Summary
Bakteriella vesiklar spelar viktiga roller i patogenes och har lovande biotekniska tillämpningar. Andebandens heterogenitet komplicerar analys och användning; Därför är en enkel, reproducerbar metod för att separera olika storlekar av blåsor nödvändig. Här visar vi användningen av storlek exkludering kromatografi för att separera heterogena vesiklar produceras av Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
Cellväggen av gramnegativa bakterier består av ett inre (cytoplasmiskt) och yttre membran (OM), separerat av ett tunt peptidoglykanskikt. Under hela tillväxten kan det yttre membranet bleb för att bilda sfäriska yttre membran vesiklar (OMV). Dessa OMV är involverade i många cellulära funktioner inklusive lastleverans till värdceller och kommunikation med bakterieceller. Nyligen har den terapeutiska potentialen hos OMV börjat utforskas, inklusive deras användning som vacciner och läkemedelsleveransfordon. Även om OMVs härleds från OM, har det länge uppskattats att lipid- och proteinlasten i OMV skiljer sig, ofta avsevärt, från OM. På senare tid har bevis för att bakterier kan släppa ut flera typer av OMV upptäckts, och det finns bevis för att storleken kan påverka mekanismen för deras upptag av värdceller. Studier på detta område begränsas dock av svårigheter att effektivt separera de heterogent stora omständliga oms. Densitetsgradientcentrifugation (DGC) har traditionellt använts för detta ändamål. Denna teknik är dock tidskrävande och svår att skala upp. Storleksuteslutning kromatografi (SEC), å andra sidan, är mindre besvärlig och lämpar sig för den nödvändiga framtida uppskalningen för terapeutisk användning av OMV. Här beskriver vi en SEC-metod som möjliggör reproducerbar separation av heterogent stora vesiklar, med hjälp av omvar som testfall som produceras av Aggregatibacter actinomycetemcomitans, som sträcker sig i diameter från mindre än 150 nm till större än 350 nm. Vi visar separation av "stora" (350 nm) OMV och "små" (<150 nm) OMV, verifierade av dynamisk ljusspridning (DLS). Vi rekommenderar SEC-baserade tekniker över DGC-baserade tekniker för separation av heterogent stora vesiklar på grund av dess användarvänlighet, reproducerbarhet (inklusive användar-till-användare) och möjlighet till uppskalning.
Introduction
Gramnegativa bakterier frigör blåsor som härrör från deras yttre membran, så kallade yttre membran vesiklar (OMV), under hela tillväxten. Dessa OMV spelar viktiga roller i cell-till-cell-kommunikation, både mellan bakterier och värdar samt mellan bakterieceller, genom att bära ett antal viktiga biomolekyler, inklusive DNA / RNA, proteiner, lipider och peptidoglykaner1,2. I synnerhet har omvs roll i bakteriell patogenes studerats utförligt på grund av deras berikning i vissa virulensfaktorer och toxiner3,4,5,6,7,8,9,10,11.
OMV har rapporterats variera i storlek från 20 till 450 nm, beroende på moderbakterierna och tillväxtstadiet, med flera typer av bakterier som frigör heterogent stora OMV8,12,13,14, som också skiljer sig åt i deras proteinsammansättning och mekanism för värdcellinmatning12. H. pylori släppte OMV i diameter från 20 till 450 nm, med de mindre OMV som innehåller en mer homogen proteinsammansättning än de större OMV. Viktigt, de två populationerna av OMV observerades att internaliseras av värdceller via olika mekanismer12. Dessutom har vi visat att Aggregatibacter actinomycetemcomitans släpper ut en population av små (<150 nm) OMV tillsammans med en population av stora (>350 nm) OMV, med OMV som innehåller en betydande mängd ett utsöndrat proteintoxin, leukotoxin (LtxA)15. Medan rollen av OMV heterogenitet i cellulära processer är klart viktigt, tekniska svårigheter att separera och analysera distinkta populationer av vesiklar har begränsat dessa studier.
Förutom deras betydelse för bakteriell patogenes har OMV föreslagits för användning i ett antal biotekniska tillämpningar, inklusive som vacciner och läkemedelsleveransfordon16,17,18,19,20. För deras translationella användning i sådana metoder krävs en ren och monodisperse beredning av vesiklar. Således är effektiva och effektiva metoder för separation nödvändiga.
Oftast används densitetsgradientcentrifugation (DGC) för att separera heterogent stora vesikelpopulationer från cellulärt skräp, inklusive flagella och utsöndradeproteiner 21; Metoden har också rapporterats som ett tillvägagångssätt för att separera omv-delpopulationer av heterogent storlek12,13,14. DGC är dock tidskrävande, ineffektivt och mycket variabelt från användare till användare22 och är därför inte idealiskt för uppskalning. Däremot representerar storleksuteslutningskromatografi (SEC) en skalbar, effektiv och konsekvent metod för att rena OMV21,23,24. Vi har funnit att en lång (50 cm), gravitationsflöde, SEC-kolumn, fylld med gelfiltreringsmedium är tillräcklig för att effektivt rena och separera subpopulationer av OMV. Specifikt använde vi detta tillvägagångssätt för att separera A. actinomycetemcomitans OMV i "stora" och "små" subpopulationer, samt för att ta bort protein och DNA-förorening. Rening slutfördes på mindre än 4 h, och fullständig separation av OMV subpopulations och avlägsnande av skräp uppnåddes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbetande av buffertar
- För att förbereda ELISA-tvättbufferten, tillsätt 3,94 g Tris-bas, 8,77 g NaCl och 1 g bovint serumalbumin (BSA) till 1 L avjoniserat (DI) vatten. Tillsätt 500 μL polysorbat-20. Justera pH-problemet till 7,2 med HCl eller NaOH.
- För att förbereda blockeringsbufferten, tillsätt 3,94 g Tris-bas, 8,77 g NaCl och 10 g BSA. Tillsätt 500 μL polysorbat-20 till 1 L DI-vatten. Justera pH-problemet till 7,2 med HCl eller NaOH.
- För att förbereda elueringsbufferten (PBS), tillsätt 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4och 0,24 g KH2PO4 till 1 L DI-vatten. Justera pH-problemet till 7,4 med HCl eller NaOH.
OBS: En 10x lösning av denna buffert kan tillverkas och spädas med DI-vatten efter behov.
2. Beredning av OMV-prov
- Växa A. actinomycetemcomitans celler till den sena exponentiella fasen (optisk densitet vid 600 nm av 0,7). Pellet cellerna genom att centrifugera två gånger vid 10 000 x g vid 4 °C i 10 min. Filtrera supernatanten genom ett filter på 0,45 μm.
- Koncentrera det bakteriefria supernatantet med hjälp av 50 kDa-molekylvikts brytfilter. Ultracentrifug den koncentrerade lösningen vid 105 000 x g vid 4 °C i 30 min.
- Återanvänd pelleten i PBS och ultracentrifuge igen (105 000 x g vid 4 °C i 30 min.) Återanvänd pelleten i 2 ml PBS.
3. Packa S-1000-kolumnen
- Blanda lagerflaskan med gelfiltreringsmedium med en glasrörstång och häll ut i en glasflaska den volym som krävs för att fylla kolonnen, plus cirka 50% överskott (ca 135 ml). Låt dessa pärlor sitta tills de har lagt sig och sedan dekantera av överskottsvätskan. Återanvänd pärlorna i elueringsbuffert, så att den slutliga lösningen är cirka 70% (volym) gel, 30% buffert. Avgasar lösningen under vakuum.
- Montera glaskolonnen vertikalt med hjälp av ett ringstativ och fyll med elueringsbuffert för att blöta kolonnens väggar. Töm bufferten tills det bara finns ca 1 cm buffert kvar i kolonnen.
- Utan att skapa bubblor, försiktigt pipettpärlor i kolumnen, fyller kolumnen till toppen. Fortsätt att tömma överskottsbufferten under hela den här processen. Var noga med att inte låta pärlorna sätta sig helt innan du lägger till ytterligare pärlor högst upp i kolumnen. Kolonnen ska packas till en höjd av ca 2 cm under botten av kolonnbehållaren.
4. Lastning av provet och insamling av fraktioner
- Avgasar elueringsbufferten under vakuum. Tvätta kolonnen med två kolonnvolymer (180 ml) elueringsbuffert.
- Tillåt att den återstående bufferten kommer in i kolumnen fullt ut. När bufferten har nått toppen av gelskiktet, pipett försiktigt ett 2-ml prov som innehåller OMV (vid en lipidkoncentration på cirka 100 - 200 nmol / L) på pärlornas yta, var försiktig så att du inte stör någon av pärlorna högst upp i kolonnen. Låt provet helt komma in i gelén, det vill säga när ingen vätska förblir ovanför gelskiktet.
- Tillsätt försiktigt och långsamt elueringsbuffert ovanpå gelkolonnen. Stör inte gelens översta lager, eftersom detta kommer att orsaka provutspädning.
- Placera ett enda 50 ml-rör under kolonnen och öppna kolonnen. Samla de första 20 ml av eluenten. Tillsätt ytterligare elueringsbuffert på toppen av kolumnen, försiktigt, efter behov för att säkerställa att kolonnen aldrig är torr.
- Placera en serie med 1,5 ml rör under kolonnen. Starta kolonnen och samla en serie 1-ml prover i varje rör. När proverna samlas in fortsätter du att vid behov lägga till elueringsbuffert högst upp i kolumnen. Upprepa tills 96 fraktioner har samlats in. Stoppa kolumnen.
OBS: Proverna bör förvaras vid -20 °C för långtidslagring eller 4 °C för korttidslagring tills vidare analys. - Om du vill rensa kolumnen kör du en kolumnvolym (90 ml) på 0,1 M NaOH genom kolumnen. Kör två kolumnvolymer (180 ml) elueringsbuffert genom kolumnen.
5. Provanalys
- För att mäta lipidkoncentrationen i varje fraktion, pipett 50 μL av varje fraktion i en enda brunn av en 96-brunnsplatta. Tillsätt 2,5 μL lipofila färgämnen till varje brunn. Inkubera i 15 s. Mät fluorescensintensiteten på en plåtläsare med en excitationsvåglängd på 515 nm och en utsläppsvåglängd på 640 nm. För att beräkna fraktionen av all lipid i varje prov, summera alla utsläppsintensiteter och dividera varje enskild intensitet med summan.
- För att mäta koncentrationen av ett visst protein, pipett 100 μL av varje fraktion i en enda brunn av en ELISA-immunplatta. Inkubera vid 25 °C i 3 timmar.
- Dekanta proverna. Tillsätt 200 μL ELISA-tvättbuffert till varje brunn och dekantant. Upprepa fyra gånger för totalt fem tvättar.
- Tillsätt 200 μL blockeringsbuffert till varje brunn och inkubera i 1 timme vid 25 °C. Dekantera.
- Inkubera plattor med 100 μL blockeringsbuffert plus primär antikropp (1:10 000 för renad antikropp; 1:10 för oanvänd antikropp) över natten vid 4 °C. Dekantera.
- Tillsätt 200 μL ELISA-tvättbuffert till varje brunn och dekantant. Upprepa fyra gånger för totalt fem tvättar.
- Tillsätt 100 μL ELISA-tvättbuffert plus sekundär antikropp (1:30 000) till varje brunn. Inkubera i 1 timme vid 25 °C.
- Tillsätt 200 μL ELISA-tvättbuffert till varje brunn och dekantant. Upprepa fyra gånger för totalt fem tvättar.
- Tillsätt 100 μL av 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) enstegslösning och inkubera i 15-30 min eller tills en blå färg utvecklas. Stoppa TMB-reaktionen med 50 μL av stopplösningen.
- På en plåtläsare, läs absorbansen av varje brunn vid en våglängd på 450 nm.
- För att mäta den totala proteinkoncentrationen, registrera absorbansen vid en våglängd på 280 nm (A280)av varje fraktion med hjälp av en UV-vis-spektrofotometer.
Ett schema över protokollet visas i figur 1.
Figur 1: Schematisk för SEC-förfarandet. Kolonnen packas med avgasat gelfiltreringsmedium noggrant för att undvika bubblor och diskontinuiteter och tvättas sedan med två kolonnvolymer elueringsbuffert. Därefter är provet noggrant pipetted på toppen av gelén, utan att störa gelförpackningen. Kolumnen öppnas och körs tills provet helt kommer in i gelén. Vid denna tidpunkt placeras bufferten högst upp i kolumnen och de första 20 mL eluat samlas in. Därefter samlas en serie av 1-ml fraktioner in. Dessa fraktioner placeras sedan i en 96-brunnsplatta eller 96-brunns immunplatta för analys av lipid- och proteininnehåll. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar representativa resultat av denna metod. OMVs produceras av A. actinomycetemcomitans stam JP2 var först renas från kulturen supernatant med hjälp av ultracentrifugation15. Vi har tidigare funnit att denna stam producerar två populationer av OMV, en med diametrar på ca 300 nm och en med diametrar på ca 100 nm15. För att separera dessa OMV-populationer renade vi provet med SEC-protokollet som beskrivs ovan. Varje fraktion analyserades för lipidinnehåll med lipofila färgämne och för toxininnehåll (LtxA) med enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA) eller en immunoblot. Lipid- och toxinkoncentrationerna rapporteras i procent, där "%lipid" anger hur stor procentandel av provets totala lipidhalt som finns i varje fraktion och "%toxin" anger hur stor procentandel av provets totala toxinhalt som finns i varje fraktion.
Figur 2A visar de genomsnittliga lipofila färgämnena med standardavvikelser från tre separata reningar, som var och en utförs av en annan användare, vilket visar reproducerbarheten av denna teknik. Två distinkta lipidtoppar observeras, motsvarande "stora" OMV (fraktionsnummer 13) och "små" OMV (fraktionsnummer 25). Vi bekräftade storleken på OMV i dessa toppar med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS) och fann medeldiametrar av OMV i fraktioner 13 och 25 att vara 296,6 nm respektive 142,6 nm, som visas i Fig. 2A. I jämförelse visade sig den genomsnittliga diametern för OMV-provet efter ultracentrifugation men innan SEC-rening tidigare var 161,0 nm15.
I figur 2Bvisas mängden ltxa i varje fraktion, som erhålls med ELISA med en monoklonal antikropp mot LtxA25,överlagrad på lipidkoncentrationen från panel A. Denna teknik visar att toxinet främst är förknippat med en subpopulation av OMV. Figur 2C visar mängden LtxA i varje fraktion, mätt med hjälp av en immunoblotteknik med samma anti-LtxA monoklonala antikropp25, överlagrad på lipidkoncentrationen från panel A. Medan den övergripande trenden liknar vad som observeras i figur 2B, är immunoblot-metoden mycket mindre känslig än ELISA-tekniken, vilket resulterar i ouppnåelig profil. Figur 2D visar procentandelen av den totala proteinkoncentrationen i varje fraktion, mätt med A280, överlagrad på lipidkoncentrationsprofilen. Denna panel visar att SEC kan ta bort betydande mängder fria proteiner från OMV-preparaten, vilket framgår av de höga A280-värdena i fraktioner större än 60. (Faktum är att det mesta av proteinet finns i dessa fraktioner, som inte innehåller OMV, vilket visar att en stor mängd protein samregerar med OMV.) Dessutom visar detta resultat att den totala proteinkoncentrationen inte nödvändigtvis korrelerar med koncentrationen av specifika proteiner. När det gäller A. actinomycetemcomtians OMVs associerar LtxA främst med populationen av större OMV, medan mer av det totala proteinet associeras med de mindre OMV.
Tillsammans visar dessa representativa resultat ett antal viktiga funktioner i SEC-protokollet för OMV-rening. För det första är tekniken mycket reproducerbar, även mellan användare. För det andra är användningen av ett lipofila färgämne för att upptäcka OMV i varje fraktion en enkel och pålitlig metod. För det tredje, för att upptäcka specifika proteinkoncentrationer är ELISA mer robust än en immunoblot. För det fjärde kan SEC ta bort stora mängder föroreningar, inklusive proteiner och nukleinsyror.
Figur 2: Representativa resultat. A)Den genomsnittliga lipidhalten i varje fraktion som rapporterats i procent av det totala lipidinnehållet, från tre studier. Varje datapunkt representerar medelvärdet ± standardavvikelse. B)LtxA-halten för varje fraktion, rapporterad i procent av det totala LtxA-innehållet, mätt med ELISA med en monoklonal anti-LtxA-antikropp. C)LtxA-halten för varje fraktion, rapporterad i procent av det totala LtxA-innehållet, mätt med en immunoblot med en monoklonal anti-LtxA-antikropp. d)Den totala proteinhalten i varje fraktion, rapporterad i procent av den totala proteinhalten, mätt med A280. Några av uppgifterna återges från Chang et al.26 med tillstånd från John Wiley and Sons Ltd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi tillhandahållit ett protokoll för enkel, snabb och reproducerbar separation av bakteriella OMV-subpopulationer. Även om tekniken är relativt rak, finns det några steg som måste utföras extremt noggrant för att säkerställa att effektiv separation sker i kolumnen. Först är det viktigt att gelén laddas in i kolonnen noggrant och långsamt för att undvika luftbubblor. Vi har observerat att lämna gelén vid rumstemperatur i flera timmar innan du laddar kolonnen gör att gelén kan jämvikta och minimerar bubbelbildningen i kolonnen. När gelén är rört i kolonnen ska den försiktigt ledas längs sidan av kolonnen för att minimera turbulensen. Alltid under belastningen bör överskottsbufferten bibehållas i kolumnen för att undvika avbrott i den sedimentera gelén. Om en disjunktion skulle uppstå, tillsätt mer buffert och pipett upp och ner för att återanvända gelén.
På samma sätt är det mycket viktigt att läsa in kolumnen med exempel. Eftersom provet späds ut när det passerar genom kolumnen bör det laddade provet vara tillräckligt koncentrerat före separation av SEC. För A. actinomycetemcomitans OMV har vi funnit att ett 1-ml prov som innehåller cirka 100-200 nmol/L lipider är idealiskt. När provet har laddats försiktigt högst upp i kolonnen utan att störa gelskiktet ska kolonnen köras precis tills provet helt kommer in i gelkolonnen. Vid denna tidpunkt bör kolumnen stoppas så att ett lager av buffert försiktigt kan läggas till toppen av gelén. Det är bra att bara ladda en liten volym (~ 1 ml) buffert, vilket säkerställer att gelskiktet inte störs. När provet har körts längre in i gelén kan bufferten tillsättas i större volymer och oron för att störa gelskiktet är mindre av ett problem. Kolumnen kan återanvändas flera gånger, så länge den underhålls i ett helt hydratiserat tillstånd och rengörs väl (steg 4.6) mellan körningarna.
Alla OMV-reningsförfaranden följer samma inledande steg som inkluderar bakterietillväxt, avlägsnande av bakterieceller och OMV-isolering27. Även om detta "råa" preparat ofta har använts i OMV-studier28, blir det alltmer uppenbart att ett efterföljande reningssteg är nödvändigt för att avlägsna co-fällbara proteiner och andra föroreningar, liksom för att separera OMV-subpopulationer. I OMV-studier slutförs detta reningssteg ofta med densitetsgradientcentrifugation. I eukaryota extracellulära blåsor fältet ökar användningen av SEC för att separera vesikelpopulationer och ta bort föroreningar i betydelse, eftersom det är enklare, snabbare och billigare än DGC29. Dessutom har SEC fördelen att vara möjligt att automatisera, till skillnad från DGC29. Således, medan DGC förblir "guldstandarden" för vesikelisolering i bakteriell OMV-fält, föreslår vi att de många fördelarna med SEC gör det till en extremt användbar, om inte bättre, metod för OMV-rening än DGC. I detta arbete har vi visat att en 1,5 x 50 cm kolonn av Sephacryl S-1000 kan separera två subpopulationer av OMV. Vi har också observerat att tillvägagångssättet kan ta bort nukleinsyror och fria proteiner från OMV-lösningen. Tidigare rapporter har funnit SEC att kunna ta bort gratis LPS från OMV preparat, liksom28.
Sammanfattningsvis föreslår vi att SEC håller mycket löfte vid rening av bakteriella blåsor. Medan vi har visat teknikens förmåga att separera subpopulationer av OMV som produceras av en specifik bakterie (A. actinomycetemcomitans), förväntar vi oss att tekniken kommer att vara extremt värdefull för att analysera andra bakteriella vesikelprover, eftersom det ser ytterligare användning. I synnerhet i och med att de biotekniska tillämpningarna av omstäckandefordon ökar kommer behovet av konsekventa och rena blåspreparat också att öka. SEC är en lovande metod för dessa applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Science Foundation (1554417) och National Institutes of Health (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
