Summary
שלל חיידקים ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה ויש להם יישומים ביוטכנולוגיה מבטיחים. ההטרוגניות של שלטי של שלל מסבכת ניתוח ושימוש; לכן, יש צורך בשיטה פשוטה לשחזור כדי להפריד בין גדלים שונים של שלשלות. כאן, אנו מדגימים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להפריד שלפוחיות הטרוגניות המיוצרות על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
דופן התא של חיידקים גרם שלילי מורכב פנימי (ציטופלסמי) וממברנה חיצונית (OM), מופרד על ידי שכבה פפטידוגליקנית דקה. לאורך הצמיחה, הממברנה החיצונית יכולה bleb כדי ליצור שלל ממברנה החיצונית כדורית (OMVs). OMVs אלה מעורבים פונקציות תאיות רבות כולל משלוח מטען לתאים מארחים ותקשורת עם תאים חיידקיים. לאחרונה, הפוטנציאל הטיפולי של OMVs החל להיחקר, כולל השימוש בהם כחיסונים וכלי רכב להעברת תרופות. למרות OMVs נגזרים OM, זה זמן רב מוערך כי מטען השומנים והחלבון של OMV שונה, לעתים קרובות באופן משמעותי, מזה של OM. לאחרונה, ראיות לכך שחיידקים יכולים לשחרר סוגים רבים של OMVs התגלו, וקיימות ראיות לכך שגודל יכול להשפיע על מנגנון ספיגתם על ידי תאים מארחים. עם זאת, מחקרים בתחום זה מוגבלים על ידי קשיים בהפרדה יעילה של OMVs בגודל הטרוגניים. צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות (DGC) שימשה באופן מסורתי למטרה זו; עם זאת, טכניקה זו גוזלת זמן וקשה להרחבה. כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC), לעומת זאת, פחות מסורבלת ומעניקה את עצמה להרחבה העתידית הדרושה לשימוש טיפולי ב- OMVs. כאן, אנו מתארים גישה SEC המאפשרת הפרדה לשחזור של שלפוחיות בגודל הטרוגניים, באמצעות מקרה בדיקה, OMVs המיוצר על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans, אשר נע בקוטר של פחות מ 150 ננומטר עד יותר מ 350 ננומטר. אנו מדגימים הפרדה של OMVs "גדולים" (350 ננומטר) ו- OMVs "קטנים" (<150 ננומטר), שאומתו על ידי פיזור אור דינמי (DLS). אנו ממליצים על טכניקות מבוססות SEC על טכניקות מבוססות DGC להפרדה של שלפוחיות בגודל הטרוגני בשל קלות השימוש שלה, רבייה (כולל משתמש למשתמש), ואפשרות להרחבה.
Introduction
חיידקים גרם שלילי לשחרר שלל נגזר הממברנה החיצונית שלהם, מה שנקרא שלל הממברנה החיצונית (OMVs), לאורך הצמיחה. OMVs אלה ממלאים תפקידים חשובים בתקשורת בין תאים לתא, הן בין חיידקים לפונדקאי והן בין תאים חיידקיים, על ידי נשיאת מספר ביומולקולים חשובים, כולל DNA / RNA, חלבונים, שומנים ופפטידוגליקנים1,2. בפרט, התפקיד של OMVs בפתוגנזה חיידקית נחקר בהרחבה בשל העשרתם בגורמי ויראולנס מסוימים ורעלים3,4,5,6,7,8,9,10,11.
OMVs דווחו לנוע בין 20 ל 450 ננומטר, בהתאם לחיידקי האב ואת שלב הצמיחה, עם מספר סוגים של חיידקים משחררים OMVs בגודל הטרוגניים8,12,13,14, אשר גם שונים בהרכב החלבון שלהם ומנגנון של כניסת תא מארח12. H. pylori שוחרר OMVs בקוטר הנע בין 20 ל 450 ננומטר, עם OMVs קטן יותר המכיל הרכב חלבון הומוגני יותר מאשר OMVs גדול יותר. חשוב לציין, שתי האוכלוסיות של OMVs נצפו להיות מופנמים על ידי תאים מארחים באמצעות מנגנונים שונים12. בנוסף, הוכחנו כי Aggregatibacter actinomycetemcomitans משחרר אוכלוסייה של OMVs קטנים (<150 ננומטר) יחד עם אוכלוסייה של OMVs גדול (>350 ננומטר), עם OMVs המכיל כמות משמעותית של רעלן חלבון מופרש, לויקוטוקסין (LtxA)15. בעוד התפקיד של הטרוגניות OMV בתהליכים הסלולר הוא חשוב בבירור, קשיים טכניים בהפרדה וניתוח אוכלוסיות נפרדות של שלל הגבילו את המחקרים האלה.
בנוסף לחשיבותם בפתוגנזה חיידקית, הוצעו OMVs לשימוש במספר יישומים ביוטכנולוגיה, כולל כחיסונים וכלי רכב להעברת תרופות16,17,18,19,20. לשימושם התרגומי בגישות כאלה, נדרשת הכנה נקייה ומונודיספרסית של שלשלות. לכן, שיטות יעילות ויעילות של הפרדה נחוצות.
בדרך כלל, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות (DGC) משמשת להפרדת אוכלוסיות ארסיות בגודל הטרוגניים מפסולת הסלולר, כולל flagellae וחלבונים מופרשים21; השיטה דווחה גם כגישה להפריד בין אוכלוסין OMV בגודל הטרוגניים12,13,14. עם זאת, DGC גוזל זמן רב, לא יעיל ומשתנה מאוד משתמש למשתמש22 ולכן הוא, לא אידיאלי עבור קנה מידה למעלה. לעומת זאת, כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) מייצגת גישה מדרגית, יעילה ועקבית לטיהור OMVs21,23,24. גילינו כי ארוך (50 ס"מ), זרימת כבידה, טור SEC, מלא מדיום סינון ג'ל מספיק לטיהור יעיל והפרדה של אוכלוסין של OMVs. באופן ספציפי, השתמשנו בגישה זו כדי להפריד A. actinomycetemcomitans OMVs לתת אוכלוסין "גדול" ו "קטן", כמו גם כדי להסיר זיהום חלבון ו- DNA. הטיהור הושלם בפחות מ 4 שעות, והפרדה מלאה של תת אוכלוסין OMV והסרת פסולת הושלמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מאגרים
- כדי להכין את מאגר הכביסה ELISA, הוסף 3.94 גרם בסיס טריס, 8.77 גרם NaCl, ו 1 גרם אלבומין סרום בקר (BSA) ל 1 ליטר של מים deionized (DI). הוסף 500 μL פוליסורבט-20. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
- כדי להכין את מאגר החסימה, הוסף 3.94 גרם בסיס טריס, 8.77 גרם NaCl ו- 10 גרם BSA. הוסף 500 μL פוליסורבט-20 ל 1 ליטר של מים DI. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
- להכנת מאגר ה-ELUTION (PBS), הוסיפו 8.01 גרם NaCl, 2.7 גרם KCl, 1.42 גרם Na2HPO4ו-0.24 גרם KH2PO4 ל-1 ליטר DI מים. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl או NaOH.
הערה: פתרון פי 10 של מאגר זה יכול להתבצע ונדולל עם מי DI לפי הצורך.
2. הכנת דגימת OMV
- לגדל A. actinomycetemcomitans תאים לשלב מעריכי מאוחר (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 0.7). גלולה את התאים על ידי centrifuging פעמיים ב 10,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות. סנן את supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
- מרכז את סופרנטנט נטול החיידקים באמצעות מסנני ניתוק משקל מולקולריים 50 kDa. אולטרה-צנטריפוגה את הפתרון המרוכז ב 105,000 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
- resuspend הכדור PBS ו ultracentrifuge שוב (105,000 x גרם ב 4 °C (30 דקות).) resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS.
3. אריזת עמודת S-1000
- מערבבים את בקבוק המניות של מדיום סינון ג'ל עם מוט ערבוב זכוכית ויוצקים לתוך בקבוק זכוכית את הנפח הדרוש למילוי העמוד, בתוספת כ -50% עודף (כ -135 מ"ל). תן חרוזים אלה לשבת עד שהם התיישבו, ולאחר מכן decant את הנוזל העודף. יש להזרים את החרוזים במאגר אלוטיון, כך שהפתרון הסופי הוא כ-70% (לפי נפח) ג'ל, 30% חוצץ. Degas הפתרון תחת ואקום.
- הר את עמוד הזכוכית אנכית באמצעות מעמד טבעת ולמלא עם חוצץ elution כדי להרטיב את הקירות של העמוד. מסננים את המאגר עד שנותרו בעמודה רק כ-1 ס"מ של מאגר.
- מבלי ליצור בועות, בזהירות pipette חרוזים לתוך העמודה, מילוי העמודה למעלה. המשך לנקז מאגר עודף לאורך כל תהליך זה. הקפד לא לתת החרוזים להתיישב לחלוטין לפני הוספת חרוזים נוספים לראש העמודה. יש לארוז את העמודה לגובה של כ-2 ס"מ מתחת לתחתית מאגר העמודות.
4. טעינת המדגם ואיסוף שברים
- דגה חיץ elution תחת ואקום. לשטוף את העמודה עם שני כרכים עמודה (180 מ"ל) של מאגר elution.
- אפשר למאגר הנותר להיכנס באופן מלא לעמודה. לאחר החיץ הגיע לחלק העליון של שכבת הג'ל, בזהירות pipette מדגם 2 מ"ל המכיל OMVs (בריכוז שומנים של כ 100 - 200 נמול / L) על פני השטח של החרוזים, נזהר לא להפריע לאף אחד החרוזים בחלק העליון של העמוד. אפשר לדגימה להיכנס באופן מלא לג'ל, כלומר, כאשר אין נוזל נשאר מעל שכבת הג'ל.
- בזהירות ובאיטיות להוסיף חוצץ elution על גבי עמודת הג'ל. אל תפריע לשכבה העליונה של הג'ל, שכן זה יגרום דילול מדגם.
- מקם צינור יחיד של 50 מ"ל מתחת לעמודה ופתח את העמודה. לאסוף את 20 מ"ל הראשונים של האלנט. הוסף מאגר אלגנטי נוסף לראש העמודה, בזהירות, לפי הצורך כדי להבטיח שהעמודה לעולם לא תתייבש.
- מקם סדרה של צינורות 1.5 מ"ל מתחת לעמוד. התחל את העמודה ואסוף סדרה של דגימות 1-mL בכל צינור. כאשר הדגימות נאספות, המשך להוסיף מאגר אלוטציה לראש העמודה, לפי הצורך. חזור על הפעולה עד שנאספו 96 שברים. עצור את העמודה.
הערה: הדגימות צריכות להיות מאוחסנות ב -20 °C לאחסון לטווח ארוך או 4 °C לאחסון לטווח קצר עד ניתוח נוסף. - כדי לנקות את העמודה, הפעל אמצעי אחסון של עמודה אחת (90 מ"ל) של 0.1 M NaOH לאורך העמודה. הפעל שני אמצעי אחסון של עמודות (180 מ"ל) של מאגר אלוטיון דרך העמודה.
5. ניתוח מדגם
- כדי למדוד את ריכוז השומנים בכל שבר, pipette 50 μL של כל שבר לתוך באר אחת של צלחת 96-well. לכל באר, להוסיף 2.5 μL של צבע ליפופילי. דגירה במשך 15 s. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על קורא לוחות עם אורך גל עירור של 515 ננומטר ואורך גל פליטה של 640 ננומטר. כדי לחשב את השבר של כל השומנים בכל מדגם, לסכם את כל עוצמות הפליטה ולחלק כל עוצמה בודדת על ידי סך.
- כדי למדוד את הריכוז של חלבון מסוים, פיפטה 100 μL של כל שבר לתוך באר אחת של צלחת אימונו ELISA. דגירה ב 25 °C (5 °F) במשך 3 שעות.
- דק את הדגימות. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
- הוסף 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר ודגרה במשך 1 שעות ב 25 °C (70 °F). דקאנט.
- לוחות דגירה עם 100 μL חסימת חוצץ בתוספת נוגדן ראשוני (1:10,000 עבור נוגדן מטוהר; 1:10 עבור נוגדן לא מתאים) לילה ב 4 °C (4 °F). דקאנט.
- הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
- הוסף 100 μL של מאגר שטיפת ELISA בתוספת נוגדן משני (1:30,000) לכל באר. דגירה במשך 1 שעות ב 25 °C (5 °F).
- הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
- הוסף 100 μL של 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) פתרון שלב אחד ודגרה במשך 15-30 דקות או עד צבע כחול מתפתח. עצור את תגובת TMB עם 50 μL של פתרון העצירה.
- על קורא לוחות, לקרוא את הספיגה של כל באר אורך גל של 450 ננומטר.
- כדי למדוד את ריכוז החלבון הכולל, תיעדו את הספיגה באורך גל של 280 ננומטר (A280)של כל שבר, באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.
תרשים של הפרוטוקול מוצג באיור 1.
איור 1: שרטוט של הליך SEC. העמודה עמוסה עם סינון ג'ל מנוטרל בינוני בזהירות כדי למנוע בועות ואי רציפות, ולאחר מכן שטף עם שני כרכים עמודה של מאגר elution. לאחר מכן, המדגם מועבר בזהירות על החלק העליון של הג'ל, מבלי לשבש את אריזת הג'ל. העמודה נפתחת ומופעלת עד שהדגימה נכנסת לחלוטין לג'ל. בשלב זה, חוצץ ממוקם על החלק העליון של העמודה, ואת 20 מ"ל הראשון של eluate נאסף. לאחר מכן, נאספת סדרה של שברי 1 מ"ל. שברים אלה ממוקמים לאחר מכן בצלחת 96-well או 96-צלחת אימונו היטב לניתוח של תוכן שומנים וחלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג תוצאות מייצגות משיטת שירות זו. OMVs המיוצר על ידי A. actinomycetemcomitans זן JP2 טוהרו לראשונה מן התרבות supernatant באמצעות אולטרה צנטריפוגה15. מצאנו בעבר כי זן זה מייצר שתי אוכלוסיות של OMVs, אחד עם קטרים של כ 300 ננומטר ואחד עם קוטר של כ 100 ננומטר15. כדי להפריד אוכלוסיות OMV אלה, טיהרנו את המדגם באמצעות פרוטוקול SEC המתואר לעיל. כל שבר נותח עבור תוכן השומנים באמצעות צבע ליפופילי ותוכן רעלן (LtxA) באמצעות חיסון הקשור לאנזים (ELISA) או אימונובלוט. ריכוזי השומנים והרעלן מדווחים כאחוזים, כאשר "%השומנים" מציין איזה אחוז מתכולת השומנים הכוללת של המדגם נמצא בכל שבר ו-"%toxin" מציין איזה אחוז מתכולת הרעלן הכוללת של המדגם נמצא בכל שבר.
איור 2A מציג את תוצאות הצבע הליפופילי הממוצע עם סטיות תקן משלושה טיהורים נפרדים, שכל אחד מהם מבוצע על ידי משתמש אחר, ומדגים את יכולת הרבייה של טכניקה זו. שני פסגות שומנים נפרדות נצפו, המתאימות ל- OMVs "גדולים" (שבר מספר 13) ו- OMVs "קטנים" (שבר מספר 25). אישרנו את גודלם של ה-OMVs בפסגות אלה באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) ומצאנו את הקטרים הממוצעים של ה-OMVs בשברים 13 ו-25 להיות 296.6 ננומטר ו-142.6 ננומטר, בהתאמה, כפי שמוצג ב-Fig. 2א. לשם השוואה, הקוטר הממוצע של מדגם OMV לאחר ultracentrifugation אבל לפני טיהור SEC נמצא בעבר להיות 161.0 ננומטר15.
באיור 2B, כמות ה-LtxA בכל שבר, המתקבלת באמצעות ELISA עם נוגדן חד שבטי נגד LtxA25, מוצגת על גבי ריכוז השומנים מלוח A. טכניקה זו מדגימה כי הרעלן קשורה בעיקר עם תת-אכלוס אחד של OMVs. איור 2C מראה את כמות ה-LtxA בכל שבר, הנמדדת בטכניקת אימונובלט עם אותו נוגדן חד שבטי אנטי-LtxA25, מכוסה בריכוז השומנים מלוח A. בעוד שהמגמה הכללית דומה לזו שנצפתה באיור 2B, גישת החיסונים הרבה פחות רגישה מטרכניקת ELISA, וכתוצאה מכך פרופילים רועשים יותר. איור 2D מציג את אחוז ריכוז החלבון הכולל בכל שבר, הנמדד באמצעות A280, על פרופיל ריכוז השומנים. פאנל זה מדגים כי SEC הוא מסוגל להסיר כמויות משמעותיות של חלבונים חינם מן ההכנות OMV, כפי שמעידים ערכי A גבוהים280 בשברים הגדולים מ -60. (למעשה, רוב החלבון נמצא בשברים אלה, שאינם מכילים OMVs, המוכיחים כי כמות גדולה של חלבון מטהרת עם OMVs.) בנוסף, תוצאה זו מראה כי ריכוז החלבון הכולל אינו בהכרח בקורלציה עם ריכוז חלבונים ספציפיים. במקרה של A. actinomycetemcomtcomtians OMVs, LtxA מקשר בעיקר עם האוכלוסייה של OMVs גדולים יותר, בעוד יותר של חלבון הכולל מקשר עם OMVs קטן יותר.
יחד, תוצאות מייצגות אלה מדגימים מספר תכונות חשובות של פרוטוקול SEC לטיהור OMV. ראשית, הטכניקה היא מאוד לשחזור, אפילו בין משתמשים. שנית, השימוש בצבע ליפופילי כדי לזהות OMVs בכל שבר הוא שיטה פשוטה ואמינה. שלישית, כדי לזהות ריכוזי חלבון ספציפיים, ELISA הוא חזק יותר מאשר אימונובלוט. רביעית, SEC מסוגלת להסיר כמויות גדולות של זיהומים, כולל חלבונים וחומצות גרעין.
איור 2: תוצאות מייצגות. א. actinomycetemcomitans JP2 OMVs נוהלו דרך העמודה SEC וכל שבר נותח עבור תוכן שומנים באמצעות צבע ליפופילי ותוכן רעלן (LtxA) באמצעות נוגדן חד שבטי. (A)תכולת השומנים הממוצעת של כל שבר שדווחה כאחוז מתכולת השומנים הכוללת, משלושה ניסויים. כל נקודת נתונים מייצגת את סטיית התקן הממוצעת ±. (B)התוכן LtxA של כל שבר, דיווח כאחוז מכלל התוכן LtxA, כפי שנמדד על ידי ELISA עם נוגדן אנטי LtxA חד שבטי. (C)התוכן LtxA של כל שבר, דיווח כאחוז מכלל התוכן LtxA, כפי שנמדד על ידי אימונובלט עם נוגדן אנטי-LtxA חד שבטי. (D)תכולת החלבון הכוללת של כל שבר, שדווחה כאחוז מתכולת החלבון הכוללת, כפי שהיא נמדדת על ידיA 280. חלק מהנתונים משוחזרים מצ'אנג ואח '26 באישור ג'ון ויילי ובניו בע"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, סיפקנו פרוטוקול להפרדה פשוטה, מהירה וניתן לשחזור של תת-אוכלוסין חיידקי OMV. למרות שהטכניקה היא ישירה יחסית קדימה, ישנם כמה שלבים שיש לבצע בזהירות רבה כדי להבטיח שהפרדה יעילה תתרחש בעמודה. ראשית, חיוני כי הג'ל להיות טעון לתוך הטור בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות אוויר. ראינו כי השארת הג'ל בטמפרטורת החדר במשך מספר שעות לפני טעינת העמוד מאפשרת לג'ל להתפרק וממזערת היווצרות בועה בתוך העמוד. כאשר הג'ל הוא pipetted לתוך העמודה, זה צריך להיות בזהירות pipetted לאורך הצד של העמודה כדי למזער מערבולות. בכל עת במהלך הטעינה, חוצץ עודף צריך להישמר בעמודה כדי למנוע אי רציפות בג'ל התיישב. אם מתרחשת דיסציקציה, הוסף עוד חוצץ ופיפטה למעלה ולמטה כדי resuspend הג'ל.
באופן דומה, טעינת העמודה עם מדגם חשובה ביותר. מכיוון שהדגימה תהיה מדוללת כשהיא עוברת דרך העמודה, המדגם שנטען צריך להיות מרוכז מספיק לפני ההפרדה על-ידי SEC. עבור A. actinomycetemcomitans OMVs, מצאנו כי מדגם 1-מ"ל המכיל כ 100-200 nmol / L של שומנים הוא אידיאלי. לאחר הדגימה נטען בזהירות בחלק העליון של העמודה מבלי לשבש את שכבת הג'ל, העמודה צריכה להיות מופעלת רק עד המדגם נכנס באופן מלא לעמודת הג'ל. בשלב זה, יש לעצור את העמודה כך שניתן יהיה להוסיף בזהירות שכבת חוצץ לחלק העליון של הג'ל. מומלץ לטעון רק נפח קטן (~ 1 מ"ל) של חוצץ, מה שמבטיח ששכבת הג'ל לא תיפגע. לאחר הדגימה כבר לרוץ עוד יותר לתוך הג'ל, חוצץ ניתן להוסיף בנפחים גדולים יותר ואת החשש עם שיבוש שכבת הג'ל הוא פחות בעיה. ניתן לעשות שימוש חוזר בעמודה מספר פעמים, כל עוד היא נשמרת במצב של לחות מלאה ומנוקה היטב (שלב 4.6) בין ריצות.
כל הליכי טיהור OMV בצע את אותם צעדים ראשוניים הכוללים צמיחה חיידקית, הסרת תאים חיידקיים, ובידוד OMV27. למרות הכנה "גולמית" זו שימשה בדרך כלל במחקרי OMV28, זה הופך להיות יותר ויותר ברור כי צעד טיהור הבא יש צורך להסיר חלבונים מזרזים ומזהמים אחרים, כמו גם להפריד תת אוכלוסין OMV. במחקרי OMV, שלב טיהור זה הושלם בדרך כלל באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. בשדה ההשלכה החוץ-תאית האוקריוטית, השימוש ב- SEC להפריד אוכלוסיות ארסיות ולהסיר מזהמים גדל בחשיבותו, שכן הוא פשוט יותר, מהיר יותר ופחות יקר מ- DGC29. בנוסף, ל- SEC יש את היתרון של להיות אפשרי להפוך לאוטומטי, בניגוד ל- DGC29. לכן, בעוד DGC נשאר "תקן הזהב" של בידוד ארסיה בשדה OMV חיידקי, אנו מציעים כי היתרונות הרבים של SEC להפוך אותו שימושי מאוד, אם לא טוב יותר, שיטה של טיהור OMV מאשר DGC. בעבודה זו, הוכחנו כי עמודה 1.5 x 50 ס"מ של Sephacryl S-1000 מסוגל להפריד בין שני תת-אוכלוסין של OMVs. ראינו גם כי הגישה מסוגלת להסיר חומצות גרעין וחלבונים חופשיים מפתרון OMV. דיווחים קודמים מצאו SEC להיות מסוגל להסיר LPS חינם מן ההכנות OMV, כמו גם28.
לסיכום, אנו מציעים כי SEC מחזיקה בהבטחה רבה בטיהור שלשלשות חיידקיות. בעוד שהדגמנו את היכולת של הטכניקה להפריד בין אוכלוסיות משנה של OMVs המיוצרים על ידי חיידק מסוים (A. actinomycetemcomitans), אנו צופים כי הטכניקה תימצא בעלת ערך רב בניתוח דגימות ארסיות חיידקיות אחרות, שכן היא רואה שימוש נוסף. בפרט, ככל שהיישומים הביוטכנולוגיה של OMVs יגדלו, הצורך בהכנות ארסיות עקביות וטהורות יגדל גם הוא; SEC היא שיטה מבטיחה עבור יישומים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לדווח.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1554417) ומכוני הבריאות הלאומיים (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
