Deze kostenramingen omvatten reagentia die zijn vermeld in de tabel met materialenen andere verbruiksartikelen zoals pipettips, buizen en handschoenen die nodig zijn voor extractie. Het reagens en de verbruikskosten zijn gelijk aan elke typische extractiemethode op basis van magnetische kraal (tabel 1). De kosten kunnen enigszins variëren, afhankelijk van bulkaankoopkortingen die beschikbaar zijn voor een bepaald product. Het grote kostenvoordeel van dit protocol komt door het niet vereisen van het geautomatiseerde DNA-extractie-instrument.
Figuur 1: Fluorometer uitgang. Typische DNA fluorometer output van muggen DNA geëuteerd in elutie buffer met 0,5 mM EDTA. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1: Kostenanalyse voor verschillende extractiemethoden. De tabel bevat de kosten en het aantal monsters dat in één werkdag is verwerkt voor verschillende extractiemethoden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor andere insectensoorten. De oorspronkelijke versie van het protocol geïntroduceerd in Nieman et al.1 is getest op meerdere soorten, waaronder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii Verwacht wordt dat dit protocol zal werken voor deze en andere geleedpotigen.
Idealiter moeten monsters worden bewaard in 70%-80% ethanol bij 4 °C voorafgaand aan DNA-extractie. Meestal wordt 80% ethanol gebruikt voor het opslaan van muggenmonsters in Afrika. Omstandigheden bij hoge temperaturen kunnen de verdamping van ethanol versnellen en het ethanolgehalte lager maken dan de bedoeling is (70%). Monsters opgeslagen in 100% ethanol, gedenatureerde alcohol, 75%-90% isopropanol of wrijvende alcohol hebben ook geresulteerd in succesvolle hele genoomsequencing met behulp van het Nieman et al.1 protocol, en de verwachting is dat dit protocol even goed zal presteren. Het hier beschreven DNA-extractieprotocol is ook uitgeprobeerd op monsters die droog in silica zijn opgeslagen en bij -20 °C zijn ingevroren. Er was echter een hogere kans (15%-30%) op falen bij opslag gedurende >6-12 maanden, wat suggereert dat dit minder dan ideale opslagomstandigheden waren.
Aangezien DNA-extractie zonder verstoring van het fysieke monster een grotere kans op falen heeft (33%)1, bevat dit protocol een handmatige fysieke verstoringstechniek (stap 2.5). Monsterverstoring kan ook worden bereikt met behulp van stalen kralen op een weefsellysis-instrument1.
De reagentia en verbruikskosten voor DNA-extractie met behulp van dit protocol zijn vergelijkbaar met andere beschikbare extractiemethoden (tabel 1). Het hier beschreven protocol vereist echter geen geautomatiseerd DNA-extractie-instrument. Vanwege handmatige arbeid die betrokken is bij het verwerken van DNA-extractie, kan één persoon meestal 12-16 monsters verwerken en in één dag eindigen met DNA-kwantificering. Dit is aanzienlijk minder dan wat geautomatiseerde DNA-extractie-opstelling per dag kan verwerken. Bij het kiezen van een protocol moet dus rekening worden gehouden met de monsterverwerkingscapaciteit. De lagere kostendrempel die dit protocol biedt, moet echter veel labs en studies met beperkte resource in staat stellen gebruik te maken van sequencingtechnologie met hoge doorvoer.
In zowel de Nieman et al.1 als dit protocol kan elutiebuffer worden vervangen door de typische TE-buffer, 10 mM Tris-Cl of water, afhankelijk van de downstream-analyse. Een elutiebuffer met enige EDTA kan de enzymefficiëntie beïnvloeden. Typische enzymatische op scheren gebaseerde gDNA-bibliotheekvoorbereidingsprotocollen omvatten conditioneringsoplossingen of versterkers die zijn toegevoegd om enzymremming door EDTA te compenseren. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat EDTA de absorptie bij golflengte 230 nm11kan veranderen . Hogere concentraties EDTA zouden bijvoorbeeld een hogere absorptiewaarde creëren tussen de golflengte van 220-240 nm dan die in figuur 1 (gegevens niet weergegeven).
Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan laboratoria met minimale moleculaire biologietools. Het hier beschreven protocol probeert de kostendrempels in verband met genoomextractie te verlagen en zo de toepassing van sequencing met hoge doorvoer naar labs en studies met beperkte resource te verhogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We erkennen de financiering van het Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, gefinancierd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC-subsidie NU50CK000420-04-04, het USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) De bevindingen en conclusies in dit artikel zijn die van de auteur(s) en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de U.S. Fish and Wildlife Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
