Summary
Les vésicules bactériennes jouent un rôle important dans la pathogenèse et ont des applications biotechnologiques prometteuses. L’hétérogénéité des vésicules complique l’analyse et l’utilisation; par conséquent, une méthode simple et reproductible pour séparer les différentes tailles de vésicules est nécessaire. Ici, nous démontrons l’utilisation de la chromatographie d’exclusion de taille pour séparer les vésicules hétérogènes produites par Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
La paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif est constituée d’une membrane interne (cytoplasmique) et externe (OM), séparées par une fine couche de peptidoglycane. Tout au long de la croissance, la membrane externe peut saigner pour former des vésicules sphériques de la membrane externe (OMV). Ces OMV sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la livraison de fret aux cellules hôtes et la communication avec les cellules bactériennes. Récemment, le potentiel thérapeutique des OMV a commencé à être exploré, y compris leur utilisation comme vaccins et véhicules d’administration de médicaments. Bien que les OMV soient dérivés de l’OM, on apprécie depuis longtemps que la cargaison de lipides et de protéines de l’OMV diffère, souvent de manière significative, de celle de l’OM. Plus récemment, des preuves que les bactéries peuvent libérer plusieurs types d’OMV ont été découvertes, et il existe des preuves que la taille peut avoir un impact sur le mécanisme de leur absorption par les cellules hôtes. Cependant, les études dans ce domaine sont limitées par les difficultés à séparer efficacement les OMV de taille hétérogène. La centrifugation par gradient de densité (DGC) a traditionnellement été utilisée à cette fin; cependant, cette technique prend beaucoup de temps et est difficile à mettre à l’échelle. La chromatographie d’exclusion de taille (SEC), en revanche, est moins lourde et se prête à la mise à l’échelle future nécessaire pour l’utilisation thérapeutique des OMV. Ici, nous décrivons une approche SEC qui permet une séparation reproductible de vésicules de taille hétérogène, en utilisant comme cas de test, les OMV produits par Aggregatibacter actinomycetemcomitans, dont le diamètre varie de moins de 150 nm à plus de 350 nm. Nous démontrons la séparation des OMV « grands » (350 nm) et des OMV « petits » (<150 nm), vérifiée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Nous recommandons les techniques basées sur la SEC plutôt que les techniques basées sur la DGC pour la séparation des vésicules de taille hétérogène en raison de sa facilité d’utilisation, de sa reproductibilité (y compris d’utilisateur à utilisateur) et de sa possibilité de mise à l’échelle.
Introduction
Les bactéries à Gram négatif libèrent des vésicules dérivées de leur membrane externe, appelées vésicules de la membrane externe (OMV), tout au long de la croissance. Ces OMV jouent un rôle important dans la communication de cellule à cellule, à la fois entre les bactéries et l’hôte ainsi qu’entre les cellules bactériennes, en transportant un certain nombre de biomolécules importantes, y compris l’ADN / ARN, les protéines, les lipides et les peptidoglycanes1,2. En particulier, le rôle des OMV dans la pathogenèse bactérienne a été largement étudié en raison de leur enrichissement en certains facteurs de virulence et toxines3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Il a été rapporté que la taille des OMV varie de 20 à 450 nm, selon les bactéries mères et le stade de croissance, plusieurs types de bactéries libérant des OMV de taille hétérogène8, 12,13,14, qui diffèrent également par leur composition protéique et leur mécanisme d’entrée dans la cellule hôte12. H. pylori a libéré des OMV d’un diamètre allant de 20 à 450 nm, les OMV plus petits contenant une composition protéique plus homogène que les OMV plus grands. Fait important, les deux populations d’OMV ont été observées comme faisant l’objet d’une internalisation par les cellules hôtes via différents mécanismes12. En outre, nous avons démontré qu’Aggregatibacter actinomycetemcomitans libère une population de petits OMV (<150 nm) ainsi qu’une population de grands OMV (>350 nm), les OMV contenant une quantité importante d’une toxine protéique sécrétée, la leucotoxine (LtxA)15. Bien que le rôle de l’hétérogénéité OMV dans les processus cellulaires soit clairement important, les difficultés techniques dans la séparation et l’analyse de populations distinctes de vésicules ont limité ces études.
En plus de leur importance dans la pathogenèse bactérienne, les OMV ont été proposés pour une utilisation dans un certain nombre d’applications biotechnologiques, y compris comme vaccins et véhicules d’administration de médicaments16,17,18,19,20. Pour leur utilisation translationnelle dans de telles approches, une préparation propre et monodispersée de vésicules est nécessaire. Ainsi, des méthodes de séparation efficaces et efficientes sont nécessaires.
Le plus souvent, la centrifugation par gradient de densité (DGC) est utilisée pour séparer les populations de vésicules de taille hétérogène des débris cellulaires, y compris les flagelles et les protéines sécrétées21; la méthode a également été rapportée comme une approche pour séparer les sous-populations OMV de taille hétérogène12,13,14. Cependant, DGC prend du temps, est inefficace et très variable d’utilisateur à utilisateur22 et n’est donc pas idéal pour la mise à l’échelle. En revanche, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) représente une approche évolutive, efficace et cohérente pour purifier les OMV21,23,24. Nous avons constaté qu’une longue colonne SEC à flux gravitaire de 50 cm, remplie de milieu de filtration sur gel, est suffisante pour purifier et séparer efficacement les sous-populations d’OMV. Plus précisément, nous avons utilisé cette approche pour séparer les OMV d’A. actinomycetemcomitans en « grandes » et « petites » sous-populations, ainsi que pour éliminer la contamination des protéines et de l’ADN. La purification a été achevée en moins de 4 h, et la séparation complète des sous-populations OMV et l’enlèvement des débris ont été réalisés.
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Protocol
1. Préparation des tampons
- Pour préparer le tampon de lavage ELISA, ajouter 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 L d’eau désionisée (DI). Ajouter 500 μL de polysorbate-20. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant HCl ou NaOH.
- Pour préparer le tampon bloquant, ajoutez 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 10 g de BSA. Ajouter 500 μL de polysorbate-20 à 1 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7,2 en utilisant HCl ou NaOH.
- Pour préparer le tampon d’élution (PBS), ajouter 8,01 g de NaCl, 2,7 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO4et 0,24 g de KH2PO4 à 1 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7,4 en utilisant HCl ou NaOH.
REMARQUE: Une solution 10x de ce tampon peut être faite et diluée avec de l’eau DI au besoin.
2. Préparation de l’échantillon OMV
- Cultiver les cellules d’A. actinomycetemcomitans jusqu’à la phase exponentielle tardive (densité optique à 600 nm de 0,7). Abreuler les cellules en les centrifugant deux fois à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm.
- Concentrez le surnageant sans bactéries à l’aide de filtres de coupure de poids moléculaire de 50 kDa. Ultracentrifugez la solution concentrée à 105 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
- Remettre la pastille en PBS et en ultracentrifugeuse (105 000 x g à 4 °C pendant 30 min.) Resuspendez la pastille dans 2 mL de PBS.
3. Emballage de la colonne S-1000
- Mélanger le flacon type de produit de filtration de gel avec une tige d’agitation en verre et verser dans une bouteille en verre le volume nécessaire pour remplir la colonne, plus environ 50% d’excès (environ 135 mL). Laissez ces perles reposer jusqu’à ce qu’elles se soient déposées, puis décantez l’excès de liquide. Resuspendez les billes dans un tampon d’élution, de sorte que la solution finale soit d’environ 70% (en volume) de gel, 30% de tampon. Dégazez la solution sous vide.
- Montez la colonne de verre verticalement à l’aide d’un support annulaire et remplissez-la de tampon d’élution pour mouiller les parois de la colonne. Égouttez le tampon jusqu’à ce qu’il ne reste qu’environ 1 cm de tampon dans la colonne.
- Sans créer de bulles, pipettez soigneusement les perles dans la colonne, en remplissant la colonne vers le haut. Continuez à drainer l’excès de tampon tout au long de ce processus. Assurez-vous de ne pas laisser les perles s’installer complètement avant d’ajouter des perles supplémentaires en haut de la colonne. La colonne doit être emballée à une hauteur d’environ 2 cm au-dessous du fond du réservoir de la colonne.
4. Chargement de l’échantillon et prélèvement des fractions
- Dégazez le tampon d’élution sous vide. Lavez la colonne avec deux volumes de colonne (180 mL) de tampon d’élution.
- Autorisez la mémoire tampon restante à entrer complètement dans la colonne. Une fois que le tampon a atteint le sommet de la couche de gel, pipeter soigneusement un échantillon de 2 mL contenant des OMV (à une concentration lipidique d’environ 100 - 200 nmol / L) sur la surface des perles, en prenant soin de ne pas perturber les perles en haut de la colonne. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans le gel, c’est-à-dire lorsqu’aucun liquide ne reste au-dessus de la couche de gel.
- Ajoutez soigneusement et lentement un tampon d’élution sur le dessus de la colonne de gel. Ne pas déranger la couche supérieure du gel, car cela entraînerait une dilution de l’échantillon.
- Placez un seul tube de 50 mL sous la colonne et ouvrez la colonne. Recueillir les 20 premiers mL de l’éluant. Ajoutez un tampon d’élution supplémentaire en haut de la colonne, soigneusement, au besoin, pour vous assurer que la colonne n’est jamais sèche.
- Placez une série de tubes de 1,5 mL sous la colonne. Démarrez la colonne et prélencez une série d’échantillons de 1 mL dans chaque tube. Au fur et à mesure que les échantillons sont collectés, continuez d’ajouter un tampon d’élution en haut de la colonne, au besoin. Répétez l’opération jusqu’à ce que 96 fractions aient été collectées. Arrêtez la colonne.
REMARQUE: Les échantillons doivent être conservés à -20 °C pour un stockage à long terme ou à 4 °C pour un stockage à court terme jusqu’à une analyse plus approfondie. - Pour nettoyer la colonne, exécutez un volume de colonne (90 mL) de 0,1 M NaOH à travers la colonne. Exécutez deux volumes de colonnes (180 mL) de tampon d’élution à travers la colonne.
5. Analyse de l’échantillon
- Pour mesurer la concentration de lipides dans chaque fraction, pipeter 50 μL de chaque fraction dans un seul puits d’une plaque de 96 puits. À chaque puits, ajoutez 2,5 μL de colorant lipophile. Incuber pendant 15 s. Mesurer l’intensité de fluorescence sur un lecteur de plaques avec une longueur d’onde d’excitation de 515 nm et une longueur d’onde d’émission de 640 nm. Pour calculer la fraction de tous les lipides dans chaque échantillon, additionnez toutes les intensités d’émission et divisez chaque intensité individuelle par le total.
- Pour mesurer la concentration d’une protéine particulière, pipeter 100 μL de chaque fraction dans un seul puits d’une plaque immuno-ELISA. Incuber à 25 °C pendant 3 h.
- Décantez les échantillons. Ajouter 200 μL de tampon de lavage ELISA à chaque puits et décant. Répétez quatre fois pour un total de cinq lavages.
- Ajouter 200 μL de tampon bloquant à chaque puits et incuber pendant 1 h à 25 °C. Décanter.
- Incuber des plaques avec un tampon bloquant de 100 μL plus un anticorps primaire (1:10 000 pour les anticorps purifiés; 1:10 pour les anticorps non purifiés) pendant la nuit à 4 °C. Décanter.
- Ajouter 200 μL de tampon de lavage ELISA à chaque puits et décant. Répétez quatre fois pour un total de cinq lavages.
- Ajouter 100 μL de tampon de lavage ELISA plus un anticorps secondaire (1:30 000) à chaque puits. Incuber pendant 1 h à 25 °C.
- Ajouter 200 μL de tampon de lavage ELISA à chaque puits et décant. Répétez quatre fois pour un total de cinq lavages.
- Ajouter 100 μL de la solution en une étape de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et incuber pendant 15-30 min ou jusqu’à ce qu’une couleur bleue se développe. Arrêtez la réaction TMB avec 50 μL de la solution d’arrêt.
- Sur un lecteur de plaques, lisez l’absorbance de chaque puits à une longueur d’onde de 450 nm.
- Pour mesurer la concentration totale en protéines, enregistrez l’absorbance à une longueur d’onde de 280 nm (A280)de chaque fraction, à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis.
Un schéma du protocole est illustré à la figure 1.
Figure 1: Schéma de la procédure SEC. La colonne est soigneusement emballée avec un milieu de filtration en gel dégazé pour éviter les bulles et les discontinuités, puis lavée avec deux volumes de colonne de tampon d’élution. Ensuite, l’échantillon est soigneusement pipeté sur le dessus du gel, sans perturber l’emballage du gel. La colonne est ouverte et exécutée jusqu’à ce que l’échantillon pénètre complètement dans le gel. À ce stade, un tampon est placé en haut de la colonne et les 20 premiers mL d’éluat sont collectés. Ensuite, une série de fractions de 1 mL est collectée. Ces fractions sont ensuite placées dans une plaque de 96 puits ou une plaque immuno de 96 puits pour l’analyse de la teneur en lipides et en protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
La figure 2 montre les résultats représentatifs de cette méthode. Les OMV produits par la souche JP2 d’A. actinomycetemcomitans ont d’abord été purifiés à partir du surnageant de culture par ultracentrifugation15. Nous avons précédemment constaté que cette souche produit deux populations d’OMV, l’une avec des diamètres d’environ 300 nm et l’autre avec des diamètres d’environ 100 nm15. Pour séparer ces populations OMV, nous avons purifié l’échantillon en utilisant le protocole SEC décrit ci-dessus. Chaque fraction a été analysée pour la teneur en lipides à l’aide du colorant lipophile et pour la teneur en toxines (LtxA) à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou d’un immunoblot. Les concentrations de lipides et de toxines sont indiquées sous forme de pourcentages, où « % lipide » indique le pourcentage de la teneur totale en lipides de l’échantillon dans chaque fraction et « % toxine » indique le pourcentage de la teneur totale en toxines de l’échantillon dans chaque fraction.
La figure 2A montre les résultats moyens des colorants lipophiles avec des écarts-types par rapport à trois purifications distinctes, chacune effectuée par un utilisateur différent, démontrant la reproductibilité de cette technique. Deux pics lipidiques distincts sont observés, correspondant aux « grands » OMV (numéro de fraction 13) et aux « petits » OMV (numéro de fraction 25). Nous avons confirmé la taille des OMV dans ces pics en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et avons constaté que les diamètres moyens des OMV en fractions 13 et 25 sont de 296,6 nm et 142,6 nm, respectivement, comme le montre la Fig. 2A. En comparaison, le diamètre moyen de l’échantillon OMV après ultracentrifugation mais avant purification SEC s’est précédemment avéré être de 161,0 nm15.
Dans la figure 2B,la quantité de LtxA dans chaque fraction, obtenue à l’aide d’ELISA avec un anticorps monoclonal contre LtxA25,est montrée superposée sur la concentration lipidique du panneau A. Cette technique démontre que la toxine est principalement associée à une sous-population d’OMV. La figure 2C montre la quantité de LtxA dans chaque fraction, mesurée à l’aide d’une technique d’immunoblot avec le même anticorps monoclonal anti-LtxA25, superposé à la concentration lipidique du panel A. Bien que la tendance générale soit similaire à celle observée à la figure 2B,l’approche immunoblot est beaucoup moins sensible que la technique ELISA, ce qui donne des profils plus bruyants. La figure 2D montre le pourcentage de la concentration totale de protéines dans chaque fraction, mesurée à l’aide de l’A280, superposée au profil de concentration lipidique. Ce panel démontre que la SEC est capable d’éliminer des quantités importantes de protéines libres des préparations OMV, comme en témoignent les valeurs élevées de A280 en fractions supérieures à 60. (En fait, la plupart des protéines se trouvent dans ces fractions, qui ne contiennent pas d’OMV, ce qui démontre qu’une grande quantité de protéines co-purifie avec les OMV.) De plus, ce résultat montre que la concentration totale en protéines n’est pas nécessairement corrélée à la concentration de protéines spécifiques. Dans le cas des OMV d’A. actinomycetemcomtians, LtxA s’associe principalement à la population d’OMV plus importants, tandis qu’une plus grande partie de la protéine totale s’associe aux OMV plus petits.
Ensemble, ces résultats représentatifs démontrent un certain nombre de caractéristiques importantes du protocole SEC pour la purification OMV. Tout d’abord, la technique est très reproductible, même entre utilisateurs. Deuxièmement, l’utilisation d’un colorant lipophile pour détecter les OMV dans chaque fraction est une méthode simple et fiable. Troisièmement, pour détecter des concentrations protéiques spécifiques, ELISA est plus robuste qu’un immunoblot. Quatrièmement, sec est capable d’éliminer de grandes quantités d’impuretés, y compris les protéines et les acides nucléiques.
Figure 2: Résultats représentatifs. A. Actinomycetemcomitans JP2 OMV ont été passés à travers la colonne SEC et chaque fraction a été analysée pour la teneur en lipides à l’aide d’un colorant lipophile et d’une teneur en toxine (LtxA) à l’aide d’un anticorps monoclonal. (A) La teneur moyenne en lipides de chaque fraction rapportée en pourcentage de la teneur totale en lipides, à partir de trois essais. Chaque point de données représente la moyenne ± écart-type. (B) La teneur en LtxA de chaque fraction, rapportée en pourcentage de la teneur totale en LtxA, mesurée par ELISA avec un anticorps monoclonal anti-LtxA. (C) La teneur en LtxA de chaque fraction, rapportée en pourcentage de la teneur totale en LtxA, mesurée par un immunoblot avec un anticorps monoclonal anti-LtxA. (D) La teneur totale en protéines de chaque fraction, déclarée en pourcentage de la teneur totale en protéines, mesurée par A280. Certaines des données sont reproduites à partir de Chang et al.26 avec la permission de John Wiley and Sons Ltd. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons fourni un protocole pour la séparation simple, rapide et reproductible des sous-populations bactériennes OMV. Bien que la technique soit relativement simple, certaines étapes doivent être effectuées avec beaucoup de soin pour s’assurer qu’une séparation efficace se produit dans la colonne. Tout d’abord, il est essentiel que le gel soit chargé dans la colonne avec soin et lentement pour éviter les bulles d’air. Nous avons observé que laisser le gel à température ambiante pendant plusieurs heures avant de charger la colonne permet au gel de s’équilibrer et minimise la formation de bulles dans la colonne. Lorsque le gel est pipeté dans la colonne, il doit être soigneusement pipeté le long du côté de la colonne pour minimiser les turbulences. À tout moment pendant le chargement, l’excès de tampon doit être maintenu dans la colonne pour éviter les discontinuités dans le gel décanté. Si une disjonction devait se produire, ajoutez plus de tampon et de pipette de haut en bas pour ressuspendre le gel.
De même, le chargement de la colonne avec l’échantillon est d’une importance cruciale. Étant donné que l’échantillon se dilue lorsqu’il traverse la colonne, l’échantillon chargé doit être suffisamment concentré avant la séparation par SEC. Pour les OMV d’A. actinomycetemcomitans, nous avons constaté qu’un échantillon de 1 mL contenant environ 100 à 200 nmol/L de lipides est idéal. Une fois que l’échantillon est chargé soigneusement en haut de la colonne sans perturber la couche de gel, la colonne doit être exécutée jusqu’à ce que l’échantillon pénètre complètement dans la colonne de gel. À ce stade, la colonne doit être arrêtée afin qu’une couche de tampon puisse être soigneusement ajoutée au sommet du gel. Il est utile de ne charger qu’un petit volume (~ 1 mL) de tampon, en veillant à ce que la couche de gel ne soit pas perturbée. Une fois que l’échantillon a été exécuté plus loin dans le gel, le tampon peut être ajouté en plus grands volumes et le souci de perturber la couche de gel est moins un problème. La colonne peut être réutilisée plusieurs fois, à condition qu’elle soit maintenue dans un état complètement hydraté et bien nettoyée (étape 4.6) entre les exécutions.
Toutes les procédures de purification OMV suivent les mêmes étapes initiales qui comprennent la croissance bactérienne, l’élimination des cellules bactériennes et l’isolement OMV27. Bien que cette préparation « brute » ait été couramment utilisée dans les études OMV28,il devient de plus en plus évident qu’une étape de purification ultérieure est nécessaire pour éliminer les protéines co-précipitantes et autres contaminants, ainsi que pour séparer les sous-populations OMV. Dans les études OMV, cette étape de purification est généralement complétée par centrifugation par gradient de densité. Dans le domaine des vésicules extracellulaires eucaryotes, l’utilisation de sec pour séparer les populations de vésicules et éliminer les contaminants gagne en importance, car elle est plus simple, plus rapide et moins coûteuse que DGC29. De plus, SEC a l’avantage d’être possible d’automatiser, contrairement à DGC29. Ainsi, bien que la DGC reste « l’étalon-or » de l’isolement des vésicules dans le domaine bactérien de l’OMV, nous proposons que les nombreux avantages de la SEC en font une méthode de purification de l’OMV extrêmement utile, sinon meilleure, que la DGC. Dans ce travail, nous avons démontré qu’une colonne de 1,5 x 50 cm de Séphacryl S-1000 est capable de séparer deux sous-populations d’OMV. Nous avons également observé que l’approche est capable d’éliminer les acides nucléiques et les protéines libres de la solution OMV. Des rapports précédents ont montré que la SEC était en mesure de supprimer les LPS libres des préparations OMV, ainsi que28.
En conclusion, nous proposons que la SEC soit très prometteuse dans la purification des vésicules bactériennes. Bien que nous ayons démontré la capacité de la technique à séparer les sous-populations d’OMV produites par une bactérie spécifique(A. actinomycetemcomitans),nous prévoyons que la technique sera extrêmement utile pour analyser d’autres échantillons de vésicules bactériennes, car elle voit une utilisation supplémentaire. En particulier, à mesure que les applications biotechnologiques des OMV augmentent, le besoin de préparations de vésicules cohérentes et pures augmentera également; SEC est une méthode prometteuse pour ces applications.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la National Science Foundation (1554417) et les National Institutes of Health (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
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