Summary
As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
A parede celular de bactérias Gram-negativas consiste em uma membrana interna (citoplasmática) e externa (OM), separada por uma fina camada peptidoglycan. Ao longo do crescimento, a membrana externa pode bleb para formar vesículas de membrana externa esférica (OMVs). Esses OMVs estão envolvidos em inúmeras funções celulares, incluindo entrega de carga para células hospedeiras e comunicação com células bacterianas. Recentemente, o potencial terapêutico dos OMVs começou a ser explorado, incluindo seu uso como vacinas e veículos de entrega de medicamentos. Embora os OMVs sejam derivados do OM, há muito se aprecia que a carga lipídica e proteica do OMV difere, muitas vezes significativamente, da do OM. Mais recentemente, evidências de que as bactérias podem liberar vários tipos de OMVs foram descobertas, e existem evidências de que o tamanho pode impactar o mecanismo de sua absorção por células hospedeiras. No entanto, os estudos nessa área são limitados por dificuldades em separar eficientemente os OMVs de tamanho heterogêneo. A centrifugação de gradiente de densidade (DGC) tem sido tradicionalmente utilizada para este fim; no entanto, essa técnica é demorada e difícil de escalar. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), por outro lado, é menos complicada e se presta à escala futura necessária para o uso terapêutico de OMVs. Aqui, descrevemos uma abordagem SEC que permite a separação reprodutível de vesículas de tamanho heterogêneo, usando como um caso de teste, OMVs produzidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que variam em diâmetro de menos de 150 nm a mais de 350 nm. Demonstramos separação de OMVs "grandes" (350 nm) e OMVs "pequenos" (<150 nm), verificados por dispersão dinâmica de luz (DLS). Recomendamos técnicas baseadas em SEC sobre técnicas baseadas em DGC para separação de vesículas heterogêneas devido à sua facilidade de uso, reprodutibilidade (incluindo usuário-para-usuário) e possibilidade de dimensionamento.
Introduction
Bactérias gram-negativas liberam vesículas derivadas de sua membrana externa, as chamadas vesículas de membrana externa (OMVs), durante todo o crescimento. Esses OMVs desempenham papéis importantes na comunicação célula-celular, tanto entre bactérias quanto hospedeiras, bem como entre células bacterianas, carregando uma série de biomoléculas importantes, incluindo DNA/RNA, proteínas, lipídios e peptidoglycans1,2. Em particular, o papel dos OMVs na patogênese bacteriana tem sido extensivamente estudado devido ao seu enriquecimento em certos fatores de virulência e toxinas3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Os OMVs têm sido relatados de tamanho de 20 a 450 nm, dependendo das bactérias parentais e do estágio de crescimento, com vários tipos de bactérias liberando OMVs heterogêneas de tamanho heterogêneo8,12,13,14, que também diferem em sua composição proteica e mecanismo de entrada de células hospedeiras12. H. pylori liberou OMVs variando em diâmetro de 20 a 450 nm, com os OMVs menores contendo uma composição proteica mais homogênea do que os OMVs maiores. É importante ressaltar que as duas populações de OMVs foram observadas como internalizadas pelas células hospedeiras através de diferentes mecanismos12. Além disso, demonstramos que a Aggregatibacter actinomycetemcomitans libera uma população de pequenos OMVs (<150 nm) juntamente com uma população de Grandes (>350 nm) OMVs, com os OMVs contendo uma quantidade significativa de uma toxina proteica secretada, leukotoxina (LtxA)15. Embora o papel da heterogeneidade do OMV nos processos celulares seja claramente importante, as dificuldades técnicas na separação e análise de populações distintas de vesículas limitaram esses estudos.
Além de sua importância na patogênese bacteriana, os OMVs têm sido propostos para uso em diversas aplicações biotecnológicas, incluindo como vacinas e veículos de entrega de medicamentos16,17,18,19,20. Para seu uso translacional em tais abordagens, é necessária uma preparação limpa e monodispersa de vesículas. Assim, são necessários métodos eficazes e eficientes de separação.
Mais comumente, a centrífugação gradiente de densidade (DGC) é usada para separar populações de vesículas heterogêneas de detritos celulares, incluindo flagelae e proteínas secretadas21; o método também tem sido relatado como uma abordagem para separar subpopulações OMV de tamanho heterogêneo12,13,14. No entanto, o DGC é demorado, ineficiente e altamente variável de usuário para usuário22 e, portanto, não é ideal para scale-up. Em contraste, a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) representa uma abordagem escalável, eficiente e consistente para purificar os OMVs21,23,24. Descobrimos que uma longa (50 cm), fluxo de gravidade, coluna SEC, preenchida com meio de filtragem de gel é suficiente para purificar e separar eficientemente subpopulações de OMVs. Especificamente, usamos essa abordagem para separar os OMVs A. actinomycetemcomitans em subpopulações "grandes" e "pequenas", bem como para remover a contaminação de proteínas e DNA. A purificação foi concluída em menos de 4h, e foi realizada a separação completa das subpopulações OMV e a remoção dos detritos.
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Protocol
1. Preparação de tampões
- Para preparar o tampão de lavagem ELISA, adicione 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) a 1 L de água desionizada (DI). Adicione 500 μL de polisorbato-20. Ajuste o pH para 7.2 usando HCl ou NaOH.
- Para preparar o buffer de bloqueio, adicione 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl e 10 g BSA. Adicione 500 μL de polisorbato-20 a 1 L de água DI. Ajuste o pH para 7.2 usando HCl ou NaOH.
- Para preparar o buffer de elução (PBS), adicione 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4e 0,24 g KH2PO4 a 1 L DI. Ajuste o pH para 7.4 usando HCl ou NaOH.
NOTA: Uma solução de 10x deste buffer pode ser feita e diluída com água DI conforme necessário.
2. Preparação da amostra de OMV
- Crescer células A. actinomycetemcomitans até a fase exponencial tardia (densidade óptica a 600 nm de 0,7). Pelota as células por centrifugação duas vezes a 10.000 x g a 4 °C por 10 min. Filtre o supernatante através de um filtro de 0,45 μm.
- Concentre o supernante livre de bactérias usando filtros de corte de peso molecular de 50 kDa. Ultracentrizar a solução concentrada a 105.000 x g a 4 °C por 30 min.
- Resuspengue a pelota em PBS e ultracentrifuuge novamente (105.000 x g a 4 °C por 30 min.) Resuspense a pelota em 2 mL de PBS.
3. Embalando a coluna S-1000
- Misture a garrafa de caldo do meio de filtragem de gel com uma haste de vidro e despeje em uma garrafa de vidro o volume necessário para encher a coluna, além de aproximadamente 50% de excesso (cerca de 135 mL). Deixe essas contas sentarem-se até que se acomodem, e depois decantar o excesso de líquido. Resuspenda as contas no buffer de eluição, de modo que a solução final seja aproximadamente 70% (em volume) gel, 30% tampão. Degas a solução sob vácuo.
- Monte a coluna de vidro verticalmente usando um suporte de anel e encha com tampão de eluição para molhar as paredes da coluna. Escorra o tampão até que haja apenas cerca de 1 cm de tampão restante na coluna.
- Sem criar bolhas, cuidadosamente pipeta contas na coluna, preenchendo a coluna até o topo. Continue a drenar o excesso de buffer durante todo esse processo. Certifique-se de não deixar as contas se acomodarem completamente antes de adicionar contas adicionais ao topo da coluna. A coluna deve ser embalada a uma altura de cerca de 2 cm abaixo da parte inferior do reservatório da coluna.
4. Carregar a amostra e coletar frações
- Degas o tampão de eluição sob vácuo. Lave a coluna com dois volumes de coluna (180 mL) de tampão de eluição.
- Deixe que o buffer restante entre totalmente na coluna. Uma vez que o buffer tenha atingido o topo da camada de gel, pipeta cuidadosamente uma amostra de 2 mL contendo OMVs (em uma concentração lipídica de aproximadamente 100 - 200 nmol/L) na superfície das contas, tomando cuidado para não perturbar nenhuma das contas na parte superior da coluna. Deixe a amostra entrar totalmente no gel, ou seja, quando nenhum líquido permanecer acima da camada de gel.
- Adicione com cuidado e lentamente o tampão de eluição em cima da coluna gel. Não perturbe a camada superior do gel, pois isso causará diluição amostral.
- Coloque um único tubo de 50 mL sob a coluna e abra a coluna. Colete os primeiros 20 mL do eluent. Adicione um tampão de eluição adicional na parte superior da coluna, com cuidado, conforme necessário para garantir que a coluna nunca esteja seca.
- Coloque uma série de tubos de 1,5 mL sob a coluna. Inicie a coluna e colete uma série de amostras de 1 mL em cada tubo. À medida que as amostras estão sendo coletadas, continue adicionando tampão de elução na parte superior da coluna, conforme necessário. Repita até que 96 frações tenham sido coletadas. Pare a coluna.
NOTA: As amostras devem ser armazenadas a -20 °C para armazenamento a longo prazo ou 4 °C para armazenamento a curto prazo até uma análise posterior. - Para limpar a coluna, execute um volume de coluna (90 mL) de 0,1 M NaOH através da coluna. Execute dois volumes de coluna (180 mL) de tampão de eluição através da coluna.
5. Análise amostral
- Para medir a concentração lipídica em cada fração, pipeta 50 μL de cada fração em um único poço de uma placa de 96 poços. Para cada poço, adicione 2,5 μL de corante lipofílico. Incubar por 15 s. Meça a intensidade da fluorescência em um leitor de placas com um comprimento de onda de excitação de 515 nm e um comprimento de onda de emissão de 640 nm. Para calcular a fração de todos os lipídios em cada amostra, somam todas as intensidades de emissão e dividem cada intensidade individual pelo total.
- Para medir a concentração de uma determinada proteína, pipeta 100 μL de cada fração em um único poço de uma placa imuno-placa ELISA. Incubar a 25 °C por 3 h.
- Decante as amostras. Adicione 200 μL de tampão de lavagem ELISA a cada poço e decante. Repita quatro vezes para um total de cinco lavagens.
- Adicione 200 μL de tampão de bloqueio a cada poço e incubar por 1h a 25 °C. Decantar.
- Incubar placas com tampão de bloqueio de 100 μL mais anticorpo primário (1:10.000 para anticorpo purificado; 1:10 para anticorpo não purificado) durante a noite a 4 °C. Decantar.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem ELISA a cada poço e decante. Repita quatro vezes para um total de cinco lavagens.
- Adicione 100 μL de tampão de lavagem ELISA mais anticorpo secundário (1:30.000) a cada poço. Incubar por 1h a 25 °C.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem ELISA a cada poço e decante. Repita quatro vezes para um total de cinco lavagens.
- Adicione 100 μL da solução de um passo de 3,3',5,5'-tetrameethylbenzidina (TMB) e incubar por 15-30 min ou até que uma cor azul se desenvolva. Pare a reação TMB com 50 μL da solução de parada.
- Em um leitor de placas, leia a absorvência de cada poço em um comprimento de onda de 450 nm.
- Para medir a concentração total de proteínas, registotam a absorvência em um comprimento de onda de 280 nm (A280) de cada fração, utilizando um espectrofotômetro UV-vis.
Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
Figura 1: Esquema do procedimento SEC. A coluna é embalada com meio de filtragem de gel desgaseado cuidadosamente para evitar bolhas e descontinuidades, em seguida, lavada com dois volumes de coluna de tampão de eluição. Em seguida, a amostra é cuidadosamente escoada na parte superior do gel, sem interromper a embalagem de gel. A coluna é aberta e executada até que a amostra entre completamente no gel. Neste ponto, o buffer é colocado na parte superior da coluna, e os primeiros 20 mL de elunato são coletados. Em seguida, uma série de frações de 1 mL é coletada. Essas frações são então colocadas em uma placa de 96 poços ou 96-bem de imuno-placa para análise de conteúdo lipídico e proteico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
A Figura 2 mostra resultados representativos deste método. Os OMVs produzidos por A. actinomycetemcomitans cep JP2 foram primeiro purificados da cultura sobrenante usando ultracentrifugação15. Anteriormente, descobrimos que esta cepa produz duas populações de OMVs, uma com diâmetros de cerca de 300 nm e outra com diâmetros de cerca de 100 nm15. Para separar essas populações de OMV, purificamos a amostra usando o protocolo SEC descrito acima. Cada fração foi analisada para conteúdo lipídico utilizando o corante lipofílico e para o conteúdo de toxina (LtxA) utilizando ensaio imunosorbente ligado a enzima (ELISA) ou um imunoblot. As concentrações lipídicas e toxinas são relatadas como percentuais, onde "%lipídio" indica qual a porcentagem do conteúdo lipídudo total da amostra em cada fração e "%toxina" indica qual a porcentagem do conteúdo total da toxina da amostra em cada fração.
A Figura 2A mostra os resultados médios de corante lipofílico com desvios padrão de três purificações separadas, cada uma realizada por um usuário diferente, demonstrando a reprodutibilidade desta técnica. Dois picos lipídes distintos são observados, correspondentes a OMVs "grandes" (fração número 13) e OMVs "pequenos" (fração número 25). Confirmamos o tamanho dos OMVs nesses picos utilizando dispersão dinâmica de luz (DLS) e encontramos os diâmetros médios dos OMVs nas frações 13 e 25 para 296,6 nm e 142,6 nm, respectivamente, como mostrado na Fig. 2A. Em comparação, o diâmetro médio da amostra OMV após a ultracentrifugação, mas antes da purificação da SEC foi previamente encontrado ser 161,0 nm15.
Na Figura 2B, a quantidade de LtxA em cada fração, obtida utilizando ELISA com um anticorpo monoclonal contra LtxA25, é mostrada sobreposta na concentração lipídica do painel A. Esta técnica demonstra que a toxina está associada principalmente a uma subpopulação de OMVs. A Figura 2C mostra a quantidade de LtxA em cada fração, medida usando uma técnica de imunoblot com o mesmo anticorpo monoclonal anti-LtxA25,sobreposto na concentração lipídica do painel A. Embora a tendência geral seja semelhante à observada na Figura 2B,a abordagem do imunobloto é muito menos sensível do que a técnica ELISA, resultando em perfis mais barulhentos. A Figura 2D mostra a porcentagem da concentração total de proteínas em cada fração, medida utilizando o A280, sobreposto no perfil de concentração lipídica. Este painel demonstra que a SEC é capaz de remover quantidades significativas de proteínas livres das preparações OMV, como evidenciado pelos altos valores A280 em frações superiores a 60. (Na verdade, a maior parte da proteína é encontrada nessas frações, que não contêm OMVs, demonstrando que uma grande quantidade de proteínas se purifica com os OMVs.) Além disso, este resultado mostra que a concentração total de proteínas não se correlaciona necessariamente com a concentração de proteínas específicas. No caso dos OMVs de A. actinomycetemcomtians, a LtxA associa-se principalmente à população de OMVs maiores, enquanto mais da proteína total se associa aos OMVs menores.
Juntos, esses resultados representativos demonstram uma série de características importantes do protocolo SEC para purificação do OMV. Primeiro, a técnica é altamente reproduzível, mesmo entre os usuários. Em segundo lugar, o uso de um corante lipofílico para detectar OMVs em cada fração é um método simples e confiável. Em terceiro lugar, para detectar concentrações proteicas específicas, a ELISA é mais robusta do que um imunoblot. Em quarto lugar, a SEC é capaz de remover grandes quantidades de impurezas, incluindo proteínas e ácidos nucleicos.
Figura 2: Resultados representativos. A. actinomycetemcomitans JP2 OMVs foram executados através da coluna SEC e cada fração foi analisada para conteúdo lipídico usando um corante lipofílico e conteúdo de toxina (LtxA) usando um anticorpo monoclonal. (A) O teor lipídeco médio de cada fração relatado como uma porcentagem do conteúdo lipídudo total, a partir de três ensaios. Cada ponto de dados representa a média ± desvio padrão. (B) O teor de LtxA de cada fração, relatado como uma porcentagem do conteúdo total de LtxA, medido pela ELISA com um anticorpo anti-LtxA monoclonal. (C) O teor de LtxA de cada fração, relatado como uma porcentagem do conteúdo total de LtxA, medido por um imunoblot com um anticorpo anti-LtxA monoclonal. (D) O teor total de proteínas de cada fração, relatado como percentual do teor total de proteína, medido por A280. Alguns dos dados são reproduzidos de Chang et al.26 com permissão de John Wiley and Sons Ltd. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo para a separação simples, rápida e reprodutível das subpopulações bacterianas OMV. Embora a técnica seja relativamente direta, existem alguns passos que devem ser realizados com muito cuidado para garantir que ocorra uma separação eficiente na coluna. Primeiro, é essencial que o gel seja carregado na coluna com cuidado e lentamente para evitar bolhas de ar. Observamos que deixar o gel em temperatura ambiente por várias horas antes de carregar a coluna permite que o gel se equilibre e minimiza a formação de bolhas dentro da coluna. Quando o gel é es tubo na coluna, deve ser cuidadosamente escoado ao longo da lateral da coluna para minimizar a turbulência. Em todos os momentos durante o carregamento, o excesso de tampão deve ser mantido na coluna para evitar descontinuidades no gel assentado. Se ocorrer uma disjunção, adicione mais tampão e pipeta para cima e para baixo para resuspensar o gel.
Da mesma forma, carregar a coluna com amostra é extremamente importante. Como a amostra será diluída à medida que passa pela coluna, a amostra carregada deve ser suficientemente concentrada antes da separação pela SEC. Para os OMVs A. actinomycetemcomitans, descobrimos que uma amostra de 1 mL contendo aproximadamente 100-200 nmol/L de lipídios é ideal. Depois que a amostra é carregada cuidadosamente na parte superior da coluna sem interromper a camada de gel, a coluna deve ser executada apenas até que a amostra entre totalmente na coluna de gel. Neste ponto, a coluna deve ser interrompida para que uma camada de tampão possa ser cuidadosamente adicionada à parte superior do gel. É útil carregar apenas um pequeno volume (~ 1 mL) de tampão, garantindo que a camada de gel não seja interrompida. Uma vez que a amostra tenha sido executada mais para dentro do gel, o buffer pode ser adicionado em volumes maiores e a preocupação com a interrupção da camada de gel é menos um problema. A coluna pode ser reutilizada várias vezes, desde que seja mantida em estado totalmente hidratado e bem limpa (Passo 4.6) entre as corridas.
Todos os procedimentos de purificação do OMV seguem os mesmos passos iniciais que incluem crescimento bacteriano, remoção de células bacterianas e isolamento OMV27. Embora essa preparação "bruta" tenha sido comumente usada em estudos OMV28,está se tornando cada vez mais evidente que uma etapa de purificação subsequente é necessária para remover proteínas co-precipitantes e outros contaminantes, bem como para separar subpopulações OMV. Em estudos de OMV, esta etapa de purificação é comumente concluída usando centrifugação de gradiente de densidade. No campo de vesícula extracelular eucariótico, o uso da SEC para separar populações de vesículas e remover contaminantes está aumentando em importância, pois é mais simples, rápido e menos caro que o DGC29. Além disso, a SEC tem a vantagem de ser possível automatizar, ao contrário do DGC29. Assim, enquanto o DGC continua a ser o "padrão-ouro" do isolamento vesícula no campo OMV bacteriano, propomos que as inúmeras vantagens da SEC o tornem um método extremamente útil, se não melhor, de purificação de OMV do que o DGC. Neste trabalho, demonstramos que uma coluna de 1,5 x 50 cm de S-1000 Sephacryl é capaz de separar duas subpopulações de OMVs. Observamos também que a abordagem é capaz de remover ácidos nucleicos e proteínas livres da solução OMV. Relatórios anteriores descobriram que a SEC pode remover LPS gratuitos das preparações do OMV, bem como28.
Em conclusão, propomos que a SEC seja muito promissora na purificação de vesículas bacterianas. Embora tenhamos demonstrado a capacidade da técnica de separar subpopulações de OMVs produzidos por uma bactéria específica (A. actinomycetemcomitans), prevemos que a técnica será considerada extremamente valiosa na análise de outras amostras de vesículas bacterianas, pois vê uso adicional. Em particular, à medida que as aplicações biotecnológicas dos OMVs aumentam, a necessidade de preparações de vesícula consistentes e puras também aumentará; A SEC é um método promissor para essas aplicações.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para relatar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência (1554417) e Institutos Nacionais de Saúde (DE027769).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
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