Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Udforskning af m6A og m5C Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62426
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Microbiology, Lausanne University Hospital and University of Lausanne, 2Bioinformatics Core Facility, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Summary

RNA-modifikationernes rolle i virusinfektioner er lige begyndt at blive undersøgt og kunne fremhæve nye virale interaktionsmekanismer. I dette arbejde leverer vi en pipeline til at undersøge m6A og m5C RNA ændringer i forbindelse med virusinfektioner.

Abstract

RNA-modifikationernes rolle i biologiske processer har været i fokus for et stigende antal undersøgelser i de sidste par år og er i dag kendt som epitranscriptomics. Blandt andet, N6-methyladenosin (m6A) og 5-methylcytosin (m5C) RNA ændringer er blevet beskrevet på mRNA molekyler og kan have en rolle i modulerende cellulære processer. Epitranscriptomics er således et nyt reguleringslag, der skal overvejes ud over transskriptomiske analyser, da det også kan ændres eller moduleres ved eksponering for kemiske eller biologiske agenser, herunder virusinfektioner.

Her præsenterer vi en arbejdsgang, der gør det muligt at analysere det fælles cellulære og virale epitranscriptomiske landskab af m6A- og m5C-mærkerne samtidigt, i celler, der er inficeret eller ej med human immundefektvirus (HIV). Ved mRNA-isolation og fragmentering fra hiv-inficerede og ikke-inficerede celler brugte vi to forskellige procedurer: MeRIP-Seq, en RNA-immunprecipitationsbaseret teknik, til at berige for RNA-fragmenter, der indeholder m6A-mærket og BS-Seq, en bisulfitkonverteringsbaseret teknik, til at identificere m5C-mærket ved en enkelt nukleotidopløsning. Ved methyleringsspecifik fangst er RNA-biblioteker forberedt til sekventering med høj kapacitetshastighed. Vi udviklede også en dedikeret bioinformatik pipeline til at identificere differentieret methylerede (DM) udskrifter uafhængigt af deres basal udtryk profil.

Samlet set metoden tillader udforskning af flere epitranscriptomic mærker samtidigt og giver et atlas af DM udskrifter på virusinfektion eller enhver anden celleforstyrrelse. Denne tilgang giver nye muligheder for at identificere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, såsom cellulære faktorer, der fremmer eller begrænser viral replikation.

Introduction

Det er længe kendt, at RNA molekyler kan ændres, og mere end 150 post-transskriptionelle ændringer er blevet beskrevet til dato1. De består i tilsætning af kemiske grupper, hovedsagelig methylgrupper, til stort set enhver position af pyrimidin- og purinringe af RNA-molekyler2. Sådanne post-transskriptionelle ændringer har allerede vist sig at være højt beriget i overførsel RNA (tRNA) og ribosomale RNA (rRNA) og er for nylig blevet beskrevet på mRNA molekyler samt.

Fremkomsten af nye teknologier, såsom Next Generation Sequencing (NGS), og produktionen af specifikke antistoffer, der anerkender bestemte kemiske ændringer, gjorde det for første gang muligt at undersøge placeringen og hyppigheden af specifikke kemiske modifikationer på et transskriptom-dækkende niveau. Disse fremskridt har ført til en bedre forståelse af RNA-modifikationer og til kortlægning af flere modifikationer på mRNA-molekyler3,4.

Mens epigenetik undersøger DNA's og histonemodifikationers rolle i transskriptomregulering, fokuserer epitranscriptomics på samme måde på RNA-modifikationer og deres rolle. Undersøgelsen af epitranscriptomiske modifikationer giver nye muligheder for at fremhæve nye reguleringsmekanismer, der kan tune en række cellulære processer (dvs. RNA-splejsning, eksport, stabilitet og oversættelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse, at nylige undersøgelser afdækket mange epitranscriptomiske ændringer på virusinfektion i både cellulære og virale RNA'er6. De vira, der hidtil er undersøgt, omfatter både DNA- og RNA-vira; blandt dem kan hiv betragtes som et banebrydende eksempel. Alt i alt kan opdagelsen af RNA methylering i forbindelse med virusinfektioner gøre det muligt at undersøge endnu ubeskrevne mekanismer for virale udtryk eller replikation, hvilket giver nye værktøjer og mål til at kontrollere dem7.

Inden for hiv epitranscriptomics, modifikationer af virale udskrifter er blevet bredt undersøgt og har vist, at tilstedeværelsen af denne ændring var gavnligt for viral replikation8,9,10,11,12,13. Til dato forskellige teknikker kan bruges til at opdage epitranscriptomic mærker på transcriptome-dækkende niveau. De mest anvendte teknikker til m6A identifikation stole på immun nedbør teknikker såsom MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er afhængig af RNA fragmentering til at fange fragmenter, der indeholder methylerede rester, miCLIP er baseret på generering af α-m6A antistof specifikke signatur mutationer på RNA-antistof UV crosslinking, hvilket giver mulighed for en mere præcis kortlægning.

Påvisning af m5C-modifikation kan opnås enten ved antistofbaserede teknologier svarende til m6A-detektion (m5C RIP) eller ved bisulfitkonvertering eller ved AZA-IP eller ved miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruger en bestemt methyltransferase som agn til at målrette RNA, mens du går gennem RNA methylering. I Aza-IP udsættes målceller for 5-azacytidin, hvilket resulterer i tilfældig indførelse af cytidin analog 5-azacytidin steder i spirende RNA. I miCLIP er NSun2 methyltransferase genetisk modificeret til at huse C271A-mutationen14,15.

I dette arbejde fokuserer vi på den dobbelte karakterisering af m6A og m5C-modifikationer i inficerede celler ved hjælp af HIV som model. Ved metodologisk optimering har vi udviklet en arbejdsgang, der kombinerer methyleret RNA immunprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfitkonvertering (BS), der muliggør samtidig udforskning af m6A og m5C epitranscriptomiske mærker på et transskriptom-dækkende niveau, i både cellulære og virale sammenhænge. Denne arbejdsgang kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter såvel som på RNA isoleret fra viruspartikler.

Methyleret RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16-tilgangen , der gør det muligt at undersøge m6A på transskriptom-dækkende niveau, er veletableret, og en række m6A-specifikke antistoffer er kommercielt tilgængelige til dato17. Denne metode består i selektiv opsamling af m6A-holdige RNA-stykker ved hjælp af et m6A-specifikt antistof. De to største ulemper ved denne teknik er (i) den begrænsede opløsning, som er meget afhængig af størrelsen af RNA-fragmenter og dermed giver en omtrentlig placering og region, der indeholder methylerede rester, og (ii) den store mængde materiale, der er nødvendigt for at udføre analysen. I den følgende optimerede protokol standardiserede vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reducerede mængden af udgangsmateriale fra 10 μg poly-A-udvalgte RNA, som i øjeblikket er den anbefalede mængde udgangsmateriale, til kun 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerede også nyttiggørelseseffektiviteten af m6A RNA-fragmenter bundet til specifikke antistoffer ved hjælp af en elution ved en konkurrencetilgang med en m6A peptid i stedet for mere konventionelle og mindre specifikke elutionsmetoder ved hjælp af phenolbaserede teknikker eller proteinase K. Den væsentligste begrænsning af denne RIP-baserede analyse er imidlertid fortsat den suboptimale opløsning, der ikke gør det muligt at identificere den præcise modificerede A-nukleotid.

Analyse af m5C-mærket kan i øjeblikket udføres ved hjælp af to forskellige tilgange: en RIP-baseret metode med m5C-specifikke antistoffer og RNA bisulfitkonvertering. Da RIP kun tilbyder begrænset opløsning på identifikationen af methylerede rester, brugte vi bisulfitkonvertering, der kan tilbyde enkelt nukleotidopløsning. RNA-eksponering for bisulfit (BS) fører til cytosindeaminering og omdanner derved cytosinresterne til uracil. Under RNA bisulfitkonverteringsreaktionen afamineres og omdannes hver ikke-methyleret cytosin til uracil, mens tilstedeværelsen af en methylgruppe i position 5 af cytosinen har en beskyttende virkning, der forhindrer BS-induceret deaminering og bevarer cytosinresterne. Den BS-baserede tilgang giver mulighed for påvisning af et m5C modificeret nukleotid ved enkelt basisopløsning og til vurdering af methyleringsfrekvensen for hver udskrift, hvilket giver indsigt i m5C-modifikationsdynamik18. Den vigtigste begrænsning af denne teknik er imidlertid afhængig af den falske positive sats af methylerede rester. BS-konverteringen er faktisk effektiv på enkeltstrenget RNA med tilgængelige C-rester. Tilstedeværelsen af en stram RNA sekundær struktur kan imidlertid maskere N5C-positionen og hæmme BS-konverteringen, hvilket resulterer i ikke-methylerede C-rester, der ikke omdannes til U-rester og dermed falske positiver. For at omgå dette problem og minimere den falske positive sats anvendte vi 3 runder denaturerings- og bisulfitkonverteringscyklusser19. Vi har også indført 2 kontroller i prøverne for at muliggøre estimering af bisulfitkonverteringseffektivitet: Vi spike-in ERCC sekventering kontrol (ikke-methyleret standardiserede og kommercielt tilgængelige sekvenser)20 samt poly-A-udtømte RNA'er til at vurdere bisulfit konverteringsfrekvens på den ene side, og at kontrollere ved RT-PCR tilstedeværelsen af en kendt og velbevaret methyleret site, C4447, på 28S ribosomale RNA på den anden side21.

Inden for virologi giver kobling af disse to epitranscriptomiske undersøgelsesmetoder med næste generations sekventering og nøjagtig bioinformatisk analyse mulighed for en dybdegående undersøgelse af m6A- og m5C-dynamik (dvs. RNA-modifikationstidlige ændringer, der kan forekomme ved virusinfektion og kunne afdække en række nye terapeutisk relevante mål for klinisk brug).

Protocol

1. Celleforberedelse

BEMÆRK: Afhængigt af celletypen og RNA-indholdet kan starttallet af celler variere.

  1. Har nok celler til at opnå mellem 200-500 μg af det samlede RNA eller 5-7 μg poly-A-udvalgte RNA. For eksempel skal 50 x 106 SupT1-celler give omkring 500 μg total RNA ved udvinding med phenolbaserede reagenser og er derfor påkrævet for hver enkelt testet tilstand.
  2. Forbered det nødvendige antal celler i henhold til det eksperimentelle design, og dermed i henhold til antallet af testede betingelser (infektion, tidpunkter, behandling). Hvis forsøget har til formål at opnå ikke-inficerede celler og HIV-inficerede celler på 24 timer efter infektion, i alt 100 x 106 celler er nødvendig, halvdelen for ikke-inficerede tilstand og halvdelen for inficeret tilstand.

2. RNA Udvinding

  1. Fra celler: RNA-ekstraktion med phenol-kloroform
    1. For hver tilstand opsamles celler (f.eks.50 x 106) ved centrifugering, og supernatanten kasseres.
    2. Tilsæt 5 mL phenol-baseret reagens til hver 50 x 106 celle pellet og blandes ved pipetting op og ned flere gange.
    3. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur for at tillade komplet lysis. Lysede celler kan opbevares ved -80 °C eller behandles direkte.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan celler også opdeles i aliquots af 10 x 106 celler pr. rør i 1,5 ML rør og lysed i 1 mL phenol-baseret reagens for mere bekvem opbevaring.
    4. Tilsæt 1 mL kloroform og bland ved inversion.
    5. Inkuber i 3 min ved stuetemperatur.
    6. Centrifuge i 15 min ved 2.000 x g og 4 °C.
    7. Pipette ud den vandige fase (øverste fase) og overføre til et nyt rør. Afslut overførslen af vandig fase ved at fiske røret ved 45 ° og forsigtigt pipetter opløsningen ud.
      BEMÆRK: Mængden af vandig fase kan variere mellem prøverne, men bør ligge tæt på den mængde kloroform, der tilsættes prøven (dvs. 1 mL). Overfør ikke noget interfase eller organisk lag! Brugen af fase-lås eller fase-maker rør kan lette denne proces.
    8. Tilsæt 0,5 mL 100% molekylær kvalitet isopropanol til vandige fase.
    9. Inkuberes i 1 time ved -80 °C for at tillade RNA nedbør.
    10. Centrifuge i 10 min ved 12.000 x g og 4 °C for at pille det udfældede RNA.
    11. Kassér supernatanten og genbrug RNA-pelleten i 1 mL af 75% molekylærbiologisk ethanol. Vortex kort.
    12. Centrifuge i 5 min ved 7.500 x g og 4 °C og kassér supernatanten.
    13. Lufttørre pellet i 15 min.
    14. Brug pillet i 20 μL RNasefrit vand igen og overføres til et nyt rør.
    15. Vask det tomme rør med yderligere 20 μL vand for at maksimere RNA-genvinding og pool med de første 20 μL volumen.
    16. Kvantificer det samlede RNA med et spektrofotometer og vurder RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  2. Fra viruspartikler: RNA-ekstraktion med søjlebaseret viralt RNA-ekstraktionssæt
    BEMÆRK: RNA-udvinding fra viruspartikler med phenolbaseret reagens resulterer i lavkvalitets viral RNA og i biblioteker af lavere kvalitet. En kolonnebaseret RNA-udvinding bør derfor favoriseres. RNA-ekstraktionssæt, der anvender bærer RNA til RNA-udløsning og nyttiggørelse, er ikke egnede til denne procedure og bør undgås. Da HIV RNA er poly-Adenyleret, er direkte RNA-udvinding uden yderligere mRNA-isolering tilstrækkelig til at komme ind i MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledningerne. Normalt 1-2 mL af viral supernatant fra universelt inficerede celler bør give nok RNA til at udføre hele arbejdsgangen.
    1. Klargør bufferen ved at tilføje 150 μL beta-mercaptoethanol til 30 mL lysis buffer. Rekonstituere Viral Wash Buffer ved at tilføje 96 mL af 100% ethanol.
    2. Saml virusholdige supernatanter og centrifuge til pelletcelleaffald for at minimere cellulær RNA-forurening.
    3. Overfør 1 mL viral supernatant til et 15 mL rør.
    4. Tilsæt 3 mL viral RNA Buffer til 1 mL viral prøve og blandes ved hvirvlende.
    5. Der overføres 700 μL prøve i en kolonne, indsat i et opsamlingsrør.
    6. Centrifuge i 2 min ved 13.000 x g ved stuetemperatur.
    7. Kassér gennemstrømningen.
    8. Gentag de 3 foregående trin, indtil hele prøven er blevet behandlet, og derfor er alle RNA blevet fanget på den silicabaserede matrixkolonne.
    9. Der tilsættes 500 μL viral vaskebuffer til kolonnen.
    10. Centrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningen.
    11. Der tilsættes 200 μL viral vaskebuffer til kolonnen.
    12. Centrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømningen.
    13. Placer kolonnen i et tomt opsamlingsrør.
    14. Centrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved stuetemperatur for yderligere at kassere eventuelle resterende vaskebufferforurenende stoffer.
    15. Overfør forsigtigt kolonnen til et 1,5 mL rør.
    16. Der tilsættes 20 μL DNase/RNasefrit vand direkte til midten af søjlematrixen og centrifugen ved 10.000 x g for 30 s ved stuetemperatur.
    17. Tilsæt yderligere 10 μL DNase/RNase-fri vand direkte til midten af søjlematrixen og centrifugen igen i 30 s.
    18. Kvantificer det samlede RNA med et spektrofotometer og vurder RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
      BEMÆRK: RNA-ekstraktion kan udføres med enhver metode, hvis kvaliteten af det hentede RNA er højt, med et RNA-integritets-/kvalitetsnummer > 9. RNA i alt kan opbevares ved -80 °C indtil videre behandling.

3. mRNA Isolation ved poly-A-udvælgelse med Oligo(dT)25

BEMÆRK: På grund af tilstedeværelsen af stærkt methyleret ribosomal RNA i cellulære ekstrakter anbefales det stærkt at isolere poly-A RNA enten ved rRNA-udtømning eller fortrinsvis ved poly-A-positivt valg. Dette trin er valgfrit og bør kun udføres for cellulære RNA-prøver for at opnå sekventeringsresultater ved højere opløsning. Hvis man analyserer methylering af ikke-poly-adenylerede virale RNA'er, favorisere rRNA udtømning snarere end poly-A udvælgelse eller i sidste ende udføre analysen på den samlede RNA.

  1. Perle Forberedelse til poly-A Capture
    1. Resuspend oligo(dT)25 magnetiske perler lager hætteglas ved vortexing for >30 s.
    2. Overfør 200 μL magnetiske perler til et 1,5 mL rør. Forbered antallet af rør med magnetiske perler i henhold til den samlede mængde RNA-prøver, der skal behandles.
      BEMÆRK: Et rør med 200 μL Dynabead lageropløsning svarer til 1 mg perler og kan rumme en prøve på 75 μg af det samlede RNA.
    3. Placer rørene på en magnet i 1 min og kassér supernatanten. Fjern rørene fra magneten.
    4. Tilføj 1 mL bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 2 mM EDTA), og genbrug ved hvirvlende. Placer rørene på magneten i 1 min og kassér supernatanten. Fjern rørene fra magneten. Gentage.
    5. Brug de vaskede magnetiske perler i 100 μL bindingsbufferen igen.
  2. Samlet RNA-forberedelse
    1. Det samlede RNA fortyndes ved en endelig koncentration på 0,75 μg/μL med RNasefrit vand, hvilket svarer til 75 μg/100 μL.
      BEMÆRK: Hvis RNA er i en lavere koncentration, skal du fortsætte som beskrevet nedenfor uden at ændre mængderne.
    2. Aliquot den samlede RNA i flere rør ved dispensering 100 μL RNA prøve pr rør.
    3. Der tilsættes 100 μL bindingsbuffer til hver RNA-prøve.
    4. Opvarm det samlede RNA til 65 °C i 2 min for at forstyrre sekundære strukturer.
    5. Placer straks på is, indtil klar til at gå videre til næste trin.
      BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere alt efter antallet af prøver, der skal behandles, men må ikke overstige 1 time for at undgå RNA-nedbrydning.
  3. Poly-A-markering
    1. Til hvert RNA-rør (fra trin 3.2) tilsættes 100 μL af vaskede magnetiske perler (fra trin 3.1).
    2. Bland grundigt ved at pipetter op og ned og lad indbinding på et roterende hjul ved stuetemperatur i 15 min.
    3. Åbn alle rør, læg dem på magneten i 1 min, og fjern forsigtigt alt supernatanten.
    4. Genvind supernatanten i et nyt rør, og hold den til side til en anden runde RNA-opsamling (trin 3.3.14) for at forbedre poly-A-slutgenvinding.
    5. Røret fjernes fra magneten, og der tilsættes 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA). Bland ved pipetter forsigtigt 4 til 5 gange.
    6. Placer røret på magneten i 1 min og kassér supernatanten.
    7. Vasketrinnet gentages én gang (gentag trin 3.3.5 og 3.3.6).
    8. Tilsæt 20 μL iskold 10 mM Tris-HCl til elute poly-A RNA fra perlerne.
    9. Inkuberes ved 80 °C i 2 min.
    10. Placer røret på magneten, og overfør hurtigt supernatanten, der indeholder poly-A RNA'et, til et nyt RNasefrit rør. Læg røret på is.
    11. Elutionstrinnet (trin 3.3.8 til 3.3.10) gentages for at øge udbyttet.
    12. Vask de samme perler én gang med 200 μL vaskebuffer. Bland ved pipetter forsigtigt 4 til 5 gange.
    13. Placer på magneten i 1 min og kassér vaskebuffer.
    14. Gennemstrømningen fra trin 3.3.4 til perlerne og proceduren gentages fra binding til elution (trin 3.3.2 til 3.3.10). Hold RNA eluates i separate rør for nu.
      BEMÆRK: Eventuelt skal supernatanten igen opbevares svarende til trin 3.3.4 i et nyt rør, da det kan bruges som kontrol. Ved procedurens afslutning renses og koncentreres RNA'et efter ethanoludfældning eller med en kolonnebaseret valgmetode (dvs. RNA ren og koncentrator). Denne prøve svarer til en poly-A-udtømt RNA-prøve og kan anvendes som kontrol for bisulfitkonvertering (trin 8.2.2).
    15. Kvantificer den eluterede RNA med et spektrofotometer og hold en 2 μL aliquot for yderligere at vurdere RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
      BEMÆRK: Poly-A RNA kan opbevares ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.

4. RNA-arbejdsgang

  1. Del de cellulære poly-A RNA (mRNA) og virale RNA prøver i 2 aliquots, dedikeret til den respektive epitranscriptomic analyse pipeline:
    i) 5 μg cellulær mRNA eller 1 μg viral RNA til MeRIP-Seq og inputkontroller (gå til trin 5 til 7 og trin 9).
    ii) 1 μg cellulær mRNA eller 500 ng viral RNA for BS-Seq (gå til trin 8 og 9).

5. RNA Fragmentering

BEMÆRK: RNA-fragmentering udføres med RNA-fragmenteringsreagenset og er beregnet til MeRIP-Seq og kontrol af RNA-prøver. Dette er et meget vigtigt skridt, der kræver omhyggelig optimering for at opnå fragmenter, der spænder mellem 100-200 nt.

  1. Den samlede mængde mRNA opdeles i 0,2 mL PCR-rør med 18 μL mRNA/rør.
    BEMÆRK: Arbejd hurtigt. Må ikke arbejdes med mere end 8 prøver ad gangen for at få reproducerbare resultater. Opskalering af volumen vil ikke garantere en reproducerbar og ensartet fragmentering.
  2. Varm en termocykel op ved 70 °C.
  3. Der tilsættes 2 μL fragmenteringsreagens på kanten af hvert PCR-rør.
  4. Luk røret og drej ned (så reagenset kommer i kontakt med RNA på samme tid for de 8 rør).
  5. Prøverne inkuberes 15 min ved 70 °C i termocyklussen.
  6. Så snart inkubationen er overstået, tilsættes hurtigt 2 μL Stop-opløsning i hvert rør.
  7. Drej ned og lad sidde på is, indtil klar til at gå videre til næste trin.
    BEMÆRK: Inkubationstiden kan variere alt efter antallet af prøver, der skal behandles, men må ikke overstige 1 time for at undgå RNA-nedbrydning.
  8. Gentag proceduren for alle prøverne (hvis der er mere end 8 aliquots).
  9. Pool rørene sammen og gå videre til RNA rensning med en RNA ren og koncentrator Kit (trin 6) eller enhver tilpasset kolonne-baseret kit til at slippe af med buffere og inddrive rene fragmenterede RNA i vand.

6. RNA Rensning

BEMÆRK: Dette trin kan udføres ved ethanoludfældning eller med enhver form for kolonnebaseret RNA-rensnings- og koncentrationsmetode (dvs. RNA Clean and Concentrationor).

  1. Eluter eller genanvende det rensede RNA i et samlet volumen på 50-75 μL DNase/RNasefrit vand.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes en kolonnebaseret metode, anbefales to runder af elution kraftigt for at sikre maksimal genopretning.
  2. Kvantificer det rensede fragmenterede mRNA med et spektrofotometer og vurder RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  3. Hold 100 ng fragmenteret mRNA som inputkontrol til biblioteksforberedelse og sekventering (gå til trin 9). Det resterende fragmenterede mRNA (minimum 2,5 μg) kan anvendes til MeRIP (gå til trin 7.2).

7. MeRIP

BEMÆRK: Der kræves mindst 2,5 μg fragmenteret mRNA for hver immunprecipitation (IP), enten ved hjælp af et specifikt antistof mod M6A (testtilstand) eller ved hjælp af et anti-IgG-antistof (negativ kontrol).

  1. Magnetisk perle forberedelse til immunprecipitation
    1. For hver prøve skal der fremstilles 4 mL 1x IP-buffer i et nyt konisk rør ved at fortynde 800 μL mRNA IP buffer 5x (50 mM Tris-HCl pH pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630 og nucleasefrit vand) med 3,2 mL nucleasefrit vand.
      BEMÆRK: Der er behov for mindst 2 reaktioner (en test og en IgG-kontrol).
    2. Læg røret på is.
    3. Det relevante antal 1,5 mL mikrocentrifugrør mærkes for antallet af ønskede IP-reaktioner:
      n rør (test) for anti-m6A antistof.
      n rør (negativ kontrol) til Normal Mouse IgG.
    4. Brug de magnetiske perler (f.eks. Magna ChIP Protein A/G) ved at vende og hvirvle. Ingen klumper af perler bør være synlige.
    5. For hver planlagt reaktion overføres 25 μL magnetiske perler til et mikrocentrifugerør.
    6. Der tilsættes ti gange mere 1x IP-buffer (fra trin 7.1.1) med hensyn til den oprindelige mængde anvendte perler (dvs. 250 μL af 1x IP-buffer pr. 25 μL magnetiske perler).
    7. Bland perlerne ved forsigtigt at pipetter op og ned flere gange for fuldstændig resuspension.
    8. Placer røret på den magnetiske separator i 1 min.
    9. Fjern og kassér supernatanten, og sørg for ikke at aspirere nogen magnetiske perler. Fjern røret fra magneten.
    10. Vasketrinnet gentages (trin 7.1.6 til 7.1.9).
    11. Resuspend perlerne i 100 μL af 1x IP Buffer pr 25 μL af oprindelige volumen af magnetiske perler.
    12. Der tilsættes 5 μL antistof (1 μg/μL) pr. 25 μL af den oprindelige mængde magnetiske perler.
      n rør (reage) med anti-m6A antistof (klon 17-3-4-1) [1 μg/μL].
      n rør (negativ kontrol) med Normal Mouse IgG (1 μg/μL).
    13. Inkuber på det roterende hjul i 30 minutter ved stuetemperatur for at tillade bøjning af antistofferne med de magnetiske perler.
    14. Placer røret på den magnetiske separator i 1 min. Kassér supernatanten. Røret fjernes fra magneten, og brug antistofperleblandingen i 100 μL af 1x IP Buffer.
  2. RNA Immunprecipitation (RIP)
    1. Der fremstilles 500 μL RIP-reaktionsblanding for hver 2,5 μg mRNA-prøve som følger: 2,5 μg i 100 μL fragmenteret RNA (fra trin 6.12) 295 μL nucleasefrit vand 5 μL af 40 U/μL RNase-hæmmer og 100 μL af 5x IP-buffer.
    2. Der tilsættes 500 μL RIP-reaktionsblanding til hver antistofperleblanding (~100 μL fra trin 7.1.14). Bland ved forsigtigt pipettering flere gange for helt at genbruge perlerne. Læg dig på is.
    3. Inkuber alle RIP-rør på et roterende hjul i 2 timer ved 4 °C.
    4. Centrifuge MeRIP reaktioner kort at spinde ned flydende dråber fra hætten og rørsiderne. Placer rørene på en magnetisk separator i 1 min.
    5. Overfør supernatanten i et nyt centrifugerør, pas på ikke at forstyrre de magnetiske perler .
      BEMÆRK: Flowthrough kan holdes som kontrol for at kontrollere RIP-effektiviteten (gå til trin 7.3.9).
    6. Fjern rør fra magneten. Vask perlerne ved at tilføje 500 μL kold 1x IP buffer. Bland perlerne ved forsigtigt pipettering flere gange for helt at genbruge perlerne.
    7. Placer rørene på en magnetisk separator i 1 min og kassér supernatant.
    8. Vaskeproceduren gentages (trin 7.2.6-7.2.7) to gange for i alt 3 vaske.
    9. Læg rørene på is og fortsæt straks til elution.
  3. Eluering
    1. 20 mM m6A opløsning ved at opløse 10 mg N6-Methyladenosin, 5′-monophosphat natriumsalt (m6A) i 1,3 mL nukleasefrit vand. 150 μL aliquots og opbevares ved -20 °C.
    2. For hver prøve (test og kontrol): Klargør 225 μL elutionsbuffer ved blanding af følgende komponenter: 45 μL 5x IP Buffer, 75 μL på 20 mM m6A, 3,5 μL på 40U/μL RNase Inhibitor og 101,5 μL nucleasefrit vand.
    3. Der tilsættes 100 μL elutionbuffer (fra trin 7.3.2) til perlerne (fra trin 7.2.9). Bland ved forsigtigt pipettering flere gange for helt at genbruge perler.
    4. Inkuberes alle rør i 1 time med kontinuerlig rysten på en rocker ved 4 °C.
    5. Centrifuge RIP reaktioner kort at spinde ned flydende dråber fra hætten og rør sider. Placer rørene på en magnetisk separator i 1 min.
    6. Supernatanten, der indeholder eluterede RNA-fragmenter, overføres til et nyt 1,5 mL mikrocentrifugerør. Pas på ikke at aspirere perlerne, da det vil øge baggrundsstøj.
    7. Gentagne elutionstrin (7.3.3 til 7.3.6) ved igen at tilsætte 100 μL elutionbuffer, inkubere 1 h ved 4 °C og opsamle eluatet efter magnetisk adskillelse.
    8. Kombiner alle eluater fra samme prøve (den samlede elutionsvolumen skal være 200 μL).
    9. Rense det eluterede RNA og gennemstrømningen (valgfrit, fra trin 7.2.5) ved ethanoludfældning eller ved hjælp af en kolonnebaseret valgfri metode (dvs. RNA Clean and Concentrationor).
    10. Vurder RNA-mængden og kvaliteten af gennemstrømningsprøver og eluterede prøver med en fragmentanalysator ved hjælp af et højfølsomt detektionssæt. Hvis kvaliteten af RNA er tilfredsstillende, skal du gå videre til biblioteksforberedelse og sekventering med høj kapacitet (trin 9).
      BEMÆRK: Mængden af RNA hentet på MeRIP er meget lav, og kræver imperativt høj følsomhedsdetekteringssæt for at sikre kvantificering. Hvis der ikke er nogen bioanalyzer tilgængelig, er det muligt at gå blindt til biblioteksforberedelse.

8. RNA Bisulfit Konvertering

  1. Kontrol og reagens forberedelse
    1. ERCC mix spike-in control: Tilføj ERCC mix efter producentens anvisninger, som anbefaler tilsætning af 0,5 μL ufortyndet ERCC mix til 500 ng mRNA. Denne kontrol kan bidrage til at vurdere effektiviteten af bisulfitkonvertering.
    2. Spike Poly-A-udtømt RNA (fra trin 3.3.14) ved et forhold 1/1000 (dvs. 500 pg poly-A-udtømt RNA til 500 ng mRNA). Denne prøve er beriget med ribosomale RNA og bør således indeholde 28S rRNA, en positiv kontrol for bisulfitkonvertering.
      BEMÆRK: Total RNA kan også bruges som positiv kontrol i stedet for poly-A-udtømt RNA.
    3. Udfør bisulfitkonvertering med et RNA-methyleringssæt (f.eks. Zymo EZ).
    4. RNA Wash Buffer: Tilsæt 48 mL 100% ethanol (eller 52 mL 95% ethanol) til 12 mL RNA Wash Buffer koncentrat før brug.
  2. Bisulfitkonvertering
    BEMÆRK: Bisulfitkonvertering blev udført med et kommercielt tilgængeligt RNA bisulfitkonverteringssæt efter producentens procedure som angivet nedenfor.
    1. I 0,2 mL PCR-rør tilsættes 1000 ng mRNA (eller mellem 300 og 1000 ng). Tilsættes spike-in-kontrol: 1 μL ERCC-blanding (trin 8.1.1) og 1000 pg poly-A-udtømt RNA (trin 8.1.2). Volumen op til 20 μL med DNase/RNase-fri vand.
    2. Der tilsættes 130 μL RNA-omdannelsesreagens til hver 20 μL RNA-prøve.
    3. Bland prøven ved at pipetter op og ned.
    4. Drej kortvarigt ned for at sikre, at der ikke er dråber i hætten eller siderne af røret.
    5. Placer PCR-rørene i en termisk cycler, og udfør følgende trin: denaturering ved 70 °C i 5 min. omdannelse ved 54 °C i 45 min gentagne denaturerings- og konverteringstrin for i alt 3 cyklusser og derefter holde på 4 °C på ubestemt tid.
      BEMÆRK: Tre cyklusser af denaturering og bisulfitkonvertering sikrer fuldstændig bisulfitkonvertering af prøven. Prøver kan opbevares ved -80 °C eller behandles direkte.
    6. Fortsæt med desulfonation i kolonnen. Placer en kolonne i et tomt opsamlingsrør, og tilsættes 250 μL RNA-bindingsbuffer til kolonnen.
    7. Prøven (~150 μL fra trin 8.2.5) hældes i den kolonne, der indeholder RNA-bindingsbufferen, og blandes ved at pipetter op og ned.
    8. Der tilsættes 400 μL 95-100% ethanol til prøve-RNA Binding Buffer blandingen i kolonnen. Luk hætten og bland straks ved at invertere kolonnen flere gange.
    9. Centrifuge ved fuld hastighed (≥ 10.000 x g) for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
    10. Der tilsættes 200 μL RNA Wash Buffer til kolonnen og centrifugen ved fuld hastighed i 30 s.
    11. Der tilsættes 200 μL RNA Desulphonation Buffer til kolonnen og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Efter inkubationen centrifuge ved fuld hastighed i 30 s. Kassér gennemstrømningen.
    12. Der tilsættes 400 μL RNA Wash Buffer til kolonnen og centrifugen ved fuld hastighed i 30 s. Gentag vasketrinnet med yderligere 400 μL RNA-vaskebufferen. Kassér gennemstrømningen.
    13. Centrifugere kolonnen i det tømte opsamlingsrør ved fuld hastighed i 2 min. Overfør kolonnen til et RNase-frit rør.
    14. Der tilsættes ≥ 10 μL DNase/RNasefrit vand direkte til søjlematrixen, og inkuber i 1 minut ved stuetemperatur. Centrifuge ved fuld hastighed i 30 s.
      BEMÆRK: Vi plejer at stikke af i et volumen på 20 μL. Den eluterede RNA kan anvendes med det samme eller opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder. For langtidsopbevaring skal du holde ved -80 °C.
    15. Tag 2,5 μL ud til fragmentanalysatorvurdering af RNA-kvalitet og -mængde, og fortsæt til biblioteksforberedelse og sekventering med høj kapacitet (trin 9).
    16. Der skal være 4 μL konverteret RNA til bisulfitkonverteringskontrol af effektivitet (trin 8.3).
  3. Bisulfitkonverteringskontrol af RT-PCR
    BEMÆRK: Dette trin sikrer, at bisulfitkonverteringen lykkedes, før du fortsætter med at sekventere . 28S ribosomale RNA fra Homo sapiens vil blive brugt som positiv kontrol for RNA methylering analyse, som C restkoncentrationen på position 4447 (GenBank tiltrædelse # NR_003287) er blevet beskrevet som værende 100% methyleret.
    Primersekvenser:
    H 28SF primer: 5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTGATTTTTTTTGGG-3'
    H 28SR primer: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
    1. Forbered reverse transskription (RT) reaktion mix ved hjælp af en høj kapacitet cDNA Reverse Transskription Kit. Optø kitkomponenterne på is og forbered RT master mix på is som følger:
      4 μL bisulfitomerede RNA (fra trin 8.2.14):
      2 μL af 10xRT Buffer
      0,8 μL af 25x dNTP Mix [100 mM]
      2 μL af 10x RT Tilfældige primere
      1 μL af MultiScribe Reverse Transcriptase
      1 μL RNase-hæmmer
      9,2 μL nucleasefri H2O
      BEMÆRK: Hver RT-reaktion skal indeholde et slutvolumen på 20 μL i 0,2 mL PCR-rør.
    2. Sæt rørene i termocyklussen med følgende RT-program: 25 °C i 10 min; 37 °C i 120 min; 85 °C i 5 min; derefter ved 4 °C på ubestemt tid.
    3. Forbered PCR-reaktionen for at forstærke specifikt 28S rRNA med et PCR-korrekturlæsningsenzym. Optø kitkomponenterne på is, hvirvel forsigtigt og kort centrifuge. Klargør PCR master mix på is eller på en iskold metalpladeholder som følger:
      0,6 μL på 10 μM H 28SF primer
      0,6 μL på 10 μM H 28SF primer
      6,5 μL af skabelonen cDNA
      22,5 μL DNA Polymerase master mix
      BEMÆRK: Hver PCR-reaktion skal indeholde et slutvolumen på 20 μL i 0,2 mL PCR-rør.
    4. Sæt rørene i termocyklussen med følgende PCR-program: indledende denaturering ved 95 °C i 5 min; 45 denatureringscyklusser (95 °C for 15 s), udglødning (57 °C i 30 s) og forlængelse (72 °C for 15 s), endelig forlængelse ved 72 °C i 10 min og derefter ved 4 °C på ubestemt tid.
    5. Kør 10 μL af reaktionen på en 2% agarosegel. Den forventede båndstørrelse er 130 - 200 bp.
  4. Rækkefølge af PCR-produkter
    1. Rense PCR-produkterne med en kolonnebaseret valgte metode til at fjerne enzymer og dNTP-rester og fjerne det forstærkede DNA i mindst 20 μL DNase/RNasefrit vand.
    2. Kvantificer det rensede DNA med spektrofotometer.
    3. Sekventering reaktion
      1. Brug 40 ng PCR-produkt/sekventeringsreaktion.
      2. Sekvens i begge retninger med H 28SF og H 28SR primere.
      3. Juster sekvenserne med den kendte ikke-konverterede sekvens (28S ribosomal N5 (RNA28SN5). Kontroller, om der er en C-rest i position C4447, og for T-rester i stedet for C andre steder.

9. Biblioteksforberedelse og sekventering med høj kapacitet

  1. Forbered biblioteker til sekventering ved hjælp af mRNA-sæt (f.eks. Illumina TruSeq Stranded), start af protokollen ved Elute-Prime-Fragment-trinnet og følger producentens anvisninger.
    1. For de tilførselsprøver, der er tilførsel, inkuberes prøverne dog ved 80 °C i 2 min til kun at prime, men ikke yderligere fragmentere dem.
  2. Udfør sekventering ved hjælp af Illumina platforme. Sekventering reaktioner kan udføres i henhold til præferencer og eksperimentelle design, enten enkelt eller parret ender, med mindst 100 nt længde.

10. Bioinformatik analyser

  1. m6A databehandling
    1. Kør FASTQC24 for at vurdere læsekvaliteten i m6A og indtaste FASTQ-filer fra sekventering.
    2. Kør Atropos25 for at trimme slut- og adaptersekvenser af lav kvalitet fra læserne. Angiv følgende parametre i kørsel af Atropos.
      1. Fjern følgende adaptersekvenser: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT.
      2. Brug følgende Phred kvalitet cutoff: 5, til trimning af lav kvalitet ender som angivet af producenten (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. Brug følgende minimum læselængde efter trimning: 25 basispar.
    3. Flet GRh38 humant genom og HIV [Integreret lineær pNL4-3Env-GFP] reference i FASTA-format.
    4. Indekser den flettede reference med HISAT226.
    5. Kør HISAT2 på trimmede aflæsninger for at tilpasse sig den indekserede reference. Brug hisat-standardparametre.
    6. Sortere og indeksere de justerede aflæsninger med SAMtools27.
    7. Kør SAMtools stat og Qualimap 228, for kvalitetskontrol efter justering af de sekvenserede biblioteker.
    8. Du kan også indsamle og opsummere kvalitetsmål fra det foregående trin med multiQC29.
    9. HIV-genom har homologe 634 bp sekvenser i 5 'LTR og 3' LTR: Omformulere multimapping læser fra 5 'LTR til den tilsvarende 3 'LTR region med SAMtools.
    10. For at identificere m6A toppe, køre peak opkald software MACS230 (v 2.1.2). Vælg omhyggeligt MACS2-løbeparametre for at sikre korrekt funktion på RNA-Seq-data, da peak calling kan påvirkes af genekspressionsniveau, og korte exons kan blive fejlagtigt kaldt som toppe. Inputsignalet skal derfor trækkes fra m6A-signal, uden at MACS2 rutinemæssigt anvender udjævning på DNA-baserede data. Anvend følgende parametre på underkommandoen 'callpeak' fra MACS2:
      -keep-dup auto (styrer MACS2 adfærd i retning af dublerede læser, 'auto' tillader MACS at beregne det maksimale antal aflæsninger på nøjagtig samme sted baseret på binomial distribution ved hjælp af 1e-5 som p-værdi cutoff)
      -g 2,7e9 (størrelsen af det menneskelige genom i bp)
      -q 0,01 (minimum FDR cutoff at kalde betydelige toppe)
      -nomodel (til at omgå bygningen af den skiftende model, som er skræddersyet til ChIP-Seq eksperimenter)
      -slocal 0
      -llocal 0 (indstilling af dette og den tidligere parameter til 0 tillader MACS2 at trække direkte, uden udjævning, input læser fra m6A læser)
      -extsize 100 (gennemsnitlig længde af fragmenter i bp)
      -B
    11. Kør differential peak opkald underkommando af MACS2, 'bdgdiff' for at sammenligne inficerede vs ikke-inficerede prøver. 'bdgdiff' tager som indgange bedGraph filer genereret af 'callpeak' i det foregående trin. For hver gang skal du foretage sammenligningen af inficerede versus ikke-inficerede prøver med 'bdgdiff', trække det respektive indgangssignal fra m6A-signalet og angive de yderligere parametre: -g 60 -l 120.
  2. m5C databehandling
    1. Kør Cutadapt31 for at trimme adaptersekvenser fra de rå læser med følgende parametre:
      adapter "AGATCGGAAGAGCACGTCTGAAC"
      -minimum-længde=25.
    2. Vend-supplere de trimmede aflæsninger ved hjælp af seqkit32, som sekventering protokollen producerer aflæsninger fra den omvendte streng.
    3. Kør FastQC for at undersøge læsekvaliteten.
    4. Flet GRh38 humant genom og HIV [Integreret lineær pNL4-3Env-GFP] reference i FASTA-format.
    5. Indeks den flettede reference med ansøgningen meRanGh fra meRanTK-pakken33.
    6. Juster med meRanGh med følgende parametre:
      -FN gør det muligt at skrive ikke-tilknyttede læsninger til outputfiler
      -MM, der gør det muligt at skrive flere tilknyttede læsninger til outputfilen
      -bg til output i sengenGraph
      -mbgc 10 filter rapporteret område efter dækning (mindst 10 læser af dækning)
    7. Hiv-genomet har homologe 634 bp sekvenser i 5 'LTR og 3'LTR: justere multimapping læser fra 5 'LTR til den tilsvarende 3 'LTR region med SAMtools.
    8. Kør methyleringsopkald via meRanCall-værktøjet, leveret af meRanTK, med følgende parametre:
      -rl = 126, læselængde
      -ei = 0,1, fejlinterval for methyleringshastigheden p-værdiberegning
      -cr = 0,99, forventet konvertering
    9. Kør MeRanTK's estimateSizeFactors.pl til estimering af størrelsesfaktorer for hver prøve. Størrelsesfaktorerne vil blive brugt som parametre i næste trin.
    10. Kør MeRanCompare for differential methylering analyse af ikke-inficerede vs inficeret på tværs af tid punkter 12, 24, og 36h. Følgende parametre anvendes: en signifikansværdi på 0,01 som den minimale tærskel for rapporterings- og størrelsesfaktorer fra forrige trin.

Representative Results

Denne arbejdsgang har vist sig nyttig til at undersøge den rolle, m6A og m5C methylering i forbindelse med hiv-infektion. Til dette brugte vi en CD4 + T-cellelinjemodel (SupT1), som vi enten inficerer med hiv eller venstre ubehandlet. Vi startede arbejdsgangen med 50 millioner celler pr. betingelse og opnåede i gennemsnit 500 μg af det samlede RNA med et RNA-kvalitetstal på 10 (figur 1A-B). Ved poly-A udvælgelse hentede vi mellem 10 og 12 μg mRNA pr. betingelse (svarende til ca. 2% af det samlede RNA) (figur 1B). På dette tidspunkt brugte vi 5 μg poly-A-udvalgte RNA til MeRIP-Seq-rørledningen og 1 μg til BS-Seq-rørledningen. Da HIV RNA er poly-adenyleret, er der ikke behov for yderligere foranstaltninger, og MeRIP-Seq- og BS-Seq-procedurer kan anvendes direkte.

Figure 1
Figur 1: RNA-klargøring til downstream-applikationer. A) Workflow, der skildrer RNA-forberedelse og -distribution til samtidige MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledninger. Hver udfyldt sekskantet form repræsenterer en RNA-ændringstype, f.eks. Mængden af RNA-materiale, der er nødvendigt for at udføre eksperimentet, er angivet. B) Repræsentative resultater, der viser forventede RNA-distributionsprofiler (størrelse og mængde) ved den samlede RNA-udvinding (øverste panel) og poly-A-markering (nederste panel). Prøverne blev indlæst på fragmentanalysator med standardfølsomhedssæt for at vurdere RNA-kvaliteten, før der blev indtastet specifikke MeRIP-Seq- og BS-Seq-procedurer. RQN: RNA-kvalitetsnummer; nt: nukleotider. Klik her for at se en større version af dette tal.

MeRIP-Seq pipeline er en RNA immunprecipitationsbaseret teknik, der gør det muligt at undersøge m6A-modifikation langs RNA-molekyler. Til dette er RNA først fragmenteret og derefter inkuberet med m6A-specifikke antistoffer koblet til magnetiske perler til immunprecipitation og opsamling. MeRIP-berigede RNA-fragmenter og den uberørte (input)brøk sorteres derefter og sammenlignes med identifikation af m6A-modificerede RNA-områder og dermed m6A-methylerede udskrifter (figur 2A). Løsningen af teknikken afhænger af effektiviteten af RNA fragmentering. Kortere fragmenter giver faktisk mulighed for en mere præcis lokalisering af m6A-restkoncentrationen. Her blev cellulære poly-A-udvalgte RNA'er og virale RNA'er udsat for ionbaseret fragmentering med RNA-fragmenteringsbuffer i løbet af 15 min i et 20 μL-endeligt volumen for at opnå RNA-fragmenter på 100-150 nt. Begyndende med 5 μg mRNA genvandt vi 4,5 μg fragmenteret RNA, svarende til en genopretningshastighed på 90% (figur 2B). Vi brugte 100 ng fragmenteret, renset RNA som input kontrol, udsat direkte for bibliotek forberedelse og sekventering. Den resterende RNA (~4,4 μg) blev behandlet i henhold til MeRIP-Seq-rørledningen, som starter med inkubation af fragmenteret RNA med perler bundet enten til anti-m6A specifikke antistoffer eller til anti-IgG antistoffer som kontrol. m6A-specifik RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmenteret RNA gjorde det muligt at hente ca. 15 ng m6A-beriget materiale, der gennemgik biblioteksforberedelse og sekventering (figur 2B). RIP med anti-IgG-kontrol gav som forventet ikke nok RNA til at muliggøre yderligere analyse (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Skematisk repræsentation af MeRIP-Seqs arbejdsgange og inputstyring. Ved poly-A-udvælgelse blev prøverne fragmenteret i 120-150 nt stykker og, enten direkte udsat for sekventering (100 ng, inputkontrol) eller anvendt til RNA-immunprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A specifikt antistof eller anti-IgG-antistof som negativ kontrol før sekventering. B) Repræsentative resultater, der viser forventede RNA-distributionsprofiler (størrelse og beløb) ved fragmentering (øverste panel) og RIP (underpaneler, MeRIP: venstre, IgG-kontrol: højre). Prøver blev indlæst på fragment analysator til at evaluere RNA kvalitet og koncentration før yderligere behandling til biblioteket forberedelse og sekventering. Fragmenteret RNA-analyse blev udført ved hjælp af RNA-standardfølsomhedssættet, mens immunprecipiterede RNA brugte højfølsomt sæt. Klik her for at se en større version af dette tal.

BS-Seq rørledning tillader udforskning af m5C RNA modifikation ved nukleotidopløsning og fører til identifikation af m5C-methylerede udskrifter. Ved bisulfitkonvertering omdannes ikke-methylerede cytosiner til uracil, mens methylerede cytosiner forbliver uændrede (figur 3A). På grund af de barske forhold i bisulfitkonverteringsproceduren (dvs. høj temperatur og lav pH)) er konverterede mRNAs stærkt nedbrudte (figur 3B), men dette forstyrrer ikke biblioteksforberedelse og sekventering. Bisulfitkonvertering er kun effektiv på enkeltstrenget RNA og kan således potentielt hæmmes af sekundære dobbeltstrengede RNA-strukturer. For at evaluere effektiviteten af C-U-konvertering introducerede vi to kontroller. Som en positiv kontrol udnyttede vi den tidligere beskrevne tilstedeværelse af en stærkt methyleret cytosin i position C4447 af 28S rRNA23. Ved RT-PCR forstærkning og sekventering af et 200 bp fragment omkring methylerede sted kunne vi observere, at alle cytosiner med succes blev konverteret til uracils og derved fremstår som thymidiner i DNA-sekvensen, undtagen cytosin i position 4447, der forblev uændret. Som en kontrol for bisulfitkonverteringsfrekvens brugte vi kommercielt tilgængelige syntetiske ERCC RNA-sekvenser. Denne blanding består i en pulje af kendte, ikke-methylerede og poly-adenylerede RNA sekvenser, med en række sekundære strukturer og længder. Ved biblioteksforberedelse og sekventering fokuserede vi på disse ERCC-sekvenser for at beregne konverteringsfrekvensen, som kan udføres ved at tælle antallet af konverterede C blandt de samlede C-rester i alle ERCC-sekvenser og i hver prøve. Vi opnåede en konverteringsfrekvens på 99,5%, hvilket bekræftede effektiviteten og succesen af bisulfitkonverteringsreaktionen (figur 3D).

Figure 3
Figur 3: BS-Seq-rørledningen. A) Skematisk repræsentation af arbejdsgangen BS-Seq. Ved poly-A-udvælgelse udsættes prøver for bisulfit, hvilket resulterer i C til U-konvertering (på grund af deaminering) for ikke-methylerede C-rester. I modsætning hertil påvirkes methylerede C-rester (m5C) ikke af bisulfitbehandling og forbliver uændrede. B) Repræsentativt resultat af bisulfit konverteret RNA fordelingsprofil (størrelse og mængde) ved analyse på fragmentanalysator med et standardfølsomhedssæt. C) Elektropherogram, der viser repræsentativ sekventeringsresultat af RT-PCR-amplicon i området omkring 100% methyleret C ved position 4447 i 28S rRNA (fremhævet med blåt). I modsætning hertil blev C-rester af referencesekvensen identificeret som T-rester i ampliconsekvensen på grund af bisulfitkonverteringssucces. D) Evaluering af C-U-konverteringsfrekvens ved analyse af ERCC spike-in sekvenser i hiv-inficerede og ikke-inficerede celler. Den gennemsnitlige konverteringsfrekvens er på 99,5%. Klik her for at se en større version af dette tal.

M6A-berigede prøver, bisulfitomerede prøver og inputkontroller behandles yderligere til biblioteksforberedelse, sekventering og bioinformatisk analyse (figur 4). Ifølge det eller de eksperimentelle design og biologiske spørgsmål, der behandles, kan der anvendes flere bioinformatiske analyser. Som bevis for princippet her viser vi repræsentative resultater fra en potentiel anvendelse (dvs. differential methyleringsanalyse), der fokuserer på identifikation af differentieret methylerede udskrifter induceret ved hiv-infektion. Kort, vi undersøgte m6A eller m5C methylering niveau af udskrifter, uafhængigt af deres genekspressionsniveau, i både ikke-inficerede og HIV-inficerede celler, for yderligere at forstå den rolle, RNA methyleringer under viral livscyklus. Ved genekspression normalisering, vi identificeret, at ZNF469 udskrift var differentieret m6A-methyleret i henhold til infektionen status, ja denne udskrift var ikke methyleret i ikke-inficerede celler, mens det viste flere methylerede toppe på HIV-infektion (Figur 5A). En lignende differential methyleringsanalyse på m5C viste, at PHLPP1-udskriften indeholdt flere methylerede rester, som har tendens til at være hyppigere methyleret i HIV-tilstanden (figur 5B). I denne sammenhæng tyder begge analyser på, at hiv-infektion påvirker det cellulære epitranscriptom.

Figure 4
Figur 4: Skematisk repræsentation af den bioinformatiske arbejdsgang til analyse af m6A- og m5C-data . Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på differentieret methylerede udskrifter ved infektion. A) Repræsentativt resultat, der viser m6A methylering af ZNF459 udskrift i HIV-inficerede (grønne) og ikke-inficerede (grå) celler. Peak intensitet (ved input udtryk subtraktion) er vist på y-aksen og position i kromosomet langs x-aksen. Differential methylering analyse afslører, at ZFN469 udskrift er hypermethylated på HIV-infektion. B) Repræsentativt resultat af m5C methyleret gen i HIV-inficerede (øvre bane) og ikke-inficerede (nedre bane) celler. Højden af hver bjælke repræsenterer antallet af aflæsninger pr. nukleotid og giver mulighed for dækningsvurdering. Hver C-rest i repræsenteret i rødt, og andelen af methyleret C er repræsenteret i blåt. Den nøjagtige methyleringshastighed (%) rapporteres over hver C-rest. Pile fremhæver statistisk signifikant differentieret methyleret C. Prøver blev visualiseret ved hjælp af IGV viewer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

RNA-modifikationernes rolle i virusinfektion er stadig stort set ukendt. En bedre forståelse af epitranscriptomiske modifikationers rolle i forbindelse med virusinfektion kan bidrage til at finde nye antivirale behandlingsmål.

I dette arbejde leverer vi en komplet arbejdsgang, der gør det muligt at undersøge m6A og m5C epitranscriptomes af inficerede celler. Afhængigt af det biologiske spørgsmål anbefaler vi at bruge poly-A-udvalgte RNA som udgangsmateriale. Selvom det er valgfrit, da rørledningen kan bruges med total RNA, er det vigtigt at huske på, at rRNAs samt små RNA'er er stærkt modificerede og indeholder et vigtigt antal methylerede rester. Dette kan resultere i en nedsat kvalitet og mængde meningsfulde sekventeringsdata.

Hvis undersøgelsens fokus imidlertid er ikke-poly-adenyleret RNA, bør RNA-ekstraktionstrinnet tilpasses for at undgå at kassere små RNA -tegn (i tilfælde af kolonnebaseret RNA-udvinding) og for at privilegere ribosomudtømningsteknikker i stedet for poly-A-udvælgelse for at komme ind i rørledningen.

For at sikre høj kvalitet RNA, korrekt fragmentering og egnet m6A-beriget og BS konverteret RNA kvalitet til bibliotek forberedelse vi kraftigt råde til at bruge et fragment analysator eller en bioanalyzer. Dette udstyr er dog ikke altid tilgængeligt. Som et alternativ kunne kvaliteten af RNA, mRNA og størrelsen af fragmenteret RNA også vurderes ved visualisering på agarosegel. Alternativt kan biblioteksforberedelse udføres uden forudgående vurdering af RNA-mængde.

Vi brugte den antistofbaserede MeRIP-Seq16-teknik til at udforske det m6A epitranscriptomiske landskab. Denne teknik er baseret på RNA immunprecipitation og er vellykket; Nogle trin kræver dog omhyggelig optimering og kan være kritiske. Selv om m6A methylering er blevet beskrevet til at forekomme primært inden for konsensus sekvens RRA * CH, dette motiv er meget hyppig langs mRNA molekyler og tillader ikke præcis identifikation af methyleret sted. Det er derfor afgørende at opnå en reproducerbar og konsekvent RNA-fragmentering, der genererer små RNA-fragmenter, for at forbedre den RIP-baserede opløsning. I denne protokol anbefaler vi en optimeret procedure, der giver reproducerbare og konsekvente resultater i vores eksperimentelle indstilling; Dette fragmenteringstrin kan dog kræve yderligere optimering i henhold til specifikke eksempelfunktioner.

For nylig en ny teknik, der tillader m6A direkte sekventering blev beskrevet. Den er baseret på brugen af specifikke omvendte transskriptasevarianter, der udviser unikke RT-signaturer som svar på at støde på m6A RNA-modifikation24. Denne teknologi, ved omhyggelig optimering, kunne omgå den store begrænsning står over for MeRIP-Seq (faldende mængden af indledende materiale og giver en højere opløsning). For at udforske m5C-modifikationen besluttede vi at bruge bisulfitkonverteringsteknikken til ved nukleotidopløsning at opdage de modificerede C-rester. For at reducere den falske positive sats på grund af tilstedeværelsen af RNA sekundære strukturer udførte vi 3 cyklusser af denaturering / bisulfitkonvertering og yderligere kontrol bisulfitkonverteringsfrekvens takket være brugen af ERCC spike-in kontroller. En af de begrænsninger, der er forbundet med denne teknik er, at bisulfit konvertering er meget hård og tre cyklusser af denaturering / bisulfit konvertering kunne forringe nogle RNA og dermed reducere opløsningen. Men i vores indstilling valgte vi at nøjes med en potentielt lidt lavere opløsning for at øge kvaliteten af datasættet.

Takket være disse optimeringer og kontroller var vi i stand til at levere en pålidelig og sund arbejdsgang, der kan udnyttes til at undersøge det epitranscriptomiske landskab og dets ændring i forbindelse med virusinfektioner, værtspatogeninteraktioner eller enhver eksponering for specifikke behandlinger.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Swiss National Science Foundation (tilskud 31003A_166412 og 314730_188877).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx SuperMix Invitrogen 12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 Millipore MABE1006
Chloroform Merck 67-66-3
ERCC Invitrogen 4456740
EZ RNA Methylation Kit Zymo Research EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit Agilent DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit Agilent DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA Illumina 20020594
Magnetic Beads A/G Blend Merck 16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) Sigma Aldrich M2780-10MG
Normal Mouse IgG Merk 12371
Oligo(dT)25 Life Technologies 61005,
PCRapace Stratec 1020220300
Quick RNA Viral Kit Zymo Research 1034
RNA Clean & Concentrator Zymo Research R1015
RNA Fragmentation Reagent Ambion AM8740
RNase Inhibitor Ambion AM2684
Trizol TRIzol Reagent 15596026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Machnicka, M. A., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 262-267 (2013).
  2. Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).
  3. Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. SnapShot: Messenger RNA Modifications. Cell. 174 (2), 498 (2018).
  4. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  5. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).
  6. Netzband, R., Pager, C. T. Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).
  7. Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. Epitranscriptomic regulation of viral replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).
  8. Lichinchi, G., et al. Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells. Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).
  9. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  10. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).
  11. Tirumuru, N., Wu, L. HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).
  12. Tirumuru, N., et al. N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression. Elife. 5, (2016).
  13. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).
  14. Khoddami, V., Cairns, B. R. Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP. Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).
  15. Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).
  16. Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).
  17. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  18. Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (215), (2013).
  19. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  20. Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Applied & Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).
  21. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).
  22. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. biorxiv. 1 (11), (2021).
  23. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  24. Aschenbrenner, J., et al. Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing. Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).
  25. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2021).
  26. Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads. PeerJ. 5, 3720 (2017).
  27. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  28. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  29. Okonechnikov, K., Conesa, A., García-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), Oxford, England. 292-294 (2016).
  30. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), Oxford, England. 3047-3048 (2016).
  31. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet Journal. 17 (1), (2011).
  33. Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation. PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).
  34. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).

Tags

Biologi Udgave 181 Epitranscriptomics m6A m5C RNA modifikationer virus-værtsinteraktioner virusinfektioner HIV
Udforskning af <sup>m6A</sup> og <sup>m5C</sup> Epitranscriptomes om virusinfektion: et eksempel med HIV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cristinelli, S., Angelino, P.,… More

Cristinelli, S., Angelino, P., Ciuffi, A. Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV. J. Vis. Exp. (181), e62426, doi:10.3791/62426 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter