Summary
Bacteriële blaasjes spelen een belangrijke rol bij pathogenese en hebben veelbelovende biotechnologische toepassingen. De heterogeniteit van blaasjes bemoeilijkt analyse en gebruik; daarom is een eenvoudige, reproduceerbare methode nodig om verschillende groottes van blaasjes te scheiden. Hier demonstreren we het gebruik van grootte-uitsluitingschromatografie om heterogene blaasjes geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitanste scheiden .
Abstract
De celwand van Gramnegatieve bacteriën bestaat uit een binnenste (cytoplasmatische) en buitenste membraan (OM), gescheiden door een dunne peptidoglycanlaag. Tijdens de groei kan het buitenste membraan blaten om bolvormige buitenste membraanblaasjes (OMV's) te vormen. Deze OMV's zijn betrokken bij tal van cellulaire functies, waaronder ladinglevering aan hostcellen en communicatie met bacteriële cellen. Onlangs is het therapeutische potentieel van OMV's onderzocht, inclusief het gebruik ervan als vaccins en geneesmiddelenleveringsvoertuigen. Hoewel OMV's zijn afgeleid van het OM, wordt al lang gewaardeerd dat de lipiden- en eiwitlading van de OMV vaak aanzienlijk verschilt van die van het OM. Meer recent is bewijs ontdekt dat bacteriën meerdere soorten OMV's kunnen vrijgeven, en er bestaat bewijs dat grootte het mechanisme van hun opname door gastheercellen kan beïnvloeden. Studies op dit gebied worden echter beperkt door moeilijkheden bij het efficiënt scheiden van de heterogene OMV's. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) wordt traditioneel voor dit doel gebruikt; deze techniek is echter tijdrovend en moeilijk op te schalen. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) daarentegen is minder omslachtig en leent zich voor de noodzakelijke toekomstige scale-up voor therapeutisch gebruik van OMV's. Hier beschrijven we een SEC-benadering die reproduceerbare scheiding van heterogene blaasjes mogelijk maakt, met als testcase OMV's geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitans, die in diameter variëren van minder dan 150 nm tot meer dan 350 nm. We demonstreren scheiding van "grote" (350 nm) OMV's en "kleine" (<150 nm) OMV's, geverifieerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS). We raden SEC-gebaseerde technieken aan boven DGC-gebaseerde technieken voor het scheiden van heterogene blaasjes vanwege het gebruiksgemak, de reproduceerbaarheid (inclusief gebruiker-tot-gebruiker) en de mogelijkheid om op te schalen.
Introduction
Gramnegatieve bacteriën geven blaasjes vrij die zijn afgeleid van hun buitenste membraan, de zogenaamde buitenste membraanblaasjes (OMV's), tijdens de groei. Deze OMV's spelen een belangrijke rol in de cel-naar-cel communicatie, zowel tussen bacteriën en gastheer als tussen bacteriële cellen, door het dragen van een aantal belangrijke biomoleculen, waaronder DNA/RNA, eiwitten, lipiden en peptidoglycanen1,2. In het bijzonder is de rol van OMV 's bij bacteriële pathogenese uitgebreid onderzocht vanwege hun verrijking in bepaalde virulentiefactoren en toxines3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Er is gemeld dat OMV's in grootte variëren van 20 tot 450 nm, afhankelijk van de ouderbacteriën en de groeifase, waarbij verschillende soorten bacteriën heterogene OMV 's8,12, 13,14vrijgeven , die ook verschillen in hun eiwitsamenstelling en mechanisme van gastheercelinvoer12. H. pylori vrijgegeven OMV's met een diameter van 20 tot 450 nm, waarbij de kleinere OMV's een homogenere eiwitsamenstelling bevatten dan de grotere OMV's. Belangrijk is dat de twee populaties OMV's via verschillende mechanismen werden geïnternaliseerd door gastheercellen12. Bovendien hebben we aangetoond dat Aggregatibacter actinomycetemcomitans een populatie van kleine (<150 nm) OMV's vrijgeeft, samen met een populatie van grote (>350 nm) OMV's, waarbij de OMV's een aanzienlijke hoeveelheid van een uitgescheiden eiwittoxine bevatten, leukotoxine (LtxA)15. Hoewel de rol van OMV-heterogeniteit in cellulaire processen duidelijk belangrijk is, hebben technische problemen bij het scheiden en analyseren van verschillende populaties blaasjes deze studies beperkt.
Naast hun belang bij bacteriële pathogenese zijn OMV 's voorgesteld voor gebruik in een aantal biotechnologische toepassingen, onder meer als vaccins en geneesmiddelenleveringsvoertuigen16,17,18,19,20. Voor hun translationele gebruik in dergelijke benaderingen is een schone en monodisperse bereiding van blaasjes vereist. Effectieve en efficiënte scheidingsmethoden zijn dus noodzakelijk.
Meestal wordt dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) gebruikt om heterogeen grote blaasjespopulaties te scheiden van cellulair puin, waaronder flagellae en afgescheiden eiwitten21; de methode is ook gerapporteerd als een benadering om heterogene OMV-subpopulaties12,13,14te scheiden . DGC is echter tijdrovend, inefficiënt en zeer variabel van gebruiker tot gebruiker22 en is daarom niet ideaal voor opscha opschaping. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) daarentegen vertegenwoordigt een schaalbare, efficiënte en consistente benadering om OMV's21,23,24te zuiveren . We hebben ontdekt dat een lange (50 cm), zwaartekracht-stroom, SEC-kolom, gevuld met gelfiltratiemedium voldoende is voor het efficiënt zuiveren en scheiden van subpopulaties van OMV's. In het bijzonder gebruikten we deze aanpak om A. actinomycetemcomitans OMV's te scheiden in "grote" en "kleine" subpopulaties, en om eiwit- en DNA-besmetting te verwijderen. De zuivering werd voltooid in minder dan 4 uur en de volledige scheiding van de OMV-subpopulaties en het verwijderen van puin werd voltooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van buffers
- Om de ELISA-wasbuffer voor te bereiden, voegt u 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl en 1 g runderserumalbumine (BSA) toe aan 1 L gedeïoniseerd (DI) water. Voeg 500 μL polysorbaat-20 toe. Stel de pH in op 7,2 met HCl of NaOH.
- Voeg 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl en 10 g BSA toe om de blokkeerbuffer voor te bereiden. Voeg 500 μL polysorbaat-20 toe aan 1 L DI water. Stel de pH in op 7,2 met HCl of NaOH.
- Om de elutiebuffer (PBS) voor te bereiden, voegt u 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4en 0,24 g KH2PO4 tot 1 L DI water toe. Stel de pH in op 7,4 met HCl of NaOH.
OPMERKING: Een 10x oplossing van deze buffer kan worden gemaakt en indien nodig worden verdund met DI-water.
2. Bereiding van OMV-monster
- Kweek A. actinomycetemcomitans cellen tot de late exponentiële fase (optische dichtheid bij 600 nm van 0,7). Pellet de cellen door tweemaal te centrifugeren bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Filtreer het supernatant door een filter van 0,45 μm.
- Concentreer het bacterievrije supernatant met behulp van 50 kDa-moleculaire gewichtsafsparingsfilters. Ultracentrifugeer de geconcentreerde oplossing bij 105.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.
- Resuspend de pellet in PBS en ultracentrifuge opnieuw (105.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.) Resuspendeer de pellet in 2 ml PBS.
3. De S-1000 kolom inpakken
- Meng de voorraadfles gelfiltratiemedium met een glazen roerstaaf en giet in een glazen fles het volume uit dat nodig is om de kolom te vullen, plus ongeveer 50% overmaat (ongeveer 135 ml). Laat deze kralen zitten totdat ze zijn neergestreken en decanteer vervolgens de overtollige vloeistof. Resuspend de kralen in elutie buffer, zodat de uiteindelijke oplossing is ongeveer 70% (volume) gel, 30% buffer. Ontgast de oplossing onder vacuüm.
- Monteer de glazen kolom verticaal met behulp van een ringstandaard en vul met elutiebuffer om de wanden van de kolom nat te maken. Giet de buffer af tot er nog maar ongeveer 1 cm buffer in de kolom zit.
- Zonder bubbels te maken, pipetteer je voorzichtig kralen in de kolom en vul je de kolom naar boven. Blijf overtollige buffer gedurende dit proces afvoeren. Zorg ervoor dat u de kralen niet volledig laat bezinken voordat u extra kralen aan de bovenkant van de kolom toevoegt. De kolom moet worden verpakt tot een hoogte van ongeveer 2 cm onder de bodem van het kolomreservoir.
4. Het monster laden en fracties verzamelen
- Ontgast de elutiebuffer onder vacuüm. Was de kolom met twee kolomvolumes (180 ml) elutiebuffer.
- Laat de resterende buffer volledig in de kolom komen. Zodra de buffer de bovenkant van de gellaag heeft bereikt, spuit u voorzichtig een monster van 2 ml met OMV's (bij een lipideconcentratie van ongeveer 100 - 200 nmol / L) op het oppervlak van de kralen, waarbij u erop moet letten dat u geen van de kralen aan de bovenkant van de kolom verstoort. Laat het monster volledig in de gel komen, dat wil zeggen wanneer er geen vloeistof boven de gellaag achter blijft.
- Voeg voorzichtig en langzaam elutiebuffer toe bovenop de gelkolom. Verstoor de bovenste laag van de gel niet, omdat dit monsterverdunning zal veroorzaken.
- Plaats een enkele buis van 50 ml onder de kolom en open de kolom. Verzamel de eerste 20 ml van het eluent. Voeg indien nodig extra elutiebuffer toe aan de bovenkant van de kolom, indien nodig om ervoor te zorgen dat de kolom nooit droog is.
- Plaats een serie buizen van 1,5 ml onder de kolom. Start de kolom en verzamel een reeks monsters van 1 ml in elke buis. Terwijl de monsters worden verzameld, blijft u, indien nodig, elutiebuffer toevoegen aan de bovenkant van de kolom. Herhaal dit totdat 96 fracties zijn verzameld. Stop de kolom.
OPMERKING: De monsters moeten tot nader order bij -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag of 4 °C voor opslag op korte termijn. - Als u de kolom wilt reinigen, voert u één kolomvolume (90 ml) van 0,1 M NaOH door de kolom uit. Voer twee kolomvolumes (180 ml) elutiebuffer door de kolom uit.
5. Steekproefanalyse
- Om de lipideconcentratie in elke fractie te meten, pipet 50 μL van elke fractie in een enkele put van een 96-putplaat. Voeg aan elke put 2,5 μL lipofiele kleurstof toe. Incubeer gedurende 15 s. Meet de fluorescentie-intensiteit op een plaatlezer met een excitatiegolflengte van 515 nm en een emissiegolflengte van 640 nm. Om de fractie van alle lipiden in elk monster te berekenen, somt u alle emissieintensiteiten op en deelt u elke afzonderlijke intensiteit door het totaal.
- Om de concentratie van een bepaald eiwit te meten, pipet 100 μL van elke fractie in een enkele put van een ELISA-immunoplaat. Incubeer bij 25 °C gedurende 3 uur.
- Decanteer de monsters. Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
- Voeg 200 μL blokkeerbuffer toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C. Decanteren.
- Incubeer platen met een blokkeerbuffer van 100 μL plus primair antilichaam (1:10.000 voor gezuiverd antilichaam; 1:10 voor ongezuiverd antilichaam) 's nachts bij 4 °C. Decanteren.
- Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
- Voeg 100 μL ELISA-wasbuffer plus secundair antilichaam (1:30.000) toe aan elke put. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C.
- Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
- Voeg 100 μL van de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) eenstapsoplossing toe en incubeer gedurende 15-30 minuten of totdat een blauwe kleur ontstaat. Stop de TMB-reactie met 50 μL van de stopoplossing.
- Lees op een plaatlezer de absorptie van elke put op een golflengte van 450 nm.
- Om de totale eiwitconcentratie te meten, registreert u de absorptie op een golflengte van 280 nm (A280) van elke fractie, met behulp van een UV-vis spectrofotometer.
Een schema van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.
Figuur 1: Schematische SEC-procedure. De kolom is zorgvuldig verpakt met ontgast gelfiltratiemedium om bellen en discontinuïteiten te voorkomen en vervolgens gewassen met twee kolomvolumes elutiebuffer. Vervolgens wordt het monster zorgvuldig op de bovenkant van de gel gepijpt, zonder de gelverpakking te verstoren. De kolom wordt geopend en uitgevoerd totdat het monster volledig in de gel komt. Op dit punt wordt de buffer op de bovenkant van de kolom geplaatst en wordt de eerste 20 ml eluaat verzameld. Vervolgens wordt een reeks fracties van 1 ml verzameld. Deze fracties worden vervolgens in een 96-well plaat of 96-well immuno-plate geplaatst voor analyse van lipide en eiwitgehalte. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve resultaten van deze methode. OMV's geproduceerd door A. actinomycetemcomitans stam JP2 werden voor het eerst gezuiverd uit de cultuur supernatant met behulp van ultracentrifugatie15. We ontdekten eerder dat deze soort twee populaties OMV's produceert, een met diameters van ongeveer 300 nm en een met diameters van ongeveer 100 nm15. Om deze OMV-populaties te scheiden, hebben we het monster gezuiverd met behulp van het hierboven beschreven SEC-protocol. Elke fractie werd geanalyseerd op lipidengehalte met behulp van de lipofiele kleurstof en op toxinegehalte (LtxA) met behulp van enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) of een immunoblot. De lipiden- en toxineconcentraties worden gerapporteerd als percentages, waarbij "%lipide" aangeeft welk percentage van het totale lipidegehalte van het monster in elke fractie zit en "%toxine" aangeeft welk percentage van het totale toxinegehalte van het monster in elke fractie zit.
Figuur 2A toont de gemiddelde lipofiele kleurstofresultaten met standaardafwijkingen van drie afzonderlijke zuiveringen, elk uitgevoerd door een andere gebruiker, wat de reproduceerbaarheid van deze techniek aantoont. Er worden twee verschillende lipidepieken waargenomen, overeenkomend met "grote" OMV's (breuknummer 13) en "kleine" OMV's (breuknummer 25). We bevestigden de grootte van de OMV's in deze pieken met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en vonden de gemiddelde diameters van de OMV's in de fracties 13 en 25 respectievelijk 296,6 nm en 142,6 nm, zoals weergegeven in Fig. 2A. Ter vergelijking: de gemiddelde diameter van het OMV-monster na ultracentrifugatie maar vóór sec-zuivering bleek eerder 161,0 nm15te zijn.
In figuur 2Bwordt de hoeveelheid LtxA in elke fractie, verkregen met ELISA met een monoklonaal antilichaam tegen LtxA25, weergegeven op de lipidenconcentratie van paneel A. Deze techniek toont aan dat het toxine voornamelijk geassocieerd wordt met één subpopulatie van OMV's. Figuur 2C toont de hoeveelheid LtxA in elke fractie, gemeten met behulp van een immunoblottechniek met hetzelfde anti-LtxA monoklonale antilichaam25, bedekt met de lipideconcentratie van paneel A. Hoewel de algemene trend vergelijkbaar is met wat wordt waargenomen in figuur 2B, is de immunoblotbenadering veel minder gevoelig dan de ELISA-techniek, wat resulteert in luidruchtigere profielen. Figuur 2D toont het percentage van de totale eiwitconcentratie in elke fractie, gemeten met behulp van de A280, bedekt met het lipideconcentratieprofiel. Dit panel toont aan dat SEC in staat is om aanzienlijke hoeveelheden vrije eiwitten uit de OMV-preparaten te verwijderen, zoals blijkt uit de hoge A280-waarden in fracties groter dan 60. (In feite wordt het grootste deel van het eiwit gevonden in deze fracties, die geen OMV's bevatten, wat aantoont dat een grote hoeveelheid eiwit co-zuivert met de OMV's.) Bovendien toont dit resultaat aan dat de totale eiwitconcentratie niet noodzakelijkerwijs correleert met de concentratie van specifieke eiwitten. In het geval van A. actinomycetemcomtians OMV's associeert LtxA voornamelijk met de populatie van grotere OMV's, terwijl meer van het totale eiwit associeert met de kleinere OMV's.
Samen tonen deze representatieve resultaten een aantal belangrijke kenmerken van het SEC-protocol voor OMV-zuivering. Ten eerste is de techniek zeer reproduceerbaar, zelfs tussen gebruikers. Ten tweede is het gebruik van een lipofiele kleurstof om OMV's in elke fractie te detecteren een eenvoudige en betrouwbare methode. Ten derde, om specifieke eiwitconcentraties te detecteren, is ELISA robuuster dan een immunoblot. Ten vierde is SEC in staat om grote hoeveelheden onzuiverheden te verwijderen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren.
Figuur 2: Representatieve resultaten. A. actinomycetemcomitans JP2 OMV's werden door de SEC-kolom geleid en elke fractie werd geanalyseerd op lipidengehalte met behulp van een lipofiele kleurstof en toxine (LtxA) met behulp van een monoklonaal antilichaam. (A) Het gemiddelde lipidengehalte van elke fractie gerapporteerd als een percentage van het totale lipidengehalte, uit drie onderzoeken. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de gemiddelde ± standaardafwijking. (B) Het LtxA-gehalte van elke fractie, gerapporteerd als een percentage van het totale LtxA-gehalte, gemeten door ELISA met een monoklonaal anti-LtxA-antilichaam. (C) Het LtxA-gehalte van elke fractie, gerapporteerd als een percentage van het totale LtxA-gehalte, gemeten door een immunoblot met een monoklonaal anti-LtxA-antilichaam. D) Het totale eiwitgehalte van elke fractie , gerapporteerd als een percentage van het totale eiwitgehalte , gemeten met A280. Sommige gegevens zijn overgenomen uit Chang et al.26 met toestemming van John Wiley and Sons Ltd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een protocol geleverd voor de eenvoudige, snelle en reproduceerbare scheiding van bacteriële OMV-subpopulaties. Hoewel de techniek relatief eenvoudig is, zijn er enkele stappen die uiterst zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er een efficiënte scheiding in de kolom plaatsvindt. Ten eerste is het essentieel dat de gel voorzichtig en langzaam in de kolom wordt geladen om luchtbellen te voorkomen. We hebben waargenomen dat het enkele uren op kamertemperatuur laten staan voordat de kolom wordt geladen, de gel in staat stelt om te equilibreren en de vorming van bubbels in de kolom minimaliseert. Wanneer de gel in de kolom wordt gepijpt, moet deze zorgvuldig langs de zijkant van de kolom worden gepijpt om turbulentie te minimaliseren. Te allen tijde tijdens het laden moet de overtollige buffer in de kolom worden gehouden om discontinuïteiten in de afgewikkelde gel te voorkomen. Als er een disjunctie zou optreden, voeg dan meer buffer en pipet op en neer toe om de gel opnieuw te gebruiken.
Evenzo is het laden van de kolom met monster van cruciaal belang. Omdat het monster verdund raakt als het door de kolom gaat, moet het geladen monster voldoende geconcentreerd zijn voordat het door SEC wordt gescheiden. Voor de A. actinomycetemcomitans OMV's hebben we ontdekt dat een monster van 1 ml met ongeveer 100-200 nmol/L lipiden ideaal is. Nadat het monster zorgvuldig boven aan de kolom is geladen zonder de gellaag te verstoren, moet de kolom worden uitgevoerd totdat het monster volledig in de gelkolom komt. Op dit punt moet de kolom worden gestopt, zodat een laag buffer voorzichtig aan de bovenkant van de gel kan worden toegevoegd. Het is handig om slechts een klein volume (~ 1 ml) buffer te laden, zodat de gellaag niet wordt verstoord. Zodra het monster verder in de gel is gelopen, kan buffer in grotere volumes worden toegevoegd en is de zorg voor het verstoren van de gellaag minder een probleem. De kolom kan meerdere keren worden hergebruikt, zolang deze in een volledig gehydrateerde toestand wordt onderhouden en goed wordt gereinigd (stap 4.6) tussen de runs.
Alle OMV-zuiveringsprocedures volgen dezelfde eerste stappen, waaronder bacteriële groei, verwijdering van bacteriële cellen en OMV-isolatie27. Hoewel dit "ruwe" preparaat vaak is gebruikt in OMV-studies28, wordt het steeds duidelijker dat een volgende zuiveringsstap nodig is om co-neerslaande eiwitten en andere verontreinigingen te verwijderen en om OMV-subpopulaties te scheiden. In OMV-studies wordt deze zuiveringsstap vaak voltooid met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. In het eukaryotische extracellulaire blaasjeveld neemt het gebruik van SEC om blaasjespopulaties te scheiden en verontreinigingen te verwijderen steeds belangrijker, omdat het eenvoudiger, sneller en goedkoper is dan DGC29. Bovendien heeft SEC het voordeel dat het mogelijk is om te automatiseren, in tegenstelling tot DGC29. Hoewel DGC dus de "gouden standaard" van blaasjesisolatie op het gebied van bacteriële OMV blijft, stellen we voor dat de talrijke voordelen van SEC het een uiterst nuttige, zo niet betere, methode van OMV-zuivering maken dan DGC. In dit werk hebben we aangetoond dat een kolom van 1,5 x 50 cm sephacryl S-1000 in staat is om twee subpopulaties van OMV's te scheiden. We hebben ook opgemerkt dat de aanpak in staat is om nucleïnezuren en vrije eiwitten uit de OMV-oplossing te verwijderen. Eerdere rapporten hebben ontdekt dat SEC gratis LPS uit OMV-preparaten kan verwijderen, evenals28.
Tot slot stellen we voor dat SEC veel beloftes doet bij de zuivering van bacteriële blaasjes. Hoewel we hebben aangetoond dat de techniek in staat is om subpopulaties van OMV's geproduceerd door een specifieke bacterie (A. actinomycetemcomitans) te scheiden, verwachten we dat de techniek uiterst waardevol zal blijken te zijn bij het analyseren van andere bacteriële blaasjesmonsters, omdat het extra gebruik ziet. Met name naarmate de biotechnologische toepassingen van OMV's toenemen, zal ook de behoefte aan consistente en zuivere blaaspreparaten toenemen; SEC is een veelbelovende methode voor deze toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation (1554417) en National Institutes of Health (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
