Summary
Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.
Abstract
Manyetik boncuklar ve otomatik bir DNA ekstraksiyon cihazı kullanılarak yakın zamanda yayınlanan bir DNA ekstraksiyon protokolü, tüm genom dizilimleri için yeterli olan iyi korunmuş bir bireysel sivrisinekten yüksek kalite ve miktar DNA'sı çıkarmanın mümkün olduğunu öne sürdü. Bununla birlikte, pahalı bir otomatik DNA çıkarma cihazına güvenmek birçok laboratuvar için yasaklayıcı olabilir. Burada, çalışma düşük ila orta verim için uygun olan bütçe dostu manyetik boncuk bazlı BIR DNA ekstraksiyon protokolü sağlar. Burada açıklanan protokol, bireysel Aedes aegypti sivrisinek örnekleri kullanılarak başarıyla test edildi. Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu ile ilişkili düşük maliyetler, kaynak sınırlı laboratuvarlara ve çalışmalara yüksek verim diziliminin uygulanmasını artıracaktır.
Introduction
Geliştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü1'in son gelişimi, tüm genom dizilimini içeren birçok yüksek etkili aşağı akış çalışmasına izin verdi2,3,4,5,6. Bu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, bireysel sivrisinek örneklerinden güvenilir DNA verimi sağlar ve bu da alan koleksiyonlarından yeterli sayıda örnek elde etmekle ilgili maliyet ve zamanı azaltır.
Nüfus ve peyzaj genomiklerindeki son gelişmeler, tüm genom diziliminin azalan maliyetleri ile doğrudan ilişkilidir. Önceki DNA ekstraksiyon protokolü1, yüksek verim sıralaması ile ilişkili verimliliği artırsa da, fonlar olmadan daha küçük laboratuvarlar / çalışmalar, protokolün uygulanması maliyetleri (örneğin, özel aletlerin maliyetleri) nedeniyle bu yeni güçlü peyzaj ve popülasyon genomik araçlarını kullanmaktan vazgeçebilir.
Burada, yüksek saflıkta DNA elde etmek için Neiman ve ark.1 ile benzer bir manyetik boncuk ekstraksiyon adımı kullanan ancak doku lizisi ve DNA ekstraksiyonu için yüksek maliyetli araçlara dayanmayan değiştirilmiş bir DNA ekstraksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, >10 ng yüksek kaliteli DNA gerektiren deneyler için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA ekstraksiyonu öncesinde genel numune depolama ve hazırlıklar
- Numune, dokuyu yumuşatmak için % 70 alkol > depolanmışsa, numuneyi 4 °C'de 1 saat (veya gece boyunca) 100 μL PCR sınıfı suda nemlendirin.
2. Örnek bozulması
- 56 °C'de bir inkübatör veya sallama ısı bloğu ayarlayın.
- Proteinaz K (PK) tampon/enzim karışımı yapın. Her bir sivrisinek ekstraksiyonu için 2 μL Proteinaz K (100 mg/mL) ve 98 μL Proteinaz K Tamponu (toplam 100 μL) gereklidir. Birden fazla numune için ana karışım hazırlamak için, yeterli hacmin kullanılabilirliğini sağlamak için toplam miktarı (tüm bireysel numuneler için birleştirilmiş) ~% 15 artırın.
- Numuneler ekstraksiyondan önce nemlendirilmişse, her numune tüpünden su atın.
- Sivrisinek dokusu içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 100 μL PK tampon/enzim karışımı ekleyin.
- Mikrosantrifüj tüp pestle kullanarak dokuyu homojenize edin.
- Numuneleri oda sıcaklığında 9.600 x g'da 1 dakika santrifüj edin.
- Numuneyi 56 °C'de 2-3 saat kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka sırasında, DNA ekstraksiyon adımını kullanarak diğer reaktifleri hazırlayın (adım 3).
3. DNA ekstraksiyonu
- Manyetik boncuk ana karışımı yapın. Her numune için 100 μL lizis tamponu, 100 μL İzopropanol ve 15 μL manyetik boncuk (toplam 215 μL) karıştırın. Birden fazla reaksiyon için ana karışım hazırlamak için, yeterli hacmin kullanılabilirliğini sağlamak için toplam miktarı (tüm bireysel numuneler için birleştirilmiş) ~% 20 artırın.
- Kuluçka süresinden sonra (adım 2.7), her bir lisatı pipet kullanarak temiz bir mikrosantrifüj tüpüne veya bir mikro plaka kuyusuna aktarın.
- Her numuneye 100 μL lysate ve 215 μL manyetik boncuk ana karışımı ekleyin.
- 10-20 s için iyice karıştırmak için bir pipet kullanın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Manyetik boncukların ve DNA'nın bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve çözelti temizlenine kadar bekleyin.
- Pipet kullanarak sıvıyı tüpten/plakadan atın. Süpernatant çıkarılırken, DNA'yı tutan manyetik boncuklara dokunmamaya veya rahatsız etmemeye çalışın.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 325 μL yıkama tamponu 1 ekleyin.
- Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın.
- 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 250 μL yıkama tamponu 1 ekleyin.
- Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın.
- 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her numuneye 250 μL yıkama tamponu 2 ekleyin.
- İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.
- 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve her kuyuya 250 μL yıkama tamponu 2 ekleyin.
- İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatır.
- 3.5-3.6 arası adımları yineleyin.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcıdan uzağa taşıyın ve her kuyuya 100 μL elution tamponu ekleyin.
- İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatır.
- Tüpü/plakayı manyetik boncuk ayırıcının üzerine taşıyın ve çözelti net olana kadar bekleyin.
- Süpernatantı yeni bir temiz 0.5 mikrosantrifüj tüpüne veya mikro plaka kuyusuna pipet.
- DNA örneklerini 4 °C (1 haftaya kadar) veya -80 °C'de saklayın. Bir mikro plaka kullanılıyorsa, parafilm ile örtün.
- Uygun bir yöntem kullanarak DNA verimini belirleyin.
NOT: Bu çalışmada 260/280 nm'de DNA florometre okuma ve absorbans kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bireysel sivrisinek başı/toraks dokusu başına ortalama DNA verimi 100 μL elüasyon tamponu kullanılarak elde edildiğinde florometre kullanılarak ölçülen 4.121 ng/μL (N = 92, standart sapma 3.513) idi. Bu, tüm genom kütüphanesi yapımı için gerekli olan 10-30 ng genomik DNA giriş gereksinimleri için yeterlidir1,7. DNA miktarı, sivrisinek vücut büyüklüğüne ve koruma koşullarına bağlı olarak 0,3-29,7 ng/μL arasında değişebilir. Yüksek değişkenliğin bir kısmı çalışmada kullanılan manyetik boncukların özelliğinden kaynaklanmaktadır. Farklı manyetik boncuk markaları, önceki raporda belirtildiği gibi daha tutarlı konsantrasyonlar üretebilir1. Ayrıca, farklı sivrisinek türlerinin boyut bakımından farklılık gösterir ve DNA veriminin bu bireysel ve tür boyut aralıklarına bağlı olduğu belirtilmelidir. DNA konsantrasyonu tipik aralıkların altındaysa, proteinaz K reaksiyonundaki inkübasyon süresini ayarlayabilirsiniz (adım 2.7), ancak bu uzantı 16 saatten uzun olmamalıdır. Ayrıca, proteinaz K ve/veya lizis tampon markalarının değiştirilmesi DNA verimi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir1.
0,5 mM EDTA ile elüsyon tamponunda nihai DNA'nın tipik mikrovolum florometresi okuması Şekil 1'degösterilmiştir. 260/280 nm için ortalama absorbans oranı 2.3 idi (standart sapma = 0.071). Veriler, tüm genom dizilimi3,4için önceki çalışmalarda kullanılan örneklerden tutarlıydı.
Ekstraksiyon için tipik reaktif ve sarf malzemesi maliyeti yaklaşık $ 9.50 / örnektir. Bu maliyet tahminleri, Malzeme Tablosundalistelenen reaktifleri ve ekstraksiyon için gerekli pipet uçları, tüpler ve eldivenler gibi diğer sarf malzemelerini içerir. Reaktif ve sarf malzemesi maliyeti, tipik manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yöntemine eşdeğerdir (Tablo 1). Maliyet, herhangi bir ürün için mevcut toplu satın alma indirimlerine bağlı olarak biraz değişebilir. Bu protokolün en büyük maliyet avantajı, otomatik DNA çıkarma cihazı gerektirmemekten kaynaklanır.
Şekil 1: Florometre çıkışı. Sivrisinek DNA'sının tipik DNA florometre çıkışı 0,5 mM EDTA ile elüsyon tamponunda elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Farklı ekstraksiyon yöntemleri için maliyet analizi. Tabloda, farklı ayıklama yöntemleri için bir iş gününde işlenen maliyetleri ve numune sayısı listelenir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol diğer böcek türleri için uyarlanabilir. Nieman ve ark.1'de sunulan protokolün orijinal versiyonu, Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, dahil olmak üzere birden fazla tür üzerinde test edilmiştir. An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta ve Keiferia lycopersicella2,8,9,10. Bu protokolün diğer eklembacaklıların yanı sıra bunlar için de işe yarayacağı bekleniyor.
İdeal olarak, numuneler DNA ekstraksiyonu öncesinde 4 °C'de %70-%80 etanol içinde saklanmalıdır. Tipik olarak, sivrisinek örneklerini Afrika'da depolamak için% 80 etanol kullanılır. Yüksek sıcaklık koşulları etanol buharlaşmasını hızlandırabilir ve etanol içeriğini amaçlanandan daha düşük hale getirebilir (%70). %100 etanol, denatüre alkol, %75-%90 izopropanol veya ovma alkolü içinde saklanan örnekler de Nieman ve ark.1 protokolü kullanılarak tüm genom diziliminin başarılı olmasına neden olmuş ve bu protokolün eşit derecede iyi performans göstermesi beklenmektedir. Burada açıklanan DNA ekstraksiyon protokolü, silikada kuru olarak saklanan ve -20 °C'de dondurulan numuneler üzerinde de denenmiştir. Bununla birlikte, 6-12 ay > depolandığında daha yüksek (%15-% 30) bir başarısızlık olasılığı vardı, bu da bunların ideal depolama koşullarından daha az olduğunu gösteriyor.
Fiziksel numune bozulması olmadan DNA ekstraksiyonu daha yüksek bir başarısızlık şansına sahip olduğu için (%33)1, bu protokol manuel bir fiziksel bozulma tekniği (adım 2.5) içerir. Bir doku liziz cihazı üzerinde çelik boncuklar kullanılarak numune bozulması da elde edilebilir1.
Bu protokolü kullanarak DNA ekstraksiyonu için reaktifler ve sarf malzemesi maliyeti mevcut diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırılabilir (Tablo 1). Ancak, burada açıklanan protokol otomatik bir DNA çıkarma cihazı gerektirmez. DNA ekstraksiyonu işlemede yer alan el emeği nedeniyle, bir kişi tipik olarak 12-16 örneği işleyebilir ve bir günde DNA niceliği ile bitirebilir. Bu, otomatik DNA çıkarma kurulumunun günde işleyebileceğinden önemli ölçüde daha azdır. Bu nedenle, bir protokol seçerken, örnek işleme kapasitesi dikkate alınmalıdır. Ancak, bu protokolün sunduğu daha düşük maliyet eşiği, birçok kaynak sınırlı laboratuvar ve çalışmanın yüksek verimli sıralama teknolojisinde yararlanmasını sağlamalıdır.
Hem Nieman ve ark.1 hem de bu protokolde, elution arabelleği, aşağı akış analizine bağlı olarak tipik TE arabelleği, 10 mM Tris-Cl veya su ile değiştirilebilir. Bazı EDTA içeren bir elüasyon tamponu enzim verimliliğini etkileyebilir. Tipik enzimatik kesme tabanlı gDNA kütüphanesi hazırlama protokolleri, EDTA tarafından enzim inhibisyonunu telafi etmek için eklenen şartlandırma çözeltilerini veya arttırıcıları içerir. Ayrıca, EDTA'nın emiciliği 230 nm dalga boyunda11değiştirebileceği düşünülmelidir. Örneğin, daha yüksek EDTA konsantrasyonları, Şekil 1'de gösterilenden 220-240 nm dalga boyu arasında daha yüksek bir emiciliği değeri oluşturur (veriler gösterilmez).
Bu protokol, minimum moleküler biyoloji araçlarıyla laboratuvarlara kolayca uyarlanabilir. Burada açıklanan protokol, genom ekstraksiyonu ile ilişkili maliyet eşiklerini azaltmaya ve böylece kaynak sınırlı laboratuvarlara ve çalışmalara yüksek verim sıralaması uygulamasını artırmaya çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (Kooperatif Anlaşması 1U01CK000516), CDC hibeSI NU50CK000420-04-04 tarafından finanse edilen Pasifik Güneybatı Vektör Kaynaklı Hastalıklar Bölgesel Mükemmeliyet Merkezi'nden fon desteğini kabul ediyoruz, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü (Hatch projesi 1025565), Tse-Yu Chen'e UF/IFAS Florida Tıbbi Entomoloji Laboratuvarı bursu, NSF CAMTech IUCRC Faz II hibesi (AWD05009_MOD0030) ve Florida Sağlık Bakanlığı (Sözleşmeli CODQJ). Bu makaledeki bulgular ve sonuçlar yazar(lar)ın bulgularıdır ve abd Balık ve Yaban Hayatı Servisi'nin görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Elution buffer |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Lysis buffer |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Washing buffer 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Washing buffer 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | magnetic bead |
| Magnetic bead separator | Epigentek | Q10002-1 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-2000 | microvolume spectrophotometer |
| PK Buffer | ThermoFisher | 4489111 | Proteinase K buffer |
| Proteinase K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorometer |
References
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314 (2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204 (2019).
- Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425 (2020).
- Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473 (2019).
- Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
- Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303 (2016).
- Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211 (2016).
- Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
- Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
- Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
- Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).
