Summary
Bakteriyel veziküller patogenezde önemli roller oynar ve umut verici biyoteknolojik uygulamalara sahiptir. Veziküllerin heterojenliği analiz ve kullanımı zorlaştırır; bu nedenle, değişen boyutlarda vesikleleri ayırmak için basit, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Burada, Aggregatibacter actinomycetemcomitanstarafından üretilen heterojen vezikülleri ayırmak için boyut dışlama kromatografisinin kullanımını gösteriyoruz.
Abstract
Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı, ince bir peptidoglikan tabakası ile ayrılmış bir iç (sitoplazmik) ve dış zardan (OM) oluşur. Büyüme boyunca, dış zar küresel dış membran vezikülleri (OMV' ler) oluşturmak için bleb yapabilir. Bu OMV'ler, konak hücrelere kargo teslimatı ve bakteri hücreleriyle iletişim dahil olmak üzere çok sayıda hücresel işlevde yer almaktadır. Son zamanlarda, aşı ve ilaç dağıtım aracı olarak kullanımları da dahil olmak üzere OMV'lerin terapötik potansiyeli araştırılmaya başlandı. OMV'ler OM'den türetilmiş olsa da, OMV'nin lipit ve protein yükünün genellikle OM'den önemli ölçüde farklı olduğu uzun zamandır takdir edilmektedir. Daha yakın zamanda, bakterilerin birden fazla OMV türünü serbest bırakabileceğine dair kanıtlar keşfedilmiştir ve boyutun konak hücreler tarafından alım mekanizmasını etkileyebileceğine dair kanıtlar mevcuttur. Bununla birlikte, bu alandaki çalışmalar heterojen boyutlu OMV'lerin verimli bir şekilde ayrılmasındaki zorluklarla sınırlıdır. Yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC) geleneksel olarak bu amaç için kullanılmıştır; ancak, bu teknik zaman alıcıdır ve ölçeklendirmek zordur. Öte yandan, boyut dışlama kromatografisi (SEC), daha az hantaldır ve OMV'lerin terapötik kullanımı için gelecekteki gerekli ölçek büyütmeye kendini ödünç verir. Burada, heterojen boyutlu veziküllerin tekrarlanabilir bir şekilde ayrılmasını sağlayan bir SEC yaklaşımını açıklıyoruz, bir test çalışması olarak kullanarak, Aggregatibacter aktinosetemcomitanstarafından üretilen OMV'ler Çapı 150 nm'den 350 nm'den daha büyük. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile doğrulanan "büyük" (350 nm) OMV'ler ve "küçük" (<150 nm) OMV'lerin ayrıştırılmasını gösteriyoruz. Kullanım kolaylığı, tekrarlanabilirliği (kullanıcıdan kullanıcıya dahil) ve ölçek büyütme olasılığı nedeniyle heterojen boyutlu veziküllerin ayrılması için DGC tabanlı teknikler üzerinde SEC tabanlı teknikler öneriyoruz.
Introduction
Gram negatif bakteriler, dış zarlarından elde edilen veziklikleri, dış zar vezikliklerini (OMV' ler) büyüme boyunca serbest bırakır. Bu OMV'ler, DNA / RNA, proteinler, lipitler ve peptidoglikanlar1,2dahil olmak üzere bir dizi önemli biyomolekül taşıyarak hem bakteriler ve konak hem de bakteri hücreleri arasında hücreden hücreye iletişimde önemli roller oynar. Özellikle, OMV'lerin bakteriyel patogenezdeki rolü, bazı virülans faktörleri ve toksinler3, 4 , 5 , 6 , 7,8,9,10,11'dekizenginleşmeleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
OMV'lerin, ana bakterilere ve büyüme aşamasına bağlı olarak 20 ila 450 nm arasında değiştiği bildirilmiştir, çeşitli bakteri türleri heterojen boyutlu OMV'leri serbest bırakır8, 12,13,14, ayrıca protein bileşimlerinde ve konak hücre giriş mekanizmalarında farklılık gösterir12. H. pylori, çapı 20 ila 450 nm arasında değişen OMV'leri serbest bıraktı ve daha küçük OMV'ler daha büyük OMV'lerden daha homojen bir protein bileşimi içeriyordu. Daha da önemlisi, OMV'lerin iki popülasyonunun konak hücreler tarafından farklı mekanizmalar aracılığıyla içselleştirildiği gözlenmiştir12. Buna ek olarak, Aggregatibacter actinomycetemcomitans'ın büyük (>350 nm) OMV'lerden oluşan bir popülasyonla birlikte küçük (<150 nm) OMV'lerden oluşan bir popülasyon saldığını ve OMV'lerin önemli miktarda salgılanan protein toksini içerdiğini gösterdik, lökotoxin (LtxA)15. OMV heterojenitesinin hücresel süreçlerdeki rolü açıkça önemli olmakla birlikte, farklı vezikül popülasyonlarının ayrılması ve analizinde teknik zorluklar bu çalışmaları sınırlamıştır.
Bakteriyel patogenezdeki önemine ek olarak, OMV'ler aşı ve ilaç dağıtım araçları 16 , 17,18,19,20dahil olmak üzere bir dizi biyoteknolojik uygulamada kullanılmak üzere önerilmiştir. Bu tür yaklaşımlarda çevirisel kullanımları için vesicles'in temiz ve monodisperse bir şekilde hazırlanması gerekir. Bu nedenle, etkili ve verimli ayırma yöntemleri gereklidir.
En yaygın olarak, yoğunluk gradyan santrifüjleme (DGC), heterojen boyutlu vezikül popülasyonlarını flagellae ve salgılanan proteinler de dahil olmak üzere hücresel döküntülerden ayırmak için kullanılır21; yöntem ayrıca heterojen boyutlu OMV alt nüfuslarını ayırmak için bir yaklaşım olarak bildirilmiştir12,13,14. Ancak, DGC zaman alıcı, verimsiz ve kullanıcıdan kullanıcıya son derece değişken22'dir ve bu nedenle ölçek büyütme için ideal değildir. Buna karşılık, boyut dışlama kromatografisi (SEC), OMV'leri 21 ,23,24arındırmak için ölçeklenebilir, verimli ve tutarlı bir yaklaşımı temsil eder. Jel filtrasyon ortamı ile dolu uzun (50 cm), yerçekimi akışı, SEC sütununun OMV'lerin alt nüfuslarını verimli bir şekilde arındırmak ve ayırmak için yeterli olduğunu bulduk. Özellikle, bu yaklaşımı A. actinomycetemcomitans OMV'leri "büyük" ve "küçük" alt nüfuslara ayırmak ve protein ve DNA kontaminasyonlarını gidermek için kullandık. Saflaştırma 4 saatten daha kısa bir sürede tamamlandı ve OMV alt nüfuslarının tamamen ayrılması ve enkazın kaldırılması gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tamponların hazırlanması
- ELISA yıkama tamponunu hazırlamak için 3,94 g Tris bazlı, 8,77 g NaCl ve 1 g sığır serum albümin (BSA) ile 1 L deiyonize (DI) su ekleyin. 500 μL polisorbat-20 ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
- Engelleme tamponu hazırlamak için 3,94 g Tris tabanlı, 8,77 g NaCl ve 10 g BSA ekleyin. 500 μL polisorbat-20 ila 1 L DI su ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
- Elution tamponu (PBS) hazırlamak için 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4ve 0,24 g KH2PO 4 ila1 L DI su ekleyin. HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın.
NOT: Bu tamponun 10x'lik bir çözeltisi yapılabilir ve gerektiğinde DI suyu ile seyreltilebilir.
2. OMV numunesinin hazırlanması
- A. actinomycetemcomitans hücrelerini geç üstel faza (0.7'nin 600 nm'sinde optik yoğunluk) büyütün. Hücreleri 10 dakika boyunca 4 °C'de 10.000 x g'da iki kez santrifüjleyarak pelet. Süpernatantı 0,45 μm filtreden geçirin.
- 50 kDa-moleküler ağırlık kesme filtreleri kullanarak bakteri içermeyen süpernatantı konsantre edin. Konsantre çözeltiyi 30 dakika boyunca 4 °C'de 105.000 x g'da ultracentrifuge edin.
- Peleti PBS ve ultracentrifuge'da tekrar sakla (30 dakika boyunca 4 °C'de 105.000 x g).) Peleti 2 mL PBS'de yeniden dirildirin.
3. S-1000 sütununun paketlenerek
- Jel filtrasyon ortamının stok şişesini bir cam karıştırma çubuğuyla karıştırın ve bir cam şişeye sütunu doldurmak için gereken hacmi, ayrıca yaklaşık% 50 fazlalığı (yaklaşık 135 mL) dökün. Bu boncukların yerleşene kadar oturmasına izin verin ve daha sonra fazla sıvıyı boşaltın. Boncukları elüsyon tamponunda yeniden depolar, böylece nihai çözelti yaklaşık% 70 (hacme göre) jel, % 30 tampon olur. Çözümü vakum altında gazdan arındırın.
- Cam sütunu bir halka standı kullanarak dikey olarak monte edin ve sütunun duvarlarını ıslatmak için elution tamponu ile doldurun. Sütunda yalnızca yaklaşık 1 cm arabellek kalana kadar arabelleği boşaltın.
- Kabarcıklar oluşturmadan, sütunun içine dikkatlice pipet boncukları, sütunu en üste doldurun. Bu işlem boyunca fazla arabelleği boşaltmaya devam edin. Sütunun üstüne ek boncuk eklemeden önce boncukların tamamen yerleşmesine izin vermeyin. Sütun, sütun rezervuarının altında yaklaşık 2 cm yüksekliğe paketlenmelidir.
4. Numunenin yüklenmesi ve kesirlerin toplanması
- Elution tamponu vakum altında gazdan arındırın. Sütunu iki sütun hacmi (180 mL) elution arabelleği ile yıkayın.
- Kalan arabelleğin sütunu tam olarak girmesine izin verin. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştıktan sonra, omv içeren 2 mL'lik bir örneği (yaklaşık 100 - 200 nmol / L lipit konsantrasyonda) boncukların yüzeyine dikkatlice pipetleyin, sütunun üstündeki boncuklardan hiçbirini rahatsız etmemeye dikkat edin. Numunenin jel tabakasının üzerinde hiçbir sıvı kalmadığında jelin tam olarak girmesine izin verin.
- Jel sütununun üzerine dikkatlice ve yavaşça elution tamponu ekleyin. Numune seyreltmesine neden olacağından, jelin üst tabakasını rahatsız etmeyin.
- Sütunun altına tek bir 50 mL tüp yerleştirin ve sütunu açın. Eluent'in ilk 20 mL'sini toplayın. Sütunun asla kurumasını sağlamak için gerektiğinde, sütunun üstüne dikkatlice ek elution arabelleği ekleyin.
- Sütunun altına bir dizi 1,5 mL tüp yerleştirin. Sütunu başlatın ve her tüpte bir dizi 1 mL numune toplayın. Örnekler toplanırken, gerektiğinde sütunun üstüne elution arabelleği eklemeye devam edin. 96 kesir toplanana kadar tekrarlayın. Sütunu durdurun.
NOT: Numuneler uzun süreli depolama için -20 °C'de veya bir sonraki analize kadar kısa süreli depolama için 4 °C'de saklanmalıdır. - Sütunu temizlemek için, sütun boyunca 0,1 M NaOH'luk bir sütun birimi (90 mL) çalıştırın. Sütun boyunca iki sütun birimi (180 mL) elution arabelleği çalıştırın.
5. Örnek analizi
- Lipid konsantrasyonunu her fraksiyonda ölçmek için, her fraksiyonun pipet 50 μL'si 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusuna. Her kuyuya 2,5 μL lipofilik boya ekleyin. 15 sn kuluçkaya yatır. 515 nm'lik bir heyecan dalga boyu ve 640 nm emisyon dalga boyu ile bir plaka okuyucusunda floresan yoğunluğunu ölçün. Her örnekteki tüm lipitlerin fraksiyonunu hesaplamak için, tüm emisyon yoğunluklarını toplayın ve her bir yoğunluğu toplamla bölün.
- Belirli bir proteinin konsantrasyonunu ölçmek için, her fraksiyonun 100 μL pipetini elisa immün plakanın tek bir kuyusuna koyun. 25 °C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
- Örnekleri dene. Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.
- Her kuyuya 200 μL blokaj tamponu ekleyin ve 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Decant.
- 4 °C'de bir gecede 100 μL bloke tampon artı birincil antikor (saflaştırılmış antikor için 1:10.000; saflaştırılmış antikor için 1:10) ile inkübte plakalar. Decant.
- Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.
- Her kuyuya 100 μL ELISA yıkama tamponu ve ikincil antikor (1:30.000) ekleyin. 25 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
- Her kuyuya 200 μL ELISA yıkama tamponu ekleyin ve dekant ekleyin. Toplam beş yıkama için dört kez tekrarlayın.
- 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) tek adımlı çözeltinin 100 μL'sini ekleyin ve 15-30 dakika boyunca veya mavi bir renk gelişene kadar kuluçkaya yatırın. TMB reaksiyonu 50 μL durdurma çözümü ile durdurun.
- Bir plaka okuyucuda, her bir kuyunun emiciliğini 450 nm dalga boyunda okuyun.
- Toplam protein konsantrasyonunu ölçmek için, emiciliği bir UV-vis spektrofotometre kullanarak her kesirde280 nm (A 280)dalga boyunda kaydedin.
İletişim kuralının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: SEC yordamının şeması. Sütun, kabarcıkları ve süreksizlikleri önlemek için gazdan arındırılmış jel filtrasyon ortamı ile doludur, daha sonra iki sütun hacimli elution tamponu ile yıkanır. Daha sonra, numune jel ambalajını bozmadan jelin üstüne dikkatlice pipetlendirilir. Sütun açılır ve numune jel tamamen girene kadar çalıştırılır. Bu noktada, sütunun üstüne tampon yerleştirilir ve ilk 20 mL elüat toplanır. Daha sonra, bir dizi 1-mL fraksiyon toplanır. Bu fraksiyonlar daha sonra lipit ve protein içeriğinin analizi için 96 kuyulu bir plakaya veya 96 kuyulu bir immün plakaya yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 bu yöntemden elde edilen temsili sonuçları gösterir. A. actinomycetemcomitans strain JP2 tarafından üretilen OMV'ler ilk olarak ultrasantrifüjasyon15kullanılarak kültür üstnatantından arındırıldı. Daha önce bu türün biri yaklaşık 300 nm ve biri yaklaşık 100 nm15çapında olmak üzere iki OMV popülasyonu ürettiğini bulduk. Bu OMV popülasyonlarını ayırmak için, yukarıda açıklanan SEC protokolünü kullanarak örneği arındırdık. Her fraksiyon lipofilik boya kullanılarak lipit içeriği ve enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) veya bir immünoblot kullanılarak toksin (LtxA) içeriği için analiz edildi. Lipid ve toksin konsantrasyonları yüzde olarak rapor edilir, burada "%lipid" numunenin toplam lipit içeriğinin yüzde kaçının her kesirde olduğunu ve "%toksin" her kesirde numunenin toplam toksin içeriğinin yüzde kaçını gösterir.
Şekil 2A, her biri farklı bir kullanıcı tarafından gerçekleştirilen üç ayrı saflaştırmadan standart sapmalarla ortalama lipofilik boya sonuçlarını göstererek bu tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermektedir. "Büyük" OMV'lere (kesir sayısı 13) ve "küçük" OMV'lere (kesir sayısı 25) karşılık gelen iki ayrı lipit zirvesi gözlenir. Dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanarak bu tepelerdeki OMV'lerin boyutunu doğruladık ve OMV'lerin ortalama çaplarını İncir'de gösterildiği gibi sırasıyla 296,6 nm ve 142,6 nm olarak bulduk. 2A. Buna karşılık, ultracentrifugation sonra ama SEC saflaştırma önce OMV numune ortalama çapı daha önce 161.0 nm15olarak bulunmuştur.
Şekil 2B'de, LTXA25'ekarşı monoklonal antikor ile ELISA kullanılarak elde edilen her fraksiyondaki LtxA miktarı, A panelinden lipit konsantrasyonunda üst üste gösterilmiştir. Bu teknik, toksinin öncelikle OMV'lerin bir alt nüfus ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Şekil 2C, aynı anti-LtxA monoklonal antikor25ile bir immünoblot tekniği kullanılarak ölçülen her fraksiyondaki LtxA miktarını gösterir. Genel eğilim Şekil 2B'degözlemlenene benzer olsa da, immünoblot yaklaşımı ELISA tekniğinden çok daha az hassastır ve bu da daha gürültülü profillerle sonuçlanır. Şekil 2D, lipid konsantrasyon profilinde üst üste bindirilir A280kullanılarak ölçülen her bir fraksiyondaki toplam protein konsantrasyonunun yüzdesini gösterir. Bu panel, SEC'in 60'tan büyük kesirlerde yüksek A280 değerlerinin kanıt ettiği gibi, OMV preparatlarından önemli miktarda serbest protein çıkarabildiğini göstermektedir. (Aslında, proteinin çoğu, OMV içermeyen bu fraksiyonlarda bulunur ve bu da çok miktarda proteinin OMV'lerle birlikte safladığını gösterir.) Ek olarak, bu sonuç, toplam protein konsantrasyonunun belirli proteinlerin konsantrasyonu ile mutlaka ilişkili olmadığını göstermektedir. A. actinomycetemcomtians OMV'ler söz konusu olduğunda, LtxA öncelikle daha büyük OMV'lerin popülasyonu ile ilişkilendirirken, toplam proteinin daha fazlası daha küçük OMV'lerle ilişkilidir.
Bu temsili sonuçlar birlikte, OMV saflaştırması için SEC protokolünün bir dizi önemli özelliğidir. İlk olarak, teknik kullanıcılar arasında bile oldukça tekrarlanabilir. İkincisi, her kesirde OMV'leri tespit etmek için lipofilik bir boya kullanımı basit ve güvenilir bir yöntemdir. Üçüncüsü, belirli protein konsantrasyonlarını tespit etmek için ELISA bir immünoblottan daha sağlamdır. Dördüncü olarak SEC, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere büyük miktarlarda safsızlıkları giderebilir.
Şekil 2: Temsili sonuçlar. A. actinomycetemcomitans JP2 OMV'ler SEC sütunundan geçirildi ve her fraksiyonda lipofilik boya ve toksin (LtxA) içeriği monoklonal antikor kullanılarak lipid içeriği analiz edildi. (A) Her kesirdeki ortalama lipit içeriği, üç denemeden itibaren toplam lipit içeriğinin yüzdesi olarak raporlanır. Her veri noktası ortalama ± standart sapması temsil eder. (B) Elisa tarafından monoklonal anti-LtxA antikoru ile ölçülen toplam LtxA içeriğinin yüzdesi olarak bildirilen her kesirdeki LtxA içeriği. (C) Monoklonal anti-LtxA antikoru olan bir immünoblot tarafından ölçülen toplam LtxA içeriğinin bir yüzdesi olarak bildirilen her fraksiyonun LtxA içeriği. (D) A280ile ölçülen toplam protein içeriğinin yüzdesi olarak bildirilen her bir fraksiyonun toplam protein içeriği. Bazı veriler John Wiley ve Sons Ltd.'den izin alınarak Chang ve ark.26'dan çoğaltılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bakteriyel OMV alt nüfuslarının basit, hızlı ve tekrarlanabilir ayrımı için bir protokol sağladık. Teknik nispeten düz olsa da, sütunda verimli ayırmanın gerçekleşmesini sağlamak için son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bazı adımlar vardır. İlk olarak, hava kabarcıklarını önlemek için jelin sütuna dikkatlice ve yavaşça yüklenmesi esastır. Kolonu yüklemeden önce jeli oda sıcaklığında birkaç saat bırakmanın jelin dengelenmesine izin verdiğini ve kolon içindeki kabarcık oluşumunu en aza indirdiğini gözlemledik. Jel sütuna pipetlendiğinde, türbülansı en aza indirmek için sütunun yan tarafı boyunca dikkatlice pipetlenmelidir. Yükleme sırasında her zaman, yerleşik jeldeki süreksizlikleri önlemek için sütunda fazla tampon tutulmalıdır. Bir disjunction meydana gelirse, jeli yeniden canlandırmak için yukarı ve aşağı daha fazla tampon ve pipet ekleyin.
Benzer şekilde, sütunu örnekle yüklemek kritik öneme sahiptir. Örnek sütundan geçerken seyreltileceğinden, yüklenen örnek SEC tarafından ayrılmadan önce yeterince yoğunlaştırılmalıdır. A. actinomycetemcomitans OMV'ler için, lipitlerin yaklaşık 100-200 nmol / L içeren 1 mL'lik bir örneğin ideal olduğunu bulduk. Örnek, jel katmanını bozmadan sütunun üst kısmına dikkatlice yüklendikten sonra, örnek jel sütununa tam olarak girene kadar sütun çalıştırılmalıdır. Bu noktada, bir arabellek katmanının jelin üstüne dikkatlice eklenebilmesi için sütun durdurulmalıdır. Jel tabakasının bozulmamasını sağlamak için yalnızca küçük bir miktarda (~ 1 mL) tampon yüklemek yararlıdır. Örnek jel içine daha fazla çalıştırıldıktan sonra, tampon daha büyük birimlerde eklenebilir ve jel tabakasını bozma endişesi daha az sorundur. Sütun, tamamen nemli bir durumda muhafaza edildiği ve çalıştırmalar arasında iyi temizlenebildiği sürece (Adım 4.6) birden çok kez yeniden kullanılabilir.
Tüm OMV saflaştırma prosedürleri bakteri üremesi, bakteri hücrelerinin uzaklaştırılması ve OMV izolasyonu27'yiiçeren aynı ilk adımları izler. Bu "ham" preparat yaygın olarak OMV çalışmalarında kullanılsa da28, birlikte çöketen proteinleri ve diğer kirleticileri çıkarmak ve OMV ek stoklamalarını ayırmak için sonraki bir saflaştırma adımının gerekli olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. OMV çalışmalarında, bu saflaştırma adımı genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme kullanılarak tamamlanır. Ökaryotik hücre dışı vezikül alanında, vezikül popülasyonlarını ayırmak ve kirleticileri gidermek için SEC kullanımı, DGC29'dandaha basit, daha hızlı ve daha ucuz olduğu için önemi artmaktadır. Buna ek olarak, SEC DGC29'un aksine otomatikleştirmenin mümkün olma avantajına sahiptir. Bu nedenle, DGC bakteriyel OMV alanında veziklin izolasyonunun "altın standardı" olmaya devam ederken, SEC'in sayısız avantajının onu DGC'den daha iyi olmasa da son derece yararlı bir OMV saflaştırma yöntemi haline getirmesini öneriyoruz. Bu çalışmada, Sephacryl S-1000'in 1,5 x 50 cm'lik bir sütununun OMV'lerin iki alt nüfusunu ayırabildiğini göstermiş olduk. Yaklaşımın nükleik asitleri ve serbest proteinleri OMV çözeltisinden çıkarabildiğini de gözlemledik. Önceki raporlar SEC'in ücretsiz LPS'yi OMV preparatlarından kaldırabildiğini buldu,28.
Sonuç olarak, SEC'in bakteriyel veziklinlerin saflaştırılmasında çok fazla söz sahibi olduğunu öneriyoruz. Tekniğin belirli bir bakteri (A. actinomycetemcomitans) tarafından üretilen OMV'lerinsubpopulasyonlarını ayırma yeteneğini göstermiş olsak da, tekniğin ek kullanım gördüğü için diğer bakteriyel veziklin örneklerinin analizinde son derece değerli bulunacağını öngörüyoruz. Özellikle, OMV'lerin biyoteknolojik uygulamaları arttıkça, tutarlı ve saf vezne preparatlarına olan ihtiyaç da artacaktır; SEC bu uygulamalar için umut verici bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rapor etmek için herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (1554417) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DE027769) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
