Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

حجم استبعاد الكروماتوغرافيا لتحليل الغشاء الخارجي البكتيري فيسيكلي التجانس

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62429
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

Summary

الحويصلات البكتيرية تلعب أدوارا هامة في الإمراض ولها تطبيقات التكنولوجيا الحيوية الواعدة. عدم التجانس من الحويصلات يعقد التحليل والاستخدام; لذلك ، من الضروري استخدام طريقة بسيطة قابلة للاستنساخ لفصل أحجام مختلفة من الحويصلات. هنا، ونحن نثبت استخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات غير المتجانسة التي تنتجها Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Abstract

يتكون جدار الخلية من البكتيريا السلبية الغرام من غشاء داخلي (السيتوبلازمي) والخارجي (OM)، مفصولة طبقة بيبتيدوغليكان رقيقة. طوال النمو ، يمكن للغشاء الخارجي أن يبلل لتشكيل حويصلات الغشاء الخارجي الكروي (OMVs). وتشارك هذه OMVs في العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك تسليم البضائع إلى الخلايا المضيفة والتواصل مع الخلايا البكتيرية. وفي الآونة الأخيرة، بدأ استكشاف الإمكانات العلاجية لمركبات OMVs، بما في ذلك استخدامها كلقاحات ومركبات لإيصال الأدوية. على الرغم من أن OMVs مشتقة من OM ، فقد كان من دواعي التقدير منذ فترة طويلة أن شحنة الدهون والبروتين في OMV تختلف ، في كثير من الأحيان بشكل كبير ، عن تلك الخاصة ب OM. وفي الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أدلة على أن البكتيريا يمكن أن تطلق أنواعا متعددة من OMVs، وتوجد أدلة على أن الحجم يمكن أن يؤثر على آلية امتصاصها من قبل الخلايا المضيفة. ومع ذلك، فإن الدراسات في هذا المجال محدودة بسبب الصعوبات في الفصل بكفاءة بين OMVs غير المتجانسة الحجم. وقد جرت العادة على استخدام أجهزة الطرد المركزي المتدرجة للكثافة لهذا الغرض؛ ومع ذلك، تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويصعب توسيع نطاقها. من ناحية أخرى ، فإن اللونيات استبعاد الحجم (SEC) أقل تعقيدا وتفسح المجال للارتقاء المستقبلي الضروري للاستخدام العلاجي ل OMVs. هنا، ونحن نصف نهج لجنة الأوراق المالية والبورصة التي تمكن من فصل استنساخها من الحويصلات غير متجانسة الحجم، وذلك باستخدام كحالة اختبار، OMVs التي تنتجها Aggregatibacter actinomycetemcomitans، والتي تتراوح في القطر من أقل من 150 نانومتر إلى أكثر من 350 نانومتر. نحن نظهر فصل OMVs "كبيرة" (350 نانومتر) و "صغيرة" (<150 نانومتر) OMVs، التي تم التحقق منها من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS). نوصي تقنيات قائمة على لجنة الأوراق المالية والبورصة على تقنيات المستندة إلى DGC لفصل الحويصلات غير متجانسة الحجم بسبب سهولة استخدامها، والاستنساخ (بما في ذلك المستخدم إلى المستخدم)، وإمكانية لتوسيع نطاق.

Introduction

البكتيريا السلبية الغرام إطلاق الحويصلات المستمدة من الغشاء الخارجي، ما يسمى الحويصلات الغشاء الخارجي (OMVs)، في جميع أنحاء النمو. هذه OMVs تلعب أدوارا هامة في الاتصالات بين الخلايا، سواء بين البكتيريا والمضيف وكذلك بين الخلايا البكتيرية، من خلال حمل عدد من الجزيئات الحيوية الهامة، بما في ذلك الحمض النووي / الحمض النووي الريبي، والبروتينات، والدهون، وpeptidoglycans1،2. على وجه الخصوص ، تم دراسة دور OMVs في الإمراض البكتيري على نطاق واسع بسبب تخصيبها في بعض عوامل الفوعة والسموم3و4و5و6و7و8و9و10و11.

وقد تم الإبلاغ عن OMVs لتتراوح في الحجم من 20 إلى 450 نانومتر، اعتمادا على البكتيريا الأم ومرحلة النمو، مع عدة أنواع من البكتيريا الإفراج عن OMVs غير متجانسة الحجم8،12،13،14،والتي تختلف أيضا في تكوين البروتين وآلية دخول الخلية المضيفة12. H. pylori صدر OMVs تتراوح في القطر من 20 إلى 450 نانومتر، مع OMVs أصغر تحتوي على تكوين البروتين أكثر تجانسا من OMVs أكبر. الأهم من ذلك، لوحظ أن اثنين من السكان من OMVs أن استيعابها من قبل الخلايا المضيفة عن طريق آليات مختلفة12. وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن Aggregatibacter actinomycetemcomitans تطلق مجموعة من OMVs صغيرة (<150 نانومتر) جنبا إلى جنب مع مجموعة كبيرة (>350 نانومتر) OMVs، مع OMVs تحتوي على كمية كبيرة من السم البروتين يفرز، leukotoxin (LtxA)15. في حين أن دور عدم التجانس OMV في العمليات الخلوية مهم بشكل واضح ، فإن الصعوبات التقنية في فصل وتحليل مجموعات متميزة من الحويصلات حدت من هذه الدراسات.

بالإضافة إلى أهميتها في الإمراض البكتيري ، تم اقتراح OMVs للاستخدام في عدد من التطبيقات الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات ومركبات توصيل الأدوية16و17و18و19و20. لاستخدامها في هذه النهج، مطلوب إعداد نظيفة وموحدة من الحويصلات. وبالتالي، فإن أساليب الفصل الفعالة والفعالة ضرورية.

الأكثر شيوعا، كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC) يستخدم لفصل مجموعات الحويكل غير متجانسة الحجم من الحطام الخلوي، بما في ذلك flagellae والبروتينات المفرزة21؛ كما تم الإبلاغ عن طريقة كنهج لفصل السكان الفرعي OMV غير متجانسة الحجم12،13،14. ومع ذلك، DGC تستغرق وقتا طويلا، غير فعالة، ومتغيرة للغاية من مستخدم إلى مستخدم22، وبالتالي، ليست مثالية لتوسيع نطاق. في المقابل، يمثل اللونيات استبعاد الحجم (SEC) نهجا قابلا للتطوير والكفاءة ومتسقا لتنقية OMVs21و23و24. لقد وجدنا أن طويلة (50 سم)، والجاذبية تدفق، عمود لجنة الأوراق المالية والبورصة، مليئة هلام الترشيح المتوسطة كافية لتنقية بكفاءة وفصل السكان الفرعيين من OMVs. على وجه التحديد، استخدمنا هذا النهج لفصل A. actinomycetemcomitans OMVs إلى مجموعات فرعية "كبيرة" و "صغيرة"، وكذلك لإزالة التلوث بالبروتين والحمض النووي. وقد تم الانتهاء من تنقية في أقل من 4 ساعة، وتم الفصل الكامل بين السكان الفرعيين OMV وإزالة الحطام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة

  1. لإعداد العازلة غسل ELISA، إضافة 3.94 غرام تريس قاعدة، 8.77 غرام NaCl، و 1 غرام ألبوم مصل البقري (BSA) إلى 1 لتر من الماء deionized (DI). إضافة 500 ميكرولتر بوليسوربات-20. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام HCl أو NaOH.
  2. لإعداد المخزن المؤقت للحجب، أضف 3.94 غرام من قاعدة Tris و8.77 g NaCl و10 g BSA. إضافة 500 ميكرولتر بوليسوربات-20 إلى 1 لتر من مياه DI. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام HCl أو NaOH.
  3. لإعداد العازلة elution (PBS)، إضافة 8.01 غرام NaCl، 2.7 g KCl، 1.42 غنا 2HPO4،و 0.24 غرام KH2PO4 إلى 1 L DI المياه. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام HCl أو NaOH.
    ملاحظة: يمكن إجراء حل 10x من هذا المخزن المؤقت والتخفيف مع مياه DI حسب الحاجة.

2. إعداد عينة OMV

  1. تنمو A. actinomycetemcomitans الخلايا إلى المرحلة الأسية المتأخرة (الكثافة البصرية في 600 نانومتر من 0.7). بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرتين في 10،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تصفية supernatant من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
  2. ركز الناسخ الخالي من البكتيريا باستخدام مرشحات خفض الوزن الجزيئية 50 كيلودا. طارد فائق المحلول المركز عند 105,000 × غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. إعادة إنفاق بيليه في برنامج تلفزيوني والطرد الفائق مرة أخرى (105،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.) Resuspend بيليه في 2 مل من برنامج تلفزيوني.

3. التعبئة العمود S-1000

  1. مزيج زجاجة الأسهم من هلام الترشيح المتوسطة مع قضيب يحرك الزجاج وتصب في زجاجة الحجم اللازم لملء العمود، بالإضافة إلى ما يقرب من 50٪ الزائدة (حوالي 135 مل). دع هذه الخرزات تجلس حتى تستقر ، ثم تخلع السائل الزائد. Resuspend الخرز في العازلة elution ، بحيث الحل النهائي هو ما يقرب من 70 ٪ (من حيث الحجم) هلام ، 30 ٪ العازلة. ديغا الحل تحت فراغ.
  2. قم بتركيب العمود الزجاجي عموديا باستخدام حامل حلقة وملء مع العازلة elution لتبلل جدران العمود. استنزاف المخزن المؤقت حتى يكون هناك فقط حوالي 1 سم من المخزن المؤقت المتبقية في العمود.
  3. دون خلق فقاعات، الخرز ماصة بعناية في العمود، وملء العمود إلى الأعلى. متابعة استنزاف المخزن المؤقت الزائد خلال هذه العملية. تأكد من عدم السماح للخرز تسوية تماما قبل إضافة حبات إضافية إلى أعلى العمود. يجب أن تكون معبأة العمود إلى ارتفاع حوالي 2 سم تحت الجزء السفلي من خزان العمود.

4. تحميل العينة وجمع الكسور

  1. ديغا العازلة elution تحت فراغ. اغسل العمود بحجمين عموديين (180 مل) من المخزن المؤقت لل elution.
  2. السماح المخزن المؤقت المتبقية إلى إدخال العمود بالكامل. بمجرد أن يصل العازل إلى أعلى طبقة الجل ، قم بتنقية عينة 2 مل تحتوي على OMVs (بتركيز دهون من حوالي 100 - 200 نانومول / لتر) على سطح الخرز ، مع الحرص على عدم إزعاج أي من الخرز في الجزء العلوي من العمود. السماح للعينة لدخول كامل هلام، وهذا هو، عندما لا يبقى السائل فوق طبقة هلام.
  3. بعناية وببطء إضافة العازلة elution على رأس العمود هلام. لا تزعج الطبقة العليا من الجل ، لأن هذا سيسبب تخفيف العينة.
  4. ضع أنبوبا واحدا سعة 50 مل أسفل العمود وافتح العمود. جمع أول 20 مل من eluent. إضافة إضافية elution المخزن المؤقت إلى أعلى العمود، بعناية، حسب الحاجة لضمان العمود غير جاف أبدا.
  5. ضع سلسلة من أنابيب 1.5 مل تحت العمود. بدء تشغيل العمود وجمع سلسلة من عينات 1 مل في كل أنبوب. كما يتم جمع العينات، مواصلة إضافة elution المخزن المؤقت إلى أعلى العمود، حسب الضرورة. كرر حتى يتم جمع 96 كسرا. أوقف العمود.
    ملاحظة: يجب تخزين العينات عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل أو 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل حتى إجراء مزيد من التحليل.
  6. لتنظيف العمود، قم بتشغيل وحدة تخزين عمود واحد (90 مل) من 0.1 M NaOH من خلال العمود. تشغيل وحدتي تخزين عمود (180 مل) من المخزن المؤقت elution خلال العمود.

5. تحليل العينة

  1. لقياس تركيز الدهون في كل جزء، ماصة 50 ميكرولتر من كل جزء في بئر واحد من لوحة 96 جيدا. إلى كل بئر، أضف 2.5 ميكرولتر من صبغة الليبوفيلي. حضانة لمدة 15 s. قياس كثافة الفلورسينس على قارئ لوحة مع الطول الموجي الإثارة من 515 نانومتر وطول موجي انبعاث 640 نانومتر. لحساب جزء من جميع الدهون في كل عينة، مجموع كل من كثافة الانبعاثات وتقسيم كل كثافة الفردية على المجموع.
  2. لقياس تركيز بروتين معين، ماصة 100 ميكرولتر من كل جزء في بئر واحد من لوحة المناعة ELISA. حضانة عند 25 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
    1. واشجب العينات. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة غسل ELISA إلى كل بئر وdecant. كرر أربع مرات لما مجموعه خمسة يغسل.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة حجب إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية. (ديكانت)
    3. حضانة لوحات مع 100 ميكرولتر حجب العازلة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية (1:10،000 للأجسام المضادة النقية؛ 1:10 للأجسام المضادة غير المنقوطة) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. (ديكانت)
    4. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة غسل ELISA إلى كل بئر وdecant. كرر أربع مرات لما مجموعه خمسة يغسل.
    5. أضف 100 ميكرولتر من عازل غسل ELISA بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية (1:30,000) لكل بئر. حضانة لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة غسل ELISA إلى كل بئر وdecant. كرر أربع مرات لما مجموعه خمسة يغسل.
    7. إضافة 100 ميكرولتر من الحل 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) حل خطوة واحدة واحتضان لمدة 15-30 دقيقة أو حتى يتطور اللون الأزرق. إيقاف رد فعل TMB مع 50 ميكرولتر من حل التوقف.
    8. على قارئ لوحة، وقراءة امتصاص كل بئر على طول موجي من 450 نانومتر.
  3. لقياس تركيز البروتين الكلي، سجل الامتصاص عند طول موجي يبلغ 280 نانومتر (A280)من كل كسر، باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.

يظهر تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.

Figure 1
الشكل 1: تخطيطي لإجراءات لجنة الأوراق المالية والبورصة. ومعبأة العمود مع مزيل الغاز هلام الترشيح المتوسطة بعناية لتجنب الفقاعات والقطع، ثم غسلها مع اثنين من أحجام العمود من العازلة elution. بعد ذلك ، يتم إخراج العينة بعناية إلى الجزء العلوي من الجل ، دون تعطيل تعبئة الجل. يتم فتح العمود وتشغيله حتى تدخل العينة الجل بالكامل. عند هذه النقطة، يتم وضع المخزن المؤقت في أعلى العمود، ويتم تجميع أول 20 مل من eluate. بعد ذلك، يتم جمع سلسلة من كسور 1 مل. ثم يتم وضع هذه الكسور في لوحة من 96 بئرا أو 96 جيدا المناعي لوحة لتحليل محتوى الدهون والبروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية لهذه الطريقة. OMVs التي تنتجها A. actinomycetemcomitans سلالة JP2 تم تنقيتها لأول مرة من الثقافة الفائقة باستخدام الطرد الفائق15. وجدنا سابقا أن هذه السلالة تنتج مجموعتين من OMVs، واحد مع أقطار حوالي 300 نانومتر وواحد مع أقطار حوالي 100 نانومتر15. لفصل هذه المجموعات OMV، قمنا بتنقية العينة باستخدام بروتوكول SEC الموضح أعلاه. تم تحليل كل جزء لمحتوى الدهون باستخدام صبغة الليبوفيلية ومحتوى السم (LtxA) باستخدام المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) أو مناعة. يتم الإبلاغ عن تركيزات الدهون والسموم كنسب مئوية ، حيث تشير "٪الدهون" إلى النسبة المئوية لمجموع محتوى الدهون في العينة في كل جزء وتشير "٪toxin" إلى النسبة المئوية لمجموع محتوى السم للعينة في كل جزء.

ويبين الشكل 2 ألف متوسط نتائج صبغة الدهون مع الانحرافات المعيارية من ثلاثة تنقية منفصلة، كل منها يؤديها مستخدم مختلف، مما يدل على استنساخ هذه التقنية. ويلاحظ وجود ذروتين متميزتين للدهون، تقابلان OMVs "الكبيرة" (رقم الكسر 13) و OMVs "الصغيرة" (رقم الكسر 25). أكدنا حجم OMVs في هذه القمم باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ووجدنا أن متوسط أقطار OMVs في الكسور 13 و 25 هو 296.6 نانومتر و 142.6 نانومتر على التوالي ، كما هو موضح في الشكل. 2A. وبالمقارنة، فإن متوسط قطر عينة OMV بعد الطرد الفائق ولكن قبل تنقية SEC وجد سابقا أن يكون 161.0 نانومتر15.

في الشكل 2B، يظهر مقدار LtxA في كل كسر ، الذي تم الحصول عليه باستخدام ELISA مع جسم مضاد أحادي النسيلة ضد LtxA25، متراكبا على تركيز الدهون من اللوحة A. هذه التقنية يدل على أن يرتبط السم في المقام الأول مع السكان الفرعية واحدة من OMVs. الشكل 2C يظهر كمية LtxA في كل جزء، تقاس باستخدام تقنية مناعة مع نفس المضادة لل LtxA الأجسام المضادةللنسيلة 25،مضافا على تركيز الدهون من لوحة A. في حين أن الاتجاه العام مشابه لما لوحظ في الشكل 2B، فإن نهج المناعة أقل حساسية بكثير من تقنية ELISA ، مما يؤدي إلى ملامح أكثر ضجيجا. ويبين الشكل 2D النسبة المئوية للتركيز البروتين الكلي في كل جزء، تقاس باستخدام A280،مضافا على ملف تركيز الدهون. توضح هذه اللوحة أن لجنة الأوراق المالية والبورصة قادرة على إزالة كميات كبيرة من البروتينات الحرة من الاستعدادات OMV ، كما يتضح من القيم A280 العالية في كسور أكبر من 60. (في الواقع، تم العثور على معظم البروتين في هذه الكسور، والتي لا تحتوي على OMVs، مما يدل على أن كمية كبيرة من البروتين يشارك في تنقية مع OMVs.) وبالإضافة إلى ذلك، تظهر هذه النتيجة أن تركيز البروتين الكلي لا يرتبط بالضرورة بتركيز بروتينات محددة. في حالة A. actinomycetemcomtians OMVs، LtxA يربط في المقام الأول مع عدد السكان من OMVs أكبر، في حين أن أكثر من مجموع البروتين يربط مع OMVs أصغر.

وتظهر هذه النتائج التمثيلية معا عددا من السمات الهامة لبروتوكول لجنة الأوراق المالية والبورصة لتنقية OMV. أولا ، هذه التقنية قابلة للاستنساخ للغاية ، حتى بين المستخدمين. ثانيا، استخدام صبغة ليبوفيلي للكشف عن OMVs في كل جزء هو طريقة بسيطة وموثوق بها. ثالثا، للكشف عن تركيزات بروتين محددة، ELISA هو أكثر قوة من مؤامرة المناعة. رابعا، لجنة الأوراق المالية والبورصة قادرة على إزالة كميات كبيرة من الشوائب، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية.

Figure 2
الشكل 2:تم تشغيلالنتائج التمثيلية. (أ)متوسط محتوى الدهون لكل كسر المبلغ عنها كنسبة مئوية من مجموع محتوى الدهون، من ثلاث تجارب. تمثل كل نقطة بيانات متوسط الانحراف المعياري ±. (ب)محتوى LtxA لكل كسر، الذي يتم الإبلاغ عنه كنسبة مئوية من إجمالي محتوى LtxA، كما يقاس بواسطة ELISA بأجسام مضادة لل LtxA أحادية النسيلة. (ج)محتوى LtxA لكل كسر، الذي يتم الإبلاغ عنه كنسبة مئوية من إجمالي محتوى LtxA، كما يقاس ببطانة مناعية مع جسم مضاد لل LtxA أحادي النسيلة. (د)مجموع محتوى البروتين لكل كسر، وذكرت كنسبة مئوية من مجموع محتوى البروتين، كما يقاس من قبل A280. يتم استنساخ بعض البيانات من تشانغ وآخرون26 بإذن من جون وايلي وأولاده المحدودة يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، قدمنا بروتوكولا للفصل البسيط والسريع والتكرار بين الخلايا الفرعية البكتيرية OMV. على الرغم من أن هذه التقنية مستقيمة نسبيا إلى الأمام، هناك بعض الخطوات التي يجب تنفيذها بعناية فائقة لضمان حدوث فصل فعال في العمود. أولا، من الضروري أن يتم تحميل الجل في العمود بعناية وببطء لتجنب فقاعات الهواء. لقد لاحظنا أن ترك الجل في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات قبل تحميل العمود يسمح للجل بتتوازن ويقلل من تكوين الفقاعة داخل العمود. عندما يتم أنبوب الجل في العمود، ينبغي أن يكون أنبوب بعناية على طول جانب العمود للحد من الاضطراب. في جميع الأوقات أثناء التحميل، يجب الحفاظ على العازلة الزائدة في العمود لتجنب الانقطاعات في هلام استقر. إذا كان ينبغي أن يحدث انفصال، إضافة المزيد من العازلة وماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الجل.

وبالمثل، تحميل العمود مع عينة أمر بالغ الأهمية. لأن العينة سوف تصبح مخففة أثناء مرورها عبر العمود، يجب أن تتركز العينة المحملة بشكل كاف قبل الفصل بواسطة SEC. بالنسبة ل A. actinomycetemcomitans OMVs ، وجدنا أن عينة 1 مل تحتوي على ما يقرب من 100-200 نانومول / لتر من الدهون مثالية. بعد تحميل العينة بعناية في أعلى العمود دون تعطيل طبقة الجل ، يجب تشغيل العمود فقط حتى تدخل العينة عمود الجل بالكامل. عند هذه النقطة، يجب إيقاف العمود بحيث يمكن إضافة طبقة من العازلة بعناية إلى الجزء العلوي من الجل. من المفيد تحميل حجم صغير فقط (~ 1 مل) من المخزن المؤقت ، مما يضمن عدم تعطيل طبقة الجل. مرة واحدة وقد تم تشغيل العينة كذلك في هلام، يمكن إضافة العازلة في كميات أكبر والقلق مع تعطيل طبقة هلام هو أقل من قضية. يمكن إعادة استخدام العمود عدة مرات، طالما أنه يتم الحفاظ عليه في حالة رطبة بالكامل وتنظيفه جيدا (الخطوة 4.6) بين الأشواط.

جميع إجراءات تنقية OMV تتبع نفس الخطوات الأولية التي تشمل نمو البكتيريا ، وإزالة الخلايا البكتيرية ، وعزل OMV27. على الرغم من أن هذا الإعداد "الخام" قد استخدم عادة في دراسات OMV28، إلا أنه أصبح من الواضح بشكل متزايد أن خطوة تنقية لاحقة ضرورية لإزالة البروتينات المعجلة المشتركة والملوثات الأخرى ، وكذلك لفصل السكان الفرعيين OMV. في دراسات OMV ، يتم إكمال خطوة التنقية هذه عادة باستخدام الطرد المركزي المتدرجة للكثافة. في مجال الحويكل خارج الخلية eukaryotic ، واستخدام لجنة الأوراق المالية والبورصة لفصل مجموعات الحويكل وإزالة الملوثات تتزايد في الأهمية ، كما هو أبسط وأسرع وأقل تكلفة من DGC29. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع SEC بميزة كونها ممكنة لأتمتة ، على عكس DGC29. وهكذا ، في حين أن DGC لا يزال "المعيار الذهبي" لعزل الحويكل في مجال OMV البكتيري ، نقترح أن المزايا العديدة للجنة الأوراق المالية والبورصة تجعلها طريقة مفيدة للغاية ، إن لم تكن أفضل ، لتنقية OMV من DGC. في هذا العمل، أثبتنا أن عمود 1.5 × 50 سم من سيفاكريل S-1000 قادر على فصل اثنين من السكان الفرعيين من OMVs. وقد لاحظنا أيضا أن النهج قادر على إزالة الأحماض النووية والبروتينات الحرة من محلول OMV. وقد وجدت التقارير السابقة لجنة الأوراق المالية والبورصة لتكون قادرة على إزالة LPS مجانا من الاستعدادات OMV، فضلا عن28.

في الختام ، نقترح أن لجنة الأوراق المالية والبورصة يحمل الكثير من الوعد في تنقية الحويصلات البكتيرية. في حين أننا أثبتنا قدرة هذه التقنية على فصل الملوثات العضوية الثابتة من OMVs التي تنتجها بكتيريا محددة(A. actinomycetemcomitans)،نتوقع أن هذه التقنية سوف تكون قيمة للغاية في تحليل عينات الحويكل البكتيرية الأخرى، كما ترى استخدام إضافي. وعلى وجه الخصوص، ومع تزايد التطبيقات التكنولوجية الحيوية لمركبات المركبات الكهربائية، ستزداد الحاجة إلى تحضيرات ثابتة ونقية لل الحويكل؛ SEC هو أسلوب واعد لهذه التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح يبلغون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (1554417) والمعاهد الوطنية للصحة (DE027769).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA Thermo Scientific 34028
Amicon 50 kDa filters Millipore Sigma UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9704-100
ELISA Immuno Plates Thermo Scientific 442404
FM 4-64 Thermo Scientific T13320 1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column BioRad 7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader Tecan
Potassium Chloride (KCl) Amresco (VWR) 0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) Amresco (VWR) 0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine GE Healthcare 17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Chemical S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Amresco (VWR) 0404-500G
Tris Base VWR 0497-1KG
Tween(R) 20 Acros Organics 23336-2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
  3. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  4. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
  5. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
  6. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  7. Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
  8. Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
  9. Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
  10. Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
  11. Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
  12. Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
  13. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  14. Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
  15. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
  16. Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
  17. Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
  18. Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
  19. Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
  20. Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
  21. Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  22. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  23. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  24. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  25. Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
  26. Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
  27. Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
  28. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  29. Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 169،
حجم استبعاد الكروماتوغرافيا لتحليل الغشاء الخارجي البكتيري فيسيكلي التجانس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, S. M., Nice, J. B., Chang,… More

Collins, S. M., Nice, J. B., Chang, E. H., Brown, A. C. Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity. J. Vis. Exp. (169), e62429, doi:10.3791/62429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter