Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Størrelse Udelukkelse kromatografi til at analysere bakteriel ydre membran vesikel heterogenitet

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62429
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

Summary

Bakterielle vesikler spiller vigtige roller i patogenese og har lovende bioteknologiske anvendelser. Vesiklernes heterogenitet komplicerer analyse og anvendelse; derfor er det nødvendigt med en enkel, reproducerbar metode til adskillelse af forskellige størrelser af vesikler. Her demonstrerer vi brugen af størrelsesudelukkelseskromatografi til at adskille heterogene vesikler produceret af Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Abstract

Cellevæggen af Gram-negative bakterier består af en indre (cytoplasmisk) og ydre membran (OM), adskilt af et tyndt peptidoglycan lag. Gennem vækst kan den ydre membran bløde til at danne sfæriske ydre membran vesikler (OMVs). Disse OMV'er er involveret i adskillige cellulære funktioner, herunder fragtlevering til værtsceller og kommunikation med bakterieceller. For nylig er det terapeutiske potentiale i OMV'er begyndt at blive undersøgt, herunder deres anvendelse som vacciner og lægemiddelleveringskøretøjer. Selv om OMV'er stammer fra OM, har det længe været værdsat, at omv'ens lipid- og proteinlast ofte adskiller sig væsentligt fra OM'ens. For nylig er der blevet opdaget beviser for, at bakterier kan frigive flere typer OMV'er, og der findes beviser for, at størrelse kan påvirke mekanismen for deres optagelse af værtsceller. Undersøgelser på dette område er imidlertid begrænset af vanskeligheder med effektivt at adskille de heterogene omv'er. Tæthedsgradient centrifugering (DGC) har traditionelt været anvendt til dette formål; Denne teknik er dog tidskrævende og vanskelig at opskalere. Størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) er på den anden side mindre besværlig og egner sig til den nødvendige fremtidige opskalering til terapeutisk brug af OMV'er. Her beskriver vi en SEC-tilgang, der muliggør reproducerbar adskillelse af heterogene vesikler, der bruger som en prøvesag, OMV'er produceret af Aggregatibacter actinomycetemcomitans, der spænder i diameter fra mindre end 150 nm til større end 350 nm. Vi demonstrerer adskillelse af "store" (350 nm) OMV'er og "små" (<150 nm) OMV'er, verificeret af DLS (Dynamic Light Scattering). Vi anbefaler SEC-baserede teknikker over DGC-baserede teknikker til adskillelse af heterogene størrelse vesikler på grund af dens brugervenlighed, reproducerbarhed (herunder bruger-til-bruger), og mulighed for opskalering.

Introduction

Gram-negative bakterier frigiver vesikler afledt af deres ydre membran, såkaldte ydre membran vesikler (OMVs), gennem hele væksten. Disse OMV'er spiller vigtige roller i celle-til-celle kommunikation, både mellem bakterier og vært samt mellem bakterieceller, ved at bære en række vigtige biomolekyler, herunder DNA / RNA, proteiner, lipider og peptidoglycaner1,2. Især er OMV'ernes rolle i bakteriepatogenese blevet grundigt undersøgt på grund af deres berigelse i visse virulensfaktorer og toksiner3,4,5,6,7,8,9,10,11.

OMV'er er rapporteret til at variere i størrelse fra 20 til 450 nm, afhængigt af moderbakterierne og vækststadiet, med flere typer bakterier, der frigiver heterogen størrelse OMV'er8,12,13,14, som også adskiller sig i deres proteinsammensætning og mekanisme for værtscelleindgang12. H. pylori frigav OMV'er i diameter fra 20 til 450 nm, hvor de mindre OMV'er indeholder en mere homogen proteinsammensætning end de større OMV'er. Det er vigtigt, at de to populationer af OMV'er blev observeret at blive internaliseret af værtsceller via forskellige mekanismer12. Derudover har vi vist, at Aggregatibacter actinomycetemcomitans frigiver en population af små (<150 nm) OMV'er sammen med en population af store (>350 nm) OMV'er, med OMV'erne, der indeholder en betydelig mængde udskillet proteintoksin, leukotoxin (LtxA)15. Mens OMV-heterogenitetens rolle i cellulære processer er klart vigtig, har tekniske vanskeligheder med at adskille og analysere forskellige populationer af vesikler begrænset disse undersøgelser.

Ud over deres betydning for bakteriel patogenese er OMV'er blevet foreslået til brug i en række bioteknologiske applikationer, herunder som vacciner og lægemiddelleveringskøretøjer16,17,18,19,20. Til deres translationelle brug i sådanne tilgange kræves en ren og monodisperse forberedelse af vesikler. Det er således nødvendigt med effektive og effektive adskillelsesmetoder.

Mest almindeligt anvendes tæthedsgradient centrifugering (DGC) til at adskille vesikelpopulationer af heterogen størrelse fra celleaffald, herunder flagellae og udskillede proteiner21; metoden er også blevet rapporteret som en metode til at adskille heterogene omv-delpopulationer12,13,14. DGC er dog tidskrævende, ineffektiv og meget variabel bruger-til-bruger22 og er derfor ikke ideel til opskalering. I modsætning hertil repræsenterer sec (Size Exclusion Chromatography) en skalerbar, effektiv og konsekvent tilgang til rensning af OMV'er21,23,24. Vi har konstateret, at en lang (50 cm), tyngdekraft-flow, SEC kolonne, fyldt med gel filtrering medium er tilstrækkelig til effektivt at rense og adskille delpopulationer af OMV'er. Specifikt brugte vi denne tilgang til at adskille A. actinomycetemcomitans OMV'er i "store" og "små" delpopulationer samt til at fjerne protein- og DNA-forurening. Rensningen blev afsluttet på mindre end 4 timer, og fuldstændig adskillelse af OMV-delpopulationerne og fjernelse af affald blev udført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af buffere

  1. For at forberede ELISA-vaskebufferen tilsættes 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl og 1 g bovin serumalbumin (BSA) til 1 L deioniseret (DI) vand. Tilsættes 500 μL polysorbat-20. Juster pH-listen til 7,2 ved hjælp af HCl eller NaOH.
  2. Hvis du vil forberede blokeringsbufferen, skal du tilføje 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl og 10 g BSA. Der tilsættes 500 μL polysorbat-20 til 1 L DI vand. Juster pH-listen til 7,2 ved hjælp af HCl eller NaOH.
  3. For at forberede elution buffer (PBS), tilsæt 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4, og 0,24 g KH2PO4 til 1 L DI vand. Juster pH-listen til 7,4 ved hjælp af HCl eller NaOH.
    BEMÆRK: En 10x opløsning af denne buffer kan laves og fortyndes med DI-vand efter behov.

2. Forberedelse af OMV-prøve

  1. Grow A. actinomycetemcomitans celler til den sene eksponentielle fase (optisk tæthed ved 600 nm af 0,7). Cellerne centrifugerer to gange ved 10.000 x g ved 4 °C i 10 min. Supernatanten filtreres gennem et filter på 0,45 μm.
  2. Koncentrer den bakteriefrie supernatant ved hjælp af 50 kDa-molekylære vægtafskæringsfiltre. Den koncentrerede opløsning ved 105.000 x g ved 4 °C i 30 min.
  3. Pelletpen i PBS og ultracentrifuge opsuges igen (105.000 x g ved 4 °C i 30 min.) Genbrug pellet i 2 mL PBS.

3. Pakning af S-1000-kolonnen

  1. Bland lagerflaske gelfiltreringsmediet med en glasrørstang og hæld det volumen, der er nødvendigt for at fylde kolonnen, i en glasflaske plus ca. 50% overskydende (ca. 135 mL). Lad disse perler sidde, indtil de har slået sig ned, og derefter dekantere den overskydende væske. Genbrug perlerne i elution buffer, således at den endelige opløsning er ca 70% (efter volumen) gel, 30% buffer. Afgas opløsningen under vakuum.
  2. Monter glaskolonnen lodret ved hjælp af et ringstativ og fyld med elueringsbuffer for at vådte kolonnens vægge. Tøm bufferen, indtil der kun er ca. 1 cm buffer tilbage i kolonnen.
  3. Uden at skabe bobler, forsigtigt pipette perler ind i kolonnen, fylde kolonnen til toppen. Fortsæt med at dræne overskydende buffer under hele denne proces. Sørg for ikke at lade perlerne afregne helt, før du tilføjer yderligere perler til toppen af kolonnen. Kolonnen skal pakkes til en højde på ca. 2 cm under bunden af søjlebeholderen.

4. Lastning af prøven og opsamling af fraktioner

  1. Afgas elueringsbufferen under vakuum. Kolonnen vaskes med to kolonnevolumener (180 mL) af elueringsbufferen.
  2. Tillad, at den resterende buffer kommer helt ind i kolonnen. Når bufferen har nået toppen af gellaget, pipetteres forsigtigt en 2-mL prøve, der indeholder OMV'er (ved en lipidkoncentration på ca. 100 - 200 nmol/L) på overfladen af perlerne, idet man passer på ikke at forstyrre nogen af perlerne øverst i kolonnen. Lad prøven komme helt ind i gelen, det vil sige, når der ikke er væske tilbage over gellaget.
  3. Tilsæt forsigtigt og langsomt elueringsbuffer oven på gelkolonnen. Forstyr ikke gelens øverste lag, da dette vil medføre prøvefortynding.
  4. Placer et enkelt 50 mL rør under kolonnen og åbn kolonnen. Saml de første 20 mL af eluent. Tilsæt yderligere elueringsbuffer til toppen af kolonnen, omhyggeligt efter behov for at sikre, at kolonnen aldrig er tør.
  5. Placer en serie på 1,5 mL rør under kolonnen. Start kolonnen og indsamle en række 1-mL prøver i hvert rør. Efterhånden som prøverne indsamles, skal du fortsætte med at tilføje elueringsbuffer til toppen af kolonnen efter behov. Gentag indtil 96 fraktioner er blevet indsamlet. Stop kolonnen.
    BEMÆRK: Prøverne skal opbevares ved -20 °C til langtidsopbevaring eller 4 °C til kortvarig opbevaring indtil videre.
  6. Hvis du vil rense kolonnen, skal du køre et kolonnevolumen (90 mL) på 0,1 M NaOH gennem kolonnen. Kør to kolonnevolumener (180 mL) elueringsbuffer gennem kolonnen.

5. Analyse af stikprøver

  1. For at måle lipidkoncentrationen i hver fraktion pipette 50 μL af hver fraktion i en enkelt brønd af en 96-brønds plade. Til hver brønd tilsættes 2,5 μL lipofilt farvestof. Inkuber i 15 s. Fluorescensintensiteten måles på en pladelæser med en excitationsbølgelængde på 515 nm og en emissionsbølgelængde på 640 nm. For at beregne brøkdelen af alle lipider i hver prøve skal du summere alle emissionsintensiteterne og dividere hver enkelt intensitet med totalen.
  2. For at måle koncentrationen af et bestemt protein pipette 100 μL af hver fraktion til en enkelt brønd af en ELISA immuno-plade. Inkuber ved 25 °C i 3 timer.
    1. Dekanter prøverne. Der tilsættes 200 μL ELISA-vaskebuffer til hver brønd og dekant. Gentag fire gange for i alt fem vaske.
    2. Der tilsættes 200 μL blokeringsbuffer til hver brønd og inkuberes i 1 time ved 25 °C. Dekantering.
    3. Inkubatplader med 100 μL blokeringsbuffer plus primært antistof (1:10.000 for renset antistof; 1:10 for ikke-renset antistof) natten over ved 4 °C. Dekantering.
    4. Der tilsættes 200 μL ELISA-vaskebuffer til hver brønd og dekant. Gentag fire gange for i alt fem vaske.
    5. Der tilsættes 100 μL ELISA-vaskebuffer plus sekundært antistof (1:30.000) til hver brønd. Inkuberes i 1 time ved 25 °C.
    6. Der tilsættes 200 μL ELISA-vaskebuffer til hver brønd og dekant. Gentag fire gange for i alt fem vaske.
    7. Der tilsættes 100 μL af opløsningen 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) i et trin og inkuberes i 15-30 minutter, eller indtil der udvikles en blå farve. TMB-reaktionen standses med 50 μL af stopopløsningen.
    8. På en pladelæser aflæses absorbansen af hver brønd ved en bølgelængde på 450 nm.
  3. For at måle den samlede proteinkoncentration skal absorbansen registreres ved en bølgelængde på 280 nm (A280) af hver fraktion ved hjælp af et UV-vis-spektrofotometer.

Et skema over protokollen vises i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over SEC-proceduren. Kolonnen er fyldt med afgasset gelfiltreringsmedium omhyggeligt for at undgå bobler og diskontinuiteter og vaskes derefter med to kolonnemængder af elueringsbuffer. Derefter pipetters prøven forsigtigt på toppen af gelen uden at forstyrre gelpakningen. Kolonnen åbnes og køres, indtil prøven kommer helt ind i gelen. På dette tidspunkt placeres bufferen øverst i kolonnen, og de første 20 mL eluat indsamles. Dernæst indsamles en række 1-mL-fraktioner. Disse fraktioner er derefter placeret i en 96-brønd plade eller 96-godt immuno-plade til analyse af lipid og proteinindhold. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser repræsentative resultater af denne metode. OMV'er produceret af A. actinomycetemcomitans stamme JP2 blev først renset fra kulturen supernatant ved hjælp af ultracentrifugation15. Vi har tidligere konstateret, at denne stamme producerer to populationer af OMV'er, en med diametre på ca. 300 nm og en med diametre på ca. 100 nm15. For at adskille disse OMV-populationer rensede vi prøven ved hjælp af SEC-protokollen, der er beskrevet ovenfor. Hver fraktion blev analyseret for lipidindhold ved hjælp af lipofil farvestof og for toksin (LtxA) indhold ved hjælp af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) eller en immunoblot. Lipid- og toksinkoncentrationerne rapporteres som procenter, hvor "%lipid" angiver, hvor stor en procentdel af prøvens samlede lipidindhold der er i hver fraktion, og "%toksin" angiver, hvor stor en procentdel af prøvens samlede toksinindhold der er i hver fraktion.

Figur 2A viser de gennemsnitlige lipofile farvestofresultater med standardafvigelser fra tre separate rensninger, der hver især udføres af en anden bruger, hvilket viser reproducerbarheden af denne teknik. Der observeres to forskellige lipidtoppe, svarende til "store" OMV'er (brøktal 13) og "små" OMV'er (brøktal 25). Vi bekræftede størrelsen af OMV'erne i disse toppe ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) og fandt, at gennemsnitsdiametre for OMV'erne i fraktioner 13 og 25 var henholdsvis 296,6 nm og 142,6 nm, som vist i fig. 2A. Til sammenligning blev gennemsnitsdiameteren for OMV-prøven efter ultracentrifugering, men før SEC-rensning, tidligere fundet at være 161,0 nm15.

I figur 2Ber mængden af LtxA i hver fraktion, opnået ved hjælp af ELISA med et monoklonalt antistof mod LtxA25, vist overlejret på lipidkoncentrationen fra panel A. Denne teknik viser, at toksinet primært er forbundet med en delpopulation af OMV'er. Figur 2C viser mængden af LtxA i hver fraktion, målt ved hjælp af en immunoblot teknik med samme anti-LtxA monoklonale antistof25, overlejret på lipidkoncentrationen fra panel A. Mens den generelle tendens svarer til det, der er observeret i figur 2B, er immunoblotmetoden langt mindre følsom end ELISA-teknikken, hvilket resulterer i mere støjende profiler. Figur 2D viser procentdelen af den samlede proteinkoncentration i hver fraktion, målt ved hjælp af A280, overlejret på lipidkoncentrationsprofilen. Dette panel viser, at SEC er i stand til at fjerne betydelige mængder af frie proteiner fra OMV præparater, som det fremgår af de høje A280 værdier i fraktioner større end 60. (Faktisk findes det meste af proteinet i disse fraktioner, som ikke indeholder OMV'er, hvilket viser, at en stor mængde protein renses sammen med OMV'erne.) Derudover viser dette resultat, at den samlede proteinkoncentration ikke nødvendigvis korrelerer med koncentrationen af specifikke proteiner. I tilfælde af A. actinomycetemcomtians OMVs forbinder LtxA primært med befolkningen af større OMV'er, mens flere af de samlede proteinforbindelser med de mindre OMV'er.

Tilsammen viser disse repræsentative resultater en række vigtige elementer i SEC-protokollen for OMV-rensning. For det første er teknikken meget reproducerbar, selv mellem brugere. For det andet er brugen af et lipofilt farvestof til at detektere OMV'er i hver fraktion en enkel og pålidelig metode. For det tredje er ELISA mere robust end en immunoblot for at detektere specifikke proteinkoncentrationer. For det fjerde er SEC i stand til at fjerne store mængder urenheder, herunder proteiner og nukleinsyrer.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater. A. actinomycetemcomitans JP2 OMV'er blev kørt gennem SEC-kolonnen, og hver fraktion blev analyseret for lipidindhold ved hjælp af et lipofilt farvestof og toksinindhold (LtxA) ved hjælp af et monoklonalt antistof. (a)Det gennemsnitlige lipidindhold for hver fraktion indberettet som en procentdel af det samlede lipidindhold fra tre forsøg. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdi ± standardafvigelsen. (B) LtxA-indholdet for hver fraktion, rapporteret i procent af det samlede LtxA-indhold, målt ved ELISA med et monoklonalt anti-LtxA-antistof. (C) LtxA-indholdet for hver fraktion, rapporteret som en procentdel af det samlede LtxA-indhold, målt ved et immunoblot med et monoklonalt anti-LtxA-antistof. D) Det samlede proteinindhold i hver fraktion, der indberettes i procent af det samlede proteinindhold, målt ved A280. Nogle af dataene er gengivet fra Chang et al.26 med tilladelse fra John Wiley and Sons Ltd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her har vi givet en protokol for den enkle, hurtige og reproducerbare adskillelse af bakterielle OMV-delpopulationer. Selvom teknikken er relativt ligetil, er der nogle trin, der skal udføres ekstremt omhyggeligt for at sikre, at der opstår effektiv adskillelse i kolonnen. For det første er det vigtigt, at gelen indlæses forsigtigt og langsomt i kolonnen for at undgå luftbobler. Vi har observeret, at forlader gel ved stuetemperatur i flere timer før lastning kolonnen gør det muligt for gelen at ekvilibrere og minimerer boble dannelse i kolonnen. Når gelen er pipetteret ind i kolonnen, skal den forsigtigt pipettes langs siden af kolonnen for at minimere turbulens. På alle tidspunkter under pålæsningen bør overskydende buffer opretholdes i kolonnen for at undgå diskontinuiteter i den afregnede gel. Hvis der skulle opstå en disjunktion, tilsættes mere buffer og pipette op og ned for at genbruge gelen.

På samme måde er det af afgørende betydning at indlæse kolonnen med prøven. Da prøven fortyndes, når den passerer gennem kolonnen, skal den indlæste prøve koncentreres tilstrækkeligt, før SEC udskiller den. For A. actinomycetemcomitans OMVs har vi konstateret, at en 1-mL prøve, der indeholder ca. 100-200 nmol /L lipider, er ideel. Når prøven er lastet forsigtigt øverst i kolonnen uden at forstyrre gellaget, skal kolonnen køres, indtil prøven kommer helt ind i gelkolonnen. På dette tidspunkt skal kolonnen stoppes, så et lag buffer omhyggeligt kan tilføjes til toppen af gelen. Det er nyttigt kun at indlæse et lille volumen (~ 1 mL) buffer, hvilket sikrer, at gellaget ikke forstyrres. Når prøven er blevet kørt længere ind i gelen, kan buffer tilføjes i større mængder, og bekymringen for at forstyrre gellaget er mindre af et problem. Kolonnen kan genbruges flere gange, så længe den holdes i fuldt hydreret tilstand og rengøres godt (trin 4.6) mellem kørsler.

Alle OMV-rensningsprocedurer følger de samme indledende trin, der omfatter bakterievækst, fjernelse af bakterieceller og OMV-isolation27. Selv om dette "rå" præparat almindeligvis er blevet anvendt i OMV-undersøgelser28, bliver det mere og mere tydeligt, at et efterfølgende rensningstrin er nødvendigt for at fjerne co-udfældende proteiner og andre forurenende stoffer samt at adskille OMV-delpopulationer. I OMV-undersøgelser gennemføres dette rensningstrin ofte ved hjælp af tæthedsgradient centrifugering. I eukaryote ekstracellulære vesikel område, brugen af SEC til at adskille vesikel populationer og for at fjerne forurenende stoffer er stigende betydning, da det er enklere, hurtigere og billigere end DGC29. Derudover har SEC den fordel, at det er muligt at automatisere, i modsætning til DGC29. Således, mens DGC forbliver "guld standard" af vesikel isolation i bakteriel OMV feltet, foreslår vi, at de mange fordele ved SEC gør det til en yderst nyttig, hvis ikke bedre, metode til OMV rensning end DGC. I dette arbejde har vi vist, at en 1,5 x 50 cm kolonne af Sephacryl S-1000 er i stand til at adskille to delpopulationer af OMV'er. Vi har også observeret, at tilgangen er i stand til at fjerne nukleinsyrer og frie proteiner fra OMV-opløsningen. Tidligere rapporter har fundet SEC at være i stand til at fjerne gratis LPS fra OMV præparater, samt28.

Afslutningsvis foreslår vi, at SEC har meget lovende i rensningen af bakterielle vesikler. Mens vi har demonstreret teknikkens evne til at adskille delpopulationer af OMV'er produceret af en bestemt bakterie (A. actinomycetemcomitans), forventer vi, at teknikken vil vise sig at være yderst værdifuld i analysen af andre bakterielle vesikelprøver, da den ser yderligere brug. Især i takt med at de bioteknologiske anvendelser af OMV'er øges, vil behovet for konsekvente og rene vesikelpræparater også stige; SEC er en lovende metode til disse programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation (1554417) og National Institutes of Health (DE027769).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA Thermo Scientific 34028
Amicon 50 kDa filters Millipore Sigma UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9704-100
ELISA Immuno Plates Thermo Scientific 442404
FM 4-64 Thermo Scientific T13320 1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column BioRad 7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader Tecan
Potassium Chloride (KCl) Amresco (VWR) 0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) Amresco (VWR) 0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine GE Healthcare 17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Chemical S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Amresco (VWR) 0404-500G
Tris Base VWR 0497-1KG
Tween(R) 20 Acros Organics 23336-2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
  3. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  4. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
  5. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
  6. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  7. Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
  8. Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
  9. Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
  10. Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
  11. Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
  12. Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
  13. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  14. Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
  15. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
  16. Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
  17. Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
  18. Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
  19. Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
  20. Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
  21. Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  22. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  23. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  24. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  25. Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
  26. Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
  27. Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
  28. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  29. Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).

Tags

Bioengineering udgave 169
Størrelse Udelukkelse kromatografi til at analysere bakteriel ydre membran vesikel heterogenitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, S. M., Nice, J. B., Chang,… More

Collins, S. M., Nice, J. B., Chang, E. H., Brown, A. C. Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity. J. Vis. Exp. (169), e62429, doi:10.3791/62429 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter