Summary
Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.
Abstract
Die Zellwand gramnegativer Bakterien besteht aus einer inneren (zytoplasmatischen) und äußeren Membran (OM), die durch eine dünne Peptidoglykanschicht getrennt sind. Während des gesamten Wachstums kann die äußere Membran kugelförmige äußere Membranvesikel (OMVs) bilden. Diese OMVs sind an zahlreichen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Frachtabgabe an Wirtszellen und der Kommunikation mit Bakterienzellen. In jüngster Zeit wurde das therapeutische Potenzial von OMVs untersucht, einschließlich ihrer Verwendung als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel. Obwohl OMVs vom OM abgeleitet sind, wird seit langem geschätzt, dass sich die Lipid- und Proteinladung der OMV oft deutlich von der der OM unterscheidet. In jüngerer Zeit wurden Beweise dafür entdeckt, dass Bakterien mehrere Arten von OMVs freisetzen können, und es gibt Hinweise darauf, dass die Größe den Mechanismus ihrer Aufnahme durch Wirtszellen beeinflussen kann. Studien in diesem Bereich sind jedoch durch Schwierigkeiten bei der effizienten Trennung der heterogen dimensionierten OMVs begrenzt. Zu diesem Zweck wurde traditionell die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet; Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und schwer zu skalieren. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hingegen ist weniger umständlich und eignet sich für das notwendige zukünftige Scale-up für den therapeutischen Einsatz von OMVs. Hier beschreiben wir einen SEC-Ansatz, der eine reproduzierbare Trennung von heterogen großen Vesikeln ermöglicht, wobei als Testfall OMVs von Aggregatibacter actinomycetemcomitanenverwendet werden, deren Durchmesser von weniger als 150 nm bis über 350 nm reicht. Wir demonstrieren die Trennung von "großen" (350 nm) OMVs und "kleinen" (<150 nm) OMVs, verifiziert durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Wir empfehlen SEC-basierte Techniken gegenüber DGC-basierten Techniken zur Trennung von heterogen großen Vesikeln aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit (einschließlich Benutzer-zu-Benutzer) und der Möglichkeit des Scale-ups.
Introduction
Gramnegative Bakterien setzen während des gesamten Wachstums Vesikel frei, die von ihrer äußeren Membran abgeleitet sind, sogenannte äußere Membranvesikel (OMVs). Diese OMVs spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation, sowohl zwischen Bakterien und Wirt als auch zwischen Bakterienzellen, indem sie eine Reihe wichtiger Biomoleküle tragen, darunter DNA / RNA, Proteine, Lipide und Peptidoglykane1,2. Insbesondere wurde die Rolle von OMVs bei der bakteriellen Pathogenese aufgrund ihrer Anreicherung in bestimmten Virulenzfaktoren und Toxinen3,4 ,5,6,7,8,9,10,11umfassend untersucht.
Es wurde berichtet, dass OMVs in der Größe von 20 bis 450 nm reichen, abhängig von den Elternbakterien und dem Wachstumsstadium, wobei mehrere Arten von Bakterien heterogene OMVsfreisetzen 8,12,13,14, die sich auch in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem Mechanismus des Wirtszelleintrittsunterscheiden 12. H. pylori gab OMVs mit einem Durchmesser von 20 bis 450 nm frei, wobei die kleineren OMVs eine homogenere Proteinzusammensetzung enthielten als die größeren OMVs. Wichtig ist, dass die beiden Populationen von OMVs von Wirtszellen über verschiedene Mechanismen internalisiert wurden12. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Population kleiner (<150 nm) OMVs zusammen mit einer Population großer (>350 nm) OMVs freisetzt, wobei die OMVs eine signifikante Menge eines sezernierten Proteintoxins, Leukotoxin (LtxA)15 enthalten. Während die Rolle der OMV-Heterogenität in zellulären Prozessen eindeutig wichtig ist, haben technische Schwierigkeiten bei der Trennung und Analyse verschiedener Populationen von Vesikeln diese Studien eingeschränkt.
Zusätzlich zu ihrer Bedeutung für die bakterielle Pathogenese wurden OMVs für den Einsatz in einer Reihe von biotechnologischen Anwendungen vorgeschlagen, darunter als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel16,17,18,19,20. Für ihre translationale Verwendung in solchen Ansätzen ist eine saubere und monodisperse Herstellung von Vesikeln erforderlich. Daher sind effektive und effiziente Trennmethoden notwendig.
Am häufigsten wird die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet, um heterogene Vesikelpopulationen von Zelltrümmern, einschließlich Flagellen und sezernierten Proteinen, zu trennen21; Die Methode wurde auch als Ansatz zur Trennung heterogen großer OMV-Subpopulationen12,13,14berichtet. DGC ist jedoch zeitaufwändig, ineffizient und sehr variabel von Benutzer zu Benutzer22 und daher nicht ideal für das Scale-up. Im Gegensatz dazu stellt die Größenausschlusschromatographie (SEC) einen skalierbaren, effizienten und konsistenten Ansatz zur Reinigung von OMVs21,23,24 dar. Wir haben festgestellt, dass eine lange (50 cm), Gravity-Flow, SEC-Säule, gefüllt mit Gelfiltrationsmedium, ausreicht, um Subpopulationen von OMVs effizient zu reinigen und zu trennen. Konkret haben wir diesen Ansatz verwendet, um A. actinomycetemcomitans OMVs in "große" und "kleine" Subpopulationen zu unterteilen sowie Protein- und DNA-Kontaminationen zu entfernen. Die Reinigung wurde in weniger als 4 Stunden abgeschlossen und die vollständige Trennung der OMV-Subpopulationen und die Entfernung von Trümmern wurde erreicht.
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Protocol
1. Vorbereitung von Puffern
- Um den ELISA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 L entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Fügen Sie 500 μL Polysorbat-20 hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
- Um den Blockierungspuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 10 g BSA hinzu. 500 μL Polysorbat-20 bis 1 L DI-Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
- Zur Herstellung des Elutionspuffers (PBS) werden 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 gNa2HPO4und 0,24 gKH2PO4 zu 1 L DI Wasser hinzugefügt. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,4 ein.
HINWEIS: Eine 10-fache Lösung dieses Puffers kann hergestellt und bei Bedarf mit DI-Wasser verdünnt werden.
2. Vorbereitung der OMV-Probe
- Züchten Sie A. actinomycetemcomitans-Zellen bis zur späten exponentiellen Phase (optische Dichte bei 600 nm von 0,7). Pelletieren Sie die Zellen durch zweimalige Zentrifugieren bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 min. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45 μm-Filter.
- Konzentrieren Sie den bakterienfreien Überstand mit 50 kDa-Molekulargewichts-Cut-off-Filtern. Ultrazentrifuge die konzentrierte Lösung bei 105.000 x g bei 4 °C für 30 min.
- Pellet in PBS und Ultrazentrifuge erneut schleudern (105.000 x g bei 4 °C für 30 Min.) Das Pellet in 2 ml PBS wieder auffüllen.
3. Verpacken der S-1000-Säule
- Mischen Sie die Vorratsflasche mit Gelfiltermedium mit einem Glasrührstab und gießen Sie in eine Glasflasche das Volumen, das zum Füllen der Säule erforderlich ist, plus ca. 50% Überschuss (ca. 135 ml). Lassen Sie diese Perlen sitzen, bis sie sich abgesetzt haben, und dekantieren Sie dann die überschüssige Flüssigkeit ab. Die Perlen in Elutionspuffer resuspendieren, so dass die endgültige Lösung etwa 70% (nach Volumen) Gel, 30% Puffer ist. Entgasen Sie die Lösung unter Vakuum.
- Montieren Sie die Glassäule vertikal mit einem Ringständer und füllen Sie sie mit einem Elutionspuffer, um die Wände der Säule zu benetzen. Entleeren Sie den Puffer, bis nur noch etwa 1 cm Puffer in der Säule verbleibt.
- Ohne Blasen zu erzeugen, pipetieren Sie die Perlen vorsichtig in die Säule und füllen Sie die Säule nach oben. Fahren Sie fort, überschüssigen Puffer während dieses Prozesses abzuleiten. Stellen Sie sicher, dass sich die Perlen nicht vollständig absetzen, bevor Sie zusätzliche Perlen an der Oberseite der Säule hinzufügen. Die Säule sollte bis zu einer Höhe von ca. 2 cm unter dem Boden des Säulenbehälters verpackt werden.
4. Beladen der Probe und Sammeln von Fraktionen
- Entgasen Sie den Elutionspuffer unter Vakuum. Waschen Sie die Säule mit zwei Säulenvolumina (180 ml) Elutionspuffer.
- Lassen Sie den verbleibenden Puffer vollständig in die Spalte gelangen. Sobald der Puffer die Oberseite der Gelschicht erreicht hat, pipettieren Sie vorsichtig eine 2-ml-Probe, die OMVs enthält (bei einer Lipidkonzentration von etwa 100 - 200 nmol / L), auf die Oberfläche der Perlen, wobei Sie darauf achten, keine der Perlen an der Oberseite der Säule zu stören. Lassen Sie die Probe vollständig in das Gel eindringen, dh wenn keine Flüssigkeit über der Gelschicht verbleibt.
- Fügen Sie vorsichtig und langsam einen Elutionspuffer auf die Gelsäule hinzu. Stören Sie nicht die oberste Schicht des Gels, da dies zu einer Verdünnung der Probe führt.
- Legen Sie ein einzelnes 50-ml-Rohr unter die Säule und öffnen Sie die Säule. Sammeln Sie die ersten 20 ml des Eluenten. Fügen Sie bei Bedarf vorsichtig einen zusätzlichen Elutionspuffer an der Oberseite der Säule hinzu, um sicherzustellen, dass die Säule niemals trocken ist.
- Legen Sie eine Reihe von 1,5-ml-Röhrchen unter die Säule. Starten Sie die Säule und sammeln Sie eine Reihe von 1-ml-Proben in jedem Röhrchen. Während die Proben gesammelt werden, fügen Sie bei Bedarf weiterhin einen Elutionspuffer oben in der Spalte hinzu. Wiederholen Sie, bis 96 Fraktionen gesammelt wurden. Stoppen Sie die Spalte.
HINWEIS: Die Proben sollten bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder 4 °C für die kurzfristige Lagerung bis zur weiteren Analyse gelagert werden. - Um die Säule zu reinigen, führen Sie ein Spaltenvolumen (90 ml) von 0,1 M NaOH durch die Säule. Führen Sie zwei Spaltenvolumina (180 ml) Elutionspuffer durch die Säule.
5. Probenanalyse
- Um die Lipidkonzentration in jeder Fraktion zu messen, pipettieren Sie 50 μL jeder Fraktion in eine einzige Vertiefung einer 96-Well-Platte. Zu jeder Vertiefung werden 2,5 μL lipophiler Farbstoff hinzugefügt. Inkubieren für 15 s. Messen Sie die Fluoreszenzintensität an einem Plattenleser mit einer Anregungswellenlänge von 515 nm und einer Emissionswellenlänge von 640 nm. Um den Anteil aller Lipide in jeder Probe zu berechnen, summieren Sie alle Emissionsintensitäten und dividieren Sie jede einzelne Intensität durch die Summe.
- Um die Konzentration eines bestimmten Proteins zu messen, pipetten Sie 100 μL jeder Fraktion in eine einzelne Vertiefung einer ELISA-Immunplatte. Bei 25 °C für 3 h inkubieren.
- Dekantieren Sie die Samples. Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
- Fügen Sie 200 μL Blockierpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei 25 °C. Umfüllen.
- Inkubationsplatten mit 100 μL Sperrpuffer plus primärem Antikörper (1:10.000 für gereinigte Antikörper; 1:10 für ungereinigte Antikörper) über Nacht bei 4 °C. Umfüllen.
- Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
- Fügen Sie 100 μL ELISA-Waschpuffer plus sekundären Antikörper (1:30.000) zu jeder Vertiefung hinzu. 1 h bei 25 °C inkubieren.
- Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
- Fügen Sie 100 μL der 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) einstufigen Lösung hinzu und inkubieren Sie sie für 15-30 min oder bis sich eine blaue Farbe entwickelt. Stoppen Sie die TMB-Reaktion mit 50 μL der Stopplösung.
- Lesen Sie auf einem Plattenleser die Absorption jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 450 nm ab.
- Um die Gesamtproteinkonzentration zu messen, zeichnen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm (A280)jeder Fraktion mit einem UV-Vis-Spektralphotometer auf.
Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des SEC-Verfahrens. Die Säule wird sorgfältig mit entgastem Gelfiltrationsmedium verpackt, um Blasen und Diskontinuitäten zu vermeiden, und dann mit zwei Säulenvolumina Elutionspuffer gewaschen. Als nächstes wird die Probe vorsichtig auf die Oberseite des Gels pipettiert, ohne die Gelverpackung zu stören. Die Säule wird geöffnet und läuft, bis die Probe vollständig in das Gel gelangt. An diesem Punkt wird der Puffer auf die Oberseite der Säule gelegt und die ersten 20 ml Eluat werden gesammelt. Als nächstes wird eine Reihe von 1-ml-Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen werden dann in eine 96-Well-Platte oder eine 96-Well-Immuno-Platte zur Analyse des Lipid- und Proteingehalts gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse dieser Methode. OMVs, die von A. actinomycetemcomitans Stamm JP2 produziert wurden, wurden zuerst aus dem Kulturüberstand mittels Ultrazentrifugation15gereinigt. Wir haben zuvor festgestellt, dass dieser Stamm zwei Populationen von OMVs produziert, eine mit Durchmessern von etwa 300 nm und eine mit Durchmessern von etwa 100 nm15. Um diese OMV-Populationen zu trennen, haben wir die Probe mit dem oben beschriebenen SEC-Protokoll gereinigt. Jede Fraktion wurde mit dem lipophilen Farbstoff auf den Lipidgehalt und mit einem Immunoblot (LtxA) auf toxingehalt (LtxA) mit einem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) oder einem Immunoblot analysiert. Die Lipid- und Toxinkonzentrationen werden als Prozentangaben angegeben, wobei "%lipid" angibt, welcher Prozentsatz des Gesamtlipidgehalts der Probe in jeder Fraktion und "%Toxin" angibt, welcher Prozentsatz des Gesamttoxingehalts der Probe in jeder Fraktion ist.
Abbildung 2A zeigt die gemittelten lipophilen Farbstoffergebnisse mit Standardabweichungen von drei separaten Reinigungen, die jeweils von einem anderen Benutzer durchgeführt wurden, was die Reproduzierbarkeit dieser Technik demonstriert. Es werden zwei unterschiedliche Lipidpeaks beobachtet, die "großen" OMVs (Fraktion Nummer 13) und "kleinen" OMVs (Fraktion Nummer 25) entsprechen. Wir bestätigten die Größe der OMVs in diesen Peaks mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und fanden die mittleren Durchmesser der OMVs in den Fraktionen 13 und 25 auf 296,6 nm bzw. 142,6 nm, wie in Abb. 2A. Im Vergleich dazu wurde der mittlere Durchmesser der OMV-Probe nach Ultrazentrifugation, aber vor der SEC-Reinigung zuvor als 161,0 nm15festgestellt.
In Abbildung 2Bist die Menge an LtxA in jeder Fraktion, die mit ELISA mit einem monoklonalen Antikörper gegen LtxA25 erhalten wurde, über die Lipidkonzentration aus Panel A überlagert. Diese Technik zeigt, dass das Toxin hauptsächlich mit einer Subpopulation von OMVs assoziiert ist. Abbildung 2C zeigt die Menge an LtxA in jeder Fraktion, gemessen mit einer Immunoblot-Technik mit dem gleichen monoklonalen Anti-LtxA-Antikörper25,überlagert von der Lipidkonzentration aus Panel A. Während der Gesamttrend dem ähnelt, was in Abbildung 2Bbeobachtet wird, ist der Immunoblot-Ansatz viel weniger empfindlich als die ELISA-Technik, was zu lauteren Profilen führt. Abbildung 2D zeigt den Prozentsatz der Gesamtproteinkonzentration in jeder Fraktion, gemessen mit dem A280, überlagert mit dem Lipidkonzentrationsprofil. Dieses Panel zeigt, dass SEC in der Lage ist, signifikante Mengen an freien Proteinen aus den OMV-Präparaten zu entfernen, wie die hohen A280-Werte in Fraktionen größer als 60 zeigen. (Tatsächlich wird der größte Teil des Proteins in diesen Fraktionen gefunden, die keine OMVs enthalten, was zeigt, dass eine große Menge an Protein mit den OMVs co-reinigt.) Darüber hinaus zeigt dieses Ergebnis, dass die Gesamtproteinkonzentration nicht unbedingt mit der Konzentration bestimmter Proteine korreliert. Im Fall von A. actinomycetemcomtians OMVs assoziiert LtxA hauptsächlich mit der Population größerer OMVs, während ein größerer Teil des Gesamtproteins mit den kleineren OMVs assoziiert wird.
Zusammen zeigen diese repräsentativen Ergebnisse eine Reihe wichtiger Merkmale des SEC-Protokolls für die OMV-Reinigung. Erstens ist die Technik auch zwischen Den Benutzern in hohem Maße reproduzierbar. Zweitens ist die Verwendung eines lipophilen Farbstoffs zum Nachweis von OMVs in jeder Fraktion eine einfache und zuverlässige Methode. Drittens ist ELISA zur Detektion spezifischer Proteinkonzentrationen robuster als ein Immunoblot. Viertens ist SEC in der Lage, große Mengen an Verunreinigungen, einschließlich Proteinen und Nukleinsäuren, zu entfernen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse. A. Actinomycetemcomitane JP2 OMVs wurden durch die SEC-Säule geführt und jede Fraktion wurde mit einem lipophilen Farbstoff und Toxingehalt (LtxA) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers auf Lipidgehalt analysiert. (A) Der durchschnittliche Lipidgehalt jeder Fraktion, der als Prozentsatz des Gesamtlipidgehalts aus drei Versuchen angegeben wurde. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert ± Standardabweichung dar. (B) Der LtxA-Gehalt jeder Fraktion, angegeben als Prozentsatz des gesamten LtxA-Gehalts, gemessen durch ELISA mit einem monoklonalen Anti-LtxA-Antikörper. (C) Der LtxA-Gehalt jeder Fraktion, angegeben als Prozentsatz des gesamten LtxA-Gehalts, gemessen durch einen Immunoblot mit einem monoklonalen Anti-LtxA-Antikörper. D) Gesamtproteingehalt jeder Fraktion, angegeben als Prozentsatz des Gesamtproteingehalts, gemessen mit A280. Einige der Daten wurden von Chang et al.26 mit Genehmigung von John Wiley and Sons Ltd. reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier haben wir ein Protokoll für die einfache, schnelle und reproduzierbare Trennung bakterieller OMV-Subpopulationen bereitgestellt. Obwohl die Technik relativ einfach ist, gibt es einige Schritte, die äußerst sorgfältig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass eine effiziente Trennung in der Säule erfolgt. Zunächst ist es wichtig, dass das Gel vorsichtig und langsam in die Säule geladen wird, um Luftblasen zu vermeiden. Wir haben beobachtet, dass das Gel vor dem Laden der Säule mehrere Stunden bei Raumtemperatur belassen wird, wodurch sich das Gel ausgleichen und die Blasenbildung innerhalb der Säule minimiert. Wenn das Gel in die Säule pipettiert wird, sollte es vorsichtig entlang der Seite der Säule pipetiert werden, um Turbulenzen zu minimieren. Zu jeder Zeit während der Beladung sollte ein überschüssiger Puffer in der Säule gehalten werden, um Diskontinuitäten im abgesetzten Gel zu vermeiden. Wenn eine Disjunktion auftreten sollte, fügen Sie mehr Puffer hinzu und pipetten Sie nach oben und unten, um das Gel wieder aufzulösen.
Ebenso ist das Laden der Spalte mit der Probe von entscheidender Bedeutung. Da die Probe beim Durchgang durch die Säule verdünnt wird, sollte die beladene Probe vor der Trennung durch SEC ausreichend konzentriert werden. Für die OMVs von A. actinomycetemcomitans haben wir festgestellt, dass eine 1-ml-Probe mit etwa 100-200 nmol/L Lipiden ideal ist. Nachdem die Probe vorsichtig an der Oberseite der Säule geladen wurde, ohne die Gelschicht zu stören, sollte die Säule nur so lange geführt werden, bis die Probe vollständig in die Gelsäule gelangt. An dieser Stelle sollte die Säule gestoppt werden, damit eine Pufferschicht vorsichtig auf die Oberseite des Gels hinzugefügt werden kann. Es ist hilfreich, nur ein kleines Volumen (~ 1 ml) Puffer zu laden, um sicherzustellen, dass die Gelschicht nicht gestört wird. Sobald die Probe weiter in das Gel geführt wurde, kann Puffer in größeren Mengen hinzugefügt werden, und die Sorge, die Gelschicht zu stören, ist weniger ein Problem. Die Säule kann mehrmals wiederverwendet werden, solange sie in einem vollständig hydratisierten Zustand gehalten und zwischen den Läufen gut gereinigt wird (Schritt 4.6).
Alle OMV-Reinigungsverfahren folgen den gleichen ersten Schritten, die das Bakterienwachstum, die Entfernung von Bakterienzellen und die OMV-Isolierungumfassen 27. Obwohl dieses "rohe" Präparat in OMV-Studien28häufig verwendet wurde, wird immer deutlicher, dass ein nachfolgender Reinigungsschritt notwendig ist, um co-fällungsierende Proteine und andere Verunreinigungen zu entfernen sowie OMV-Subpopulationen zu trennen. In OMV-Studien wird dieser Reinigungsschritt üblicherweise mit dichtem Gradientenzentrifugation durchgeführt. Im eukaryotischen extrazellulären Vesikelbereich gewinnt der Einsatz von SEC zur Trennung von Vesikelpopulationen und zur Entfernung von Verunreinigungen zunehmend an Bedeutung, da es einfacher, schneller und kostengünstiger ist als DGC29. Darüber hinaus hat SEC den Vorteil, dass es im Gegensatz zu DGC29automatisiert werden kann. Während DGC also der "Goldstandard" der Vesikelisolierung im bakteriellen OMV-Bereich bleibt, schlagen wir vor, dass die zahlreichen Vorteile von SEC es zu einer äußerst nützlichen, wenn nicht sogar besseren Methode der OMV-Reinigung als DGC machen. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass eine 1,5 x 50 cm große Säule von Sephacryl S-1000 in der Lage ist, zwei Subpopulationen von OMVs zu trennen. Wir haben auch beobachtet, dass der Ansatz in der Lage ist, Nukleinsäuren und freie Proteine aus der OMV-Lösung zu entfernen. Frühere Berichte haben ergeben, dass SEC in der Lage ist, kostenloses LPS aus OMV-Präparaten zu entfernen, sowie28.
Abschließend schlagen wir vor, dass SEC bei der Reinigung von bakteriellen Vesikeln viel versprechend ist. Während wir die Fähigkeit der Technik demonstriert haben, Subpopulationen von OMVs zu trennen, die von einem bestimmten Bakterium (A. actinomycetemcomitans) produziert werden, erwarten wir, dass sich die Technik bei der Analyse anderer bakterieller Vesikelproben als äußerst wertvoll erweisen wird, da sie zusätzlichen Nutzen sieht. Insbesondere mit zunehmender biotechnologischer Anwendung von OMVs wird auch der Bedarf an konsistenten und reinen Vesikelpräparaten zunehmen; SEC ist eine vielversprechende Methode für diese Anwendungen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (1554417) und den National Institutes of Health (DE027769) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
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