Summary
बैक्टीरियल वेसिकल्स रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और उनमें आशाजनक जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोग होते हैं। वेसिकल्स की विषमता विश्लेषण और उपयोग को जटिल बना देती है; इसलिए, वेसिकल्स के अलग-अलग आकारों को अलग करने के लिए एक सरल, प्रजनन योग्य विधि आवश्यक है। यहां, हम एग्रीगेटिबेक्टर ऐक्टिनोमायेस्टेमकोमिटन्सद्वारा उत्पादित विषम वेसिकल्स को अलग करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका दीवार में एक आंतरिक (साइटोप्लाज्मिक) और बाहरी झिल्ली (ओम) होते हैं, जो एक पतली पेप्टिडोग्लाइकन परत से अलग होते हैं। विकास के दौरान, बाहरी झिल्ली गोलाकार बाहरी झिल्ली वेसिकल्स (ओएमवी) बनाने के लिए ब्लेब कर सकती है। ये ओएमवी कई सेलुलर कार्यों में शामिल हैं जिनमें कार्गो डिलीवरी कोशिकाओं की मेजबानी और बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ संचार शामिल है। हाल ही में ओएमवी की चिकित्सकीय क्षमता का पता लगाया जाने लगा है, जिसमें टीके और दवा वितरण वाहनों के रूप में उनका इस्तेमाल शामिल है । हालांकि OMVs ओम से प्राप्त कर रहे हैं, यह लंबे समय से सराहना की गई है कि लिपिड और OMV के प्रोटीन कार्गो अलग है, अक्सर महत्वपूर्ण है, ओम की है कि से । हाल ही में, सबूत है कि बैक्टीरिया OMVs के कई प्रकार जारी कर सकते है की खोज की गई है, और सबूत मौजूद है कि आकार मेजबान कोशिकाओं द्वारा उनके तेज के तंत्र को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, इस क्षेत्र में अध्ययन कुशलता से विषम आकार OMVs को अलग करने में कठिनाइयों से सीमित हैं । इस उद्देश्य के लिए परंपरागत रूप से घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र (डीजीसी) का उपयोग किया गया है; हालांकि, यह तकनीक समय लेने वाली है और स्केल-अप करना मुश्किल है। आकार अपवर्जन गुणसूत्र (एसईसी), दूसरी ओर, कम बोझिल है और ओएमवी के चिकित्सीय उपयोग के लिए आवश्यक भविष्य के पैमाने पर उधार देता है। यहां, हम एक एसईसी दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो एक परीक्षण मामले के रूप में उपयोग करते हुए विषम आकार के वेसिकल्स के प्रजनन योग्य पृथक्करण को सक्षम बनाता है, एग्रीगेटिबैक्टर ऐक्टिनोमायिस्टेमकोमिटन द्वाराउत्पादित ओएमवी, जो व्यास में 150 एनएम से कम से 350 एनएम से अधिक है। हम गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) द्वारा सत्यापित "बड़े" (350 एनएम) ओएमवी और "छोटे" (<150 एनएम) ओएमवी के पृथक्करण का प्रदर्शन करते हैं। हम उपयोग में आसानी, प्रजनन क्षमता (उपयोगकर्ता-से-उपयोगकर्ता सहित) और स्केल-अप के लिए संभावना के कारण विषम आकार के वेसिकल्स को अलग करने के लिए डीजीसी-आधारित तकनीकों पर एसईसी-आधारित तकनीकों की सलाह देते हैं।
Introduction
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया विकास के दौरान अपने बाहरी झिल्ली, तथाकथित बाहरी झिल्ली वेसिकल्स (ओएमवी) से प्राप्त वेसिकल्स जारी करते हैं। ये ओएमवी कोशिका-से-कोशिका संचार में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं, बैक्टीरिया और मेजबान दोनों के साथ-साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं के बीच, डीएनए/आरएनए, प्रोटीन, लिपिड, और पेप्टिडोगलाइकन1,2सहित कई महत्वपूर्ण जैव अणुओं को ले जाकर। विशेष रूप से, कुछ उग्रताकारकों और विषाक्त पदार्थों 3 , 4,5,6,7,8,9,11में उनके संवर्धन के कारण जीवाणु रोगजनन में ओएमवी की भूमिका का व्यापक अध्ययन किया गया है ।
ओएमवी को 20 से 450 एनएम तक आकार में होने की सूचना दी गई है, जो मूल बैक्टीरिया और विकास चरण के आधार पर है, जिसमें कई प्रकार के बैक्टीरिया विषम आकार के ओएमवी8,12,13,14जारी करते हैं, जो उनकी प्रोटीन संरचना और मेजबान सेल प्रवेश12के तंत्र में भी भिन्न होते हैं। एच पाइलोरी ने 20 से ४५० एनएम व्यास में ओएमवी जारी किया, जिसमें छोटे ओएमवी बड़े ओएमवी की तुलना में अधिक सजातीय प्रोटीन संरचना वाले थे । महत्वपूर्ण बात यह है कि ओएमवी की दो आबादी को मेजबान कोशिकाओं द्वारा विभिन्न तंत्रों के माध्यम से आंतरिक रूप से देखा गयाथा 12। इसके अलावा, हमने दिखा दिया है कि एग्रीगेटिबैक्टर ऐक्टिविस्ट्स ऑकिमेंटोमीमेट्स बड़े (>350 एनएम) ओएमवी की आबादी के साथ छोटे (<150 एनएम) ओएमवी की आबादी जारी करता है, जिसमें ओएमवी के साथ एक स्रावित प्रोटीन टॉक्सिन, ल्यूकोटेक्सिन (LtxA)15की एक महत्वपूर्ण मात्रा होती है। जबकि सेलुलर प्रक्रियाओं में OMV विषमता की भूमिका स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण है, वेसिकल्स की अलग आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने में तकनीकी कठिनाइयों ने इन अध्ययनों को सीमित कर दिया है।
जीवाणु रोगजनकता में उनके महत्व के अलावा, ओएमवी को कई जैव प्रौद्योगिकीय अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए प्रस्तावित कियागया है, जिसमें टीके और दवा वितरण वाहन16, 17,18,19,20शामिल हैं । ऐसे दृष्टिकोणों में उनके अनुवादात्मक उपयोग के लिए, वेसिकल्स की एक स्वच्छ और मोनोडिस्पर्स तैयारी की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, जुदाई के प्रभावी और कुशल तरीके आवश्यक हैं।
सबसे अधिक, घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र (डीजीसी) का उपयोग सेलुलर मलबे से विषम आकार की वेसिकल आबादी को अलग करने के लिए किया जाता है, जिसमें फ्लैगेल और स्रावित प्रोटीन21शामिल हैं; विधि भी विषम आकार OMV उपजनसंख्या12 , 13,14अलग करने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में सूचित किया गया है . हालांकि, डीजीसी समय लेने वाली, अक्षम और अत्यधिक परिवर्तनीय उपयोगकर्ता-से-उपयोगकर्ता22 है और इसलिए, स्केल-अप के लिए आदर्श नहीं है। इसके विपरीत, आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) ओएमवीएस21, 23, 24को शुद्ध करने के लिए एकस्केलेबल,कुशल और सुसंगत दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। हमने पाया है कि एक लंबा (50-सेमी), गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह, एसईसी कॉलम, जेल निस्पंदन माध्यम से भरा हुआ ओएमवी की उप-जनसंख्या को कुशलतापूर्वक शुद्ध और अलग करने के लिए पर्याप्त है। विशेष रूप से, हमने इस दृष्टिकोण का उपयोग ए ऐक्टिनोमायसिस्टेक्टकमेमेंट को "बड़े" और "छोटे" उप-आबादी में अलग करने के साथ-साथ प्रोटीन और डीएनए संदूषण को हटाने के लिए किया। शुद्धि 4 घंटे से भी कम समय में पूरा किया गया था, और OMV उपआबादी का पूरा अलगाव और मलबे को हटाने पूरा किया गया था ।
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Protocol
1. बफ़र्स की तैयारी
- एलिसा वॉश बफर तैयार करने के लिए, 3.94 ग्राम ट्रिस-बेस, 8.77 ग्राम एनएसीएल, और 1 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को 1 एल डिओनाइज्ड (डीआई) पानी जोड़ें। 500 μL पॉलीसोरबेट-20 जोड़ें। एचसीएल या नाओएच का उपयोग करके पीएच को 7.2 पर समायोजित करें।
- ब्लॉकिंग बफर तैयार करने के लिए, 3.94 ग्राम ट्राइस-बेस, 8.77 ग्राम एनएसीएल और 10 ग्राम बीएसए जोड़ें। डीआई वाटर के 500 माइक्रोन पॉलीसोर्बेटी-20 से 1 एल जोड़ें। एचसीएल या नाओएच का उपयोग करके पीएच को 7.2 पर समायोजित करें।
- एल्यूशन बफर (पीबीएस) तैयार करने के लिए, 8.01 ग्राम एनएसीएल, 2.7 ग्राम केसीएल, 1.42 ग्राम एनए2एचपीओ4और 0.24 ग्राम केएच2पीओ 4 से 1 एलडीआई पानी जोड़ें। एचसीएल या नाओएच का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
नोट: इस बफर का 10x समाधान बनाया जा सकता है और आवश्यकतानुसार डीआई पानी से पतला किया जा सकता है।
2. OMV नमूना की तैयारी
- ए ऐक्टिनोमायसेस्टेम कोमिटंस कोशिकाओं को देर से घातीय चरण (ऑप्टिकल घनत्व 0.7 के 600 एनएम पर) तक बढ़ाएं। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x ग्राम पर दो बार अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।
- 50 केडीए-आणविक वजन कट-ऑफ फिल्टर का उपयोग करके बैक्टीरिया मुक्त सुपरनेट को केंद्रित करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 105,000 x ग्राम पर केंद्रित समाधान।
- पीबीएस और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में गोली को फिर से रीसुस्ल करें (30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 105,000 x ग्राम) पीबीएस के 2 एमएल में गोली को फिर से रीस्ब करें।
3. एस-1000 कॉलम पैकिंग
- एक ग्लास हलचल रॉड के साथ जेल छानने का काम माध्यम के शेयर बोतल मिश्रण और एक गिलास की बोतल में बाहर डालना कॉलम को भरने के लिए आवश्यक मात्रा, प्लस लगभग ५०% अतिरिक्त (लगभग १३५ एमएल) । इन मोतियों को तब तक बैठने दें जब तक कि वे बस न जाएं, और फिर अतिरिक्त तरल को कम कर दें। एल्यूशन बफर में मोतियों को फिर से रीसुड करें, ताकि अंतिम समाधान लगभग 70% (मात्रा से) जेल, 30% बफर हो। वैक्यूम के तहत समाधान को डेगास करें।
- ग्लास कॉलम को एक रिंग स्टैंड का उपयोग करके खड़ी करें और कॉलम की दीवारों को गीला करने के लिए एल्यूशन बफर से भरें। बफर को तब तक छान लें जब तक कि कॉलम में केवल 1 सेमी बफर शेष न हो जाए।
- बुलबुले बनाने के बिना, कॉलम में ध्यान से मोतियों को पिपेट करें, कॉलम को शीर्ष पर भरें। इस प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त बफर को छानते रहें। स्तंभ के शीर्ष पर अतिरिक्त मोतियों को जोड़ने से पहले मोतियों को पूरी तरह से व्यवस्थित न होने देना सुनिश्चित करें। कॉलम जलाशय के नीचे लगभग 2 सेमी की ऊंचाई तक पैक किया जाना चाहिए।
4. नमूना लोड करना और अंशों को इकट्ठा करना
- वैक्यूम के तहत एल्यूशन बफर को डेगास करें। एल्यूशन बफर के दो कॉलम-वॉल्यूम (180 एमएल) के साथ कॉलम धोएं।
- शेष बफर को पूरी तरह से कॉलम दर्ज करने की अनुमति दें। एक बार बफर जेल परत के शीर्ष पर पहुंच गया है, ध्यान से एक 2-एमएल OMVs युक्त नमूना (लगभग १००-२०० nmol/L की एक लिपिड एकाग्रता पर) मोतियों की सतह पर, सावधान किया जा रहा है कॉलम के शीर्ष पर मोतियों में से किसी को परेशान नहीं है । नमूना को पूरी तरह से जेल में प्रवेश करने की अनुमति दें, यानी, जब कोई तरल जेल परत से ऊपर नहीं रहता है।
- जेल कॉलम के शीर्ष पर सावधानी से और धीरे-धीरे एल्यूशन बफर जोड़ें। जेल की शीर्ष परत को परेशान न करें, क्योंकि इससे नमूना कमजोर पड़ जाएगा।
- कॉलम के नीचे एक 50-एमएल ट्यूब रखें और कॉलम खोलें। एलेंट के पहले 20 एमएल को इकट्ठा करें। कॉलम के शीर्ष पर अतिरिक्त एल्यूशन बफर जोड़ें, ध्यान से, के रूप में यह सुनिश्चित करने के लिए की जरूरत है कॉलम सूखी कभी नहीं है ।
- कॉलम के नीचे 1.5 एमएल ट्यूब की एक श्रृंखला रखें। कॉलम शुरू करें और प्रत्येक ट्यूब में 1-एमएल नमूनों की एक श्रृंखला एकत्र करें। चूंकि नमूने एकत्र किए जा रहे हैं, इसलिए आवश्यक रूप से कॉलम के शीर्ष पर एल्यूशन बफर जोड़ना जारी रखें। 96 अंश एकत्र किए जाने तक दोहराएं। कॉलम बंद करो।
नोट: नमूनों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे के विश्लेषण तक संग्रहीत किया जाना चाहिए। - कॉलम को साफ करने के लिए, कॉलम के माध्यम से 0.1 एम नाओएच का एक कॉलम वॉल्यूम (90 एमएल) चलाएं। कॉलम के माध्यम से एल्यूशन बफर के दो कॉलम वॉल्यूम (180 एमएल) चलाएं।
5. नमूना विश्लेषण
- प्रत्येक अंश में लिपिड एकाग्रता को मापने के लिए, प्रत्येक अंश के 50 माइक्रोन को 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में। प्रत्येक अच्छी तरह से, लिपोफिलिक डाई के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। 15 एस के लिए इनक्यूबेट । 515 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 640 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक प्लेट रीडर पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। प्रत्येक नमूने में सभी लिपिड के अंश की गणना करने के लिए, उत्सर्जन तीव्रता के सभी राशि और कुल द्वारा प्रत्येक व्यक्तिगत तीव्रता विभाजित ।
- एक विशेष प्रोटीन की एकाग्रता को मापने के लिए, एक एलिसा इम्यूनो-प्लेट के एक कुएं में प्रत्येक अंश के पिपेट 100 माइक्रोन। 3 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- नमूनों को डिकेंट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से और डिकेंट में एलिसा वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। कुल पांच वॉश के लिए चार बार दोहराएं।
- प्रत्येक कुएं में बफर को अवरुद्ध करने के 200 माइक्रोन जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। डिकेंट।
- 100 माइक्रोन ब्लॉकिंग बफर प्लस प्राइमरी एंटीबॉडी (शुद्ध एंटीबॉडी के लिए 1:10,000; 1:10 अप्रापित एंटीबॉडी के लिए) के साथ इनक्यूबेट प्लेटें रात 4 डिग्री सेल्सियस पर। डिकेंट।
- प्रत्येक अच्छी तरह से और डिकेंट में एलिसा वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। कुल पांच वॉश के लिए चार बार दोहराएं।
- प्रत्येक कुएं में एलिसा वॉश बफर प्लस सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:30,000) के 100 माइक्रोन जोड़ें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- प्रत्येक अच्छी तरह से और डिकेंट में एलिसा वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। कुल पांच वॉश के लिए चार बार दोहराएं।
- 3,3', 5,5'-टेट्रामेथाइलबेंजीडीन (टीएमबी) वन-स्टेप समाधान और 15-30 मिनट के लिए या जब तक नीला रंग विकसित नहीं होता है तब तक 100 माइक्रोल जोड़ें। रोक समाधान के 50 माइक्रोन के साथ TMB प्रतिक्रिया बंद करो।
- एक प्लेट रीडर पर, 450 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को पढ़ें।
- कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए, यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, प्रत्येक अंश के 280 एनएम (ए280)की तरंगदैर्ध्य पर अवशोषण रिकॉर्ड करें।
प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है ।
चित्रा 1:एसईसी प्रक्रिया की योजनाबद्ध। कॉलम को बुलबुले और विच्छेदन से बचने के लिए सावधानी से डिगैस्ड जेल निस्पंदन माध्यम से पैक किया जाता है, फिर एल्यूशन बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ धोया जाता है। इसके बाद, जैल पैकिंग को बाधित किए बिना, नमूना जेल के शीर्ष पर सावधानीपूर्वक पाइप किया जाता है। कॉलम खोला जाता है और तब तक चलाया जाता है जब तक कि नमूना पूरी तरह से जेल में प्रवेश नहीं करता है। इस बिंदु पर, बफर को कॉलम के शीर्ष पर रखा गया है, और एलुएट का पहला 20 एमएल एकत्र किया जाता है। इसके बाद, 1-एमएल अंशों की एक श्रृंखला एकत्र की जाती है। इन अंशों को लिपिड और प्रोटीन सामग्री के विश्लेषण के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट या 96-अच्छी तरह से इम्यूनो-प्लेट में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Representative Results
चित्रा 2 इस विधि से प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। ए ऐक्टिनोमायसेमिककोमिटियंस स्ट्रेन जेपी 2 द्वारा उत्पादित ओएमवी को सबसे पहले अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन15का उपयोग करके संस्कृति सुपरनेटेंट से शुद्ध किया गया था। हमने पहले पाया कि यह तनाव ओएमवी की दो आबादी पैदा करता है, एक के बारे में 300 एनएम के व्यास के साथ और एक के बारे में 100 एनएम15के व्यास के साथ। इन OMV आबादी को अलग करने के लिए, हमने ऊपर वर्णित एसईसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके नमूना शुद्ध किया। लिपोफिलिक डाई का उपयोग करके लिपिड सामग्री के लिए और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) या इम्यूनोब्लॉट का उपयोग करके विषाक्त (एलेक्सा) सामग्री के लिए प्रत्येक अंश का विश्लेषण किया गया था। लिपिड और विष सांद्रता प्रतिशत के रूप में सूचित कर रहे हैं, जहां "% लिपिड" इंगित करता है कि नमूने की कुल लिपिड सामग्री का प्रतिशत प्रत्येक अंश में है और "% विष" इंगित करता है कि नमूने की कुल विष सामग्री का प्रतिशत प्रत्येक अंश में है।
चित्रा 2A तीन अलग-अलग शुद्धिकरण से मानक विचलन के साथ औसत लिपोफिलिक डाई परिणाम दिखाता है, प्रत्येक एक अलग उपयोगकर्ता द्वारा किया जाता है, जो इस तकनीक की प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करता है। दो अलग-अलग लिपिड चोटियों को देखा जाता है, जो "बड़े" ओएमवी (अंश संख्या 13) और "छोटे" ओएमवी (अंश संख्या 25) के अनुरूप होते हैं। हमने गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का उपयोग करके इन चोटियों में ओएमवी के आकार की पुष्टि की और पाया कि ओएमवी के औसत व्यास 13 और 25 अंशों में क्रमशः 296.6 एनएम और 142.6 एनएम हैं, जैसा कि अंजीर में दिखाया गया है। 2A. इसकी तुलना में, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के बाद ओएमवी नमूने का औसत व्यास लेकिन इससे पहले एसईसी शुद्धिकरण पहले 161.0 एनएम15पाया गया था।
चित्रा 2Bमें, प्रत्येक अंश में एलेक्सा की मात्रा, एलेक्सा25के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एलिसा का उपयोग करके प्राप्त की गई, पैनल ए से लिपिड एकाग्रता पर मढ़ा हुआ दिखाया गया है। यह तकनीक दर्शाती है कि विष मुख्य रूप से ओएमवी की एक उपआबादी के साथ जुड़ा हुआ है। चित्रा 2C प्रत्येक अंश में एलटेक्सा की मात्रा दिखाता है, जिसे एक ही एंटी-एलटीएक्सए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी25के साथ इम्यूनोब्लॉट तकनीक का उपयोग करके मापा जाता है, जो पैनल ए से लिपिड एकाग्रता पर मढ़ा जाता है। जबकि समग्र प्रवृत्ति चित्रा 2 बीमें देखी गई चीज़ों के समान है, इम्यूनोब्लॉट दृष्टिकोण एलिसा तकनीक की तुलना में बहुत कम संवेदनशील है, जिसके परिणामस्वरूप शोर करने वाले प्रोफाइल हैं। चित्रा 2D प्रत्येक अंश में कुल प्रोटीन एकाग्रता का प्रतिशत दिखाता है, जो280ए का उपयोग करके मापा जाता है, लिपिड एकाग्रता प्रोफ़ाइल पर मढ़ा जाता है। यह पैनल दर्शाता है कि एसईसी OMV तैयारी से मुफ्त प्रोटीन की महत्वपूर्ण मात्रा को हटाने में सक्षम है, जैसा कि 60 से अधिक अंशों में उच्च ए280 मूल्यों द्वारा सबूत है। (वास्तव में, अधिकांश प्रोटीन इन अंशों में पाया जाता है, जिसमें ओएमवी नहीं होते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं कि ओएमवी के साथ बड़ी मात्रा में प्रोटीन सह-शुद्ध होता है। इसके अलावा, इस परिणाम से पता चलता है कि कुल प्रोटीन एकाग्रता जरूरी विशिष्ट प्रोटीन की एकाग्रता के साथ सहसंबंधित नहीं है। ए ऐक्टिनोमायसिस्टेमकॉम्टियंस ओएमवी के मामले में, एलटेक्सा मुख्य रूप से बड़े ओएमवी की आबादी के साथ संबद्ध करता है, जबकि छोटे ओएमवी के साथ कुल प्रोटीन एसोसिएट्स का अधिक।
साथ में, ये प्रतिनिधि परिणाम OMV शुद्धिकरण के लिए एसईसी प्रोटोकॉल की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, तकनीक अत्यधिक प्रजनन योग्य है, यहां तक कि उपयोगकर्ताओं के बीच भी। दूसरा, प्रत्येक अंश में ओएमवी का पता लगाने के लिए एक लिपोफिलिक डाई का उपयोग एक सरल और विश्वसनीय विधि है। तीसरा, विशिष्ट प्रोटीन सांद्रता का पता लगाने के लिए, एलिसा एक इम्यूनोब्लॉट की तुलना में अधिक मजबूत है। चौथा, एसईसी प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित बड़ी मात्रा में अशुद्धियों को दूर करने में सक्षम है।
चित्रा 2:प्रतिनिधि परिणाम। A. actinomycetemcomitans JP2 OMVs एसईसी कॉलम के माध्यम से चलाया गया था और प्रत्येक अंश लिपिड सामग्री के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर एक लिपिड डाई और विष (LtxA) सामग्री का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । (क)प्रत्येक अंश की औसत लिपिड सामग्री तीन परीक्षणों से कुल लिपिड सामग्री के प्रतिशत के रूप में सूचित की गई है । प्रत्येक डेटा बिंदु मानक विचलन ± मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। (ख)प्रत्येक अंश की एलेक्सा सामग्री, कुल एलेक्सा सामग्री के प्रतिशत के रूप में सूचित की गई है, जैसा कि एलिसा द्वारा मोनोक्लोनल एंटी-एलटीएक्सए एंटीबॉडी के साथ मापा जाता है । (ग)प्रत्येक अंश की एलटेक्सा सामग्री, कुल एलेक्सा सामग्री के प्रतिशत के रूप में सूचित की गई है, जैसा कि मोनोक्लोनल एंटी-एलटीएक्सए एंटीबॉडी के साथ एक इम्यूनोब्लॉट द्वारा मापा जाता है । (घ)प्रत्येक अंश की कुल प्रोटीन सामग्री, कुल प्रोटीन सामग्री के प्रतिशत के रूप में सूचित, के रूप में एक२८०द्वारा मापा । कुछ डेटा जॉन विले एंड संस लिमिटेड से अनुमति के साथ चांग एट अल26 से पुन: पेश किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां, हमने बैक्टीरियल ओएमवी उपआबादी के सरल, तेज और प्रजनन योग्य पृथक्करण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया है। हालांकि तकनीक अपेक्षाकृत सीधे आगे है, वहां कुछ कदम है कि बहुत ध्यान से प्रदर्शन किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि कुशल जुदाई कॉलम में होता है । सबसे पहले, यह आवश्यक है कि जेल को हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे कॉलम में लोड किया जाए। हमने देखा है कि कॉलम लोड करने से पहले कई घंटों तक कमरे के तापमान पर जेल छोड़ने से जेल को संतुलन बनाने की अनुमति देता है और कॉलम के भीतर बुलबुला गठन को कम करता है। जब जेल को कॉलम में पिपेट किया जाता है, तो अशांति को कम करने के लिए कॉलम के किनारे सावधानी से पाइप किया जाना चाहिए। लोडिंग के दौरान हर समय, कॉलम में अतिरिक्त बफर बनाए रखा जाना चाहिए ताकि बसे हुए जेल में विच्छेदन से बचा जा सके। यदि एक विघटन होना चाहिए, तो जेल को फिर से खर्च करने के लिए अधिक बफर और पिपेट को ऊपर और नीचे जोड़ें।
इसी तरह, नमूने के साथ कॉलम लोड करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। क्योंकि नमूना पतला हो जाएगा क्योंकि यह कॉलम के माध्यम से गुजरता है, लोड नमूना एसईसी द्वारा जुदाई से पहले पर्याप्त रूप से केंद्रित किया जाना चाहिए । ए actinomycetemcomitans OMVs के लिए, हमने पाया है कि एक 1-एमएल नमूना लगभग 100-200 nmol/L लिपिड युक्त आदर्श है । जेल परत को बाधित किए बिना स्तंभ के शीर्ष पर नमूना सावधानी से लोड किए जाने के बाद, कॉलम को तब तक चलाया जाना चाहिए जब तक कि नमूना पूरी तरह से जेल कॉलम में प्रवेश न कर ले। इस बिंदु पर, कॉलम को बंद कर दिया जाना चाहिए ताकि बफर की एक परत को जेल के शीर्ष पर सावधानी से जोड़ा जा सके। यह बफर की केवल एक छोटी मात्रा (~ 1 एमएल) लोड करने में सहायक है, यह सुनिश्चित करता है कि जेल परत बाधित न हो। एक बार जब नमूना जेल में आगे चला गया है, बफर बड़ी मात्रा में जोड़ा जा सकता है और जेल परत को बाधित करने के साथ चिंता एक मुद्दे से कम है । कॉलम को कई बार पुन: इस प्रकार पुन: इसया जा सकता है, जब तक कि इसे पूरी तरह से हाइड्रेटेड स्थिति में बनाए रखा जाता है और रनों के बीच अच्छी तरह से (चरण 4.6) साफ किया जाता है।
सभी OMV शुद्धिकरण प्रक्रियाएं एक ही प्रारंभिक चरणों का पालन करती हैं जिनमें बैक्टीरियल विकास, बैक्टीरियल कोशिकाओं को हटाना और ओएमवी आइसोलेशन27शामिल हैं। यद्यपि इस "क्रूड" तैयारी का उपयोग आमतौर पर ओएमवी अध्ययन28में किया गया है, यह तेजी से स्पष्ट होता जा रहा है कि बाद में शुद्धिकरण कदम सह-उपजी प्रोटीन और अन्य प्रदूषकों को हटाने के साथ-साथ ओएमवी उप-आबादी को अलग करने के लिए आवश्यक है। ओएमवी अध्ययनों में, यह शुद्धिकरण कदम आमतौर पर घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र का उपयोग करके पूरा किया जाता है। यूकेरियोटिक एक्सट्रासेलुलर वेसिकल फील्ड में, वेसिकल आबादी को अलग करने और संदूषकों को हटाने के लिए एसईसी का उपयोग महत्व में बढ़ रहा है, क्योंकि यह डीजीसी29की तुलना में सरल, तेज और कम खर्चीला है। इसके अलावा, एसईसी को डीजीसी29के विपरीत, स्वचालित करने के लिए संभव होने का लाभ है । इस प्रकार, जबकि डीजीसी बैक्टीरियल ओएमवी क्षेत्र में वेसिकल अलगाव का "स्वर्ण मानक" बना हुआ है, हम प्रस्ताव करते हैं कि एसईसी के कई फायदे इसे डीजीसी की तुलना में ओएमवी शुद्धिकरण की विधि, एक अत्यंत उपयोगी बनाते हैं। इस काम में, हमने दिखा दिया है कि सेफक्रिल एस-1000 का 1.5 x 50 सेमी कॉलम ओएमवी के दो उपआबादी को अलग करने में सक्षम है। हमने यह भी देखा है कि यह दृष्टिकोण ओएमवी समाधान से न्यूक्लिक एसिड और मुफ्त प्रोटीन को हटाने में सक्षम है । पिछली रिपोर्टों में एसईसी को ओएमवी तैयारियों से मुफ्त एलपीएस हटाने में सक्षम पाया गया है, साथ ही28।
अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि एसईसी बैक्टीरियल वेसिकल्स के शुद्धिकरण में बहुत वादा करता है। जबकि हमने एक विशिष्ट जीवाणु(ए ऐक्टिनोमायसिस्टेमकोमिटन)द्वारा उत्पादित ओएमवी की उप-जनसंख्या को अलग करने की तकनीक की क्षमता का प्रदर्शन किया है, हम आशा करते हैं कि तकनीक अन्य बैक्टीरियल वेसिकल नमूनों का विश्लेषण करने में अत्यंत मूल्यवान पाई जाएगी, क्योंकि यह अतिरिक्त उपयोग देखती है। विशेष रूप से, ओएमवी के जैव प्रौद्योगिकीय अनुप्रयोगों में वृद्धि के रूप में, लगातार और शुद्ध वेसिकल तैयारी की आवश्यकता भी बढ़ जाएगी; एसईसी इन अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक तरीका है।
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Disclosures
लेखकों को रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (1554417) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (DE027769) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
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