Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig frysning ved hjælp af Sandwich Frysning Device for god ultrastrukturel bevarelse af biologiske prøver i ElektronMikroskopi

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62431
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

Her viser vi, hvordan man bruger sandwichfrysningsanordningen til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Vi viser også, hvordan man forbereder prøver til ultratynde afsnit efter hurtig frysning.

Abstract

Kemisk fiksering er blevet brugt til at observere ultrastrukturen af celler og væv. Denne metode bevarer imidlertid ikke i tilstrækkelig grad cellernes ultrastruktur. artefakter og udvinding af celleindhold observeres normalt. Hurtig frysning er et bedre alternativ til bevarelse af cellestruktur. Sandwichfrysning af levende gær eller bakterier efterfulgt af frysesubstitution er blevet brugt til at observere den udsøgte naturlige ultrastruktur af celler. For nylig er sandwichfrysning af glutaraldehyd-faste dyrkede celler eller humane væv også blevet brugt til at afsløre ultrastrukturen af celler og væv.

Disse undersøgelser er hidtil blevet udført med en håndlavet sandwichfrysningsanordning, og ansøgninger til undersøgelser i andre laboratorier har været begrænsede. En ny sandwich fryseanordning er for nylig blevet fremstillet og er nu kommercielt tilgængelig. Dette papir viser, hvordan man bruger sandwichfrysningsanordningen til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Også vist er forberedelsen af prøver til ultratynde afsnit efter hurtig frysning og procedurer for frysesubstitution, harpiksindlejring, trimning af blokke, skæring af ultratynde sektioner, genfinering af sektioner, farvning og dækning af gitre med støttefilm.

Introduction

Elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at studere celle ultrastruktur. Kemisk fiksering med konventionelle dehydreringsprocedurer er blevet brugt til at observere ultrastrukturen af celler og væv. Denne metode bevarer dog ikke i tilstrækkelig grad cellernes ultrastruktur, og artefakter og udvinding af celleindhold observeres normalt. Hurtig frysning og frysesubstitution af celler og væv er bedre alternativer til bevarelse af cellestruktur.

Tre hovedmetoder er blevet anvendt til frysning af celler hurtigt1:1) frysning af dyk udføres ved at kaste prøver i et afkølet kryogen, såsom propan, og blev anvendt siden begyndelsen af 1950'erne2; 2) frysning af koldmetalblok udføres ved hurtigt at smække celler og væv på en metalblok, der er afkølet med flydende nitrogen eller flydende helium3,4; og 3) højtryksfrysning sker ved at fryse celler og væv med flydende nitrogen under højt tryk5,6,7.

Sandwichfrysning er en form for frysning af dyk, der udføres ved at sandwiche tynde biologiske materialer mellem to kobberskiver og hurtigt fryse dem ved at kaste dem i flydende propan8,9,10. I denne metode afkøles meget tynde prøver (et par mikrometer tykke) hurtigt med cryogen ved hjælp af et metal, der har god termisk ledningsevne fra begge sider. Således fjerner denne metode effektivt varme fra prøverne, hvilket gør det muligt at fryse celler stabilt uden iskrystalskader. Sandwichfrysning efterfulgt af frysesubstitution af levende gær og bakterieceller afslører den naturlige ultrastruktur af cellerne10,11,12,13,14,15,16.

For nylig har denne metode vist sig at være nyttig til at bevare klare cellebilleder af glutaraldehydfaste mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, dyrkede celler25,26,27og menneskelige celler og væv1,28 . Selv om disse undersøgelser er blevet udført ved hjælp af en håndlavet sandwich fryseanordning29, og applikationer til andre undersøgelser i andre laboratorier har været begrænset, en ny sandwich fryseanordning (SFD) er blevet fremstillet28 og er nu kommercielt tilgængelig.

Nærværende papir viser, hvordan man bruger SFD til hurtig frysning af biologiske prøver, herunder bakterier, gær, dyrkede celler, isolerede celler, dyre- og humane væv og vira. Også vist er forberedelsen af prøver til ultratynde skæring efter hurtig frysning, samt procedurer for frysesubstitution, harpiksindlejring, trimning af blokke, skæring af ultratynde sektioner, genfinering af sektioner, farvning og dækning af gitre med støttefilm.

Protocol

BEMÆRK: Undersøgelsens protokol for humane prøver blev godkendt af Biomedical Research Ethics Committee of the Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmium tetroxid er et farligt kemikalie; den skal håndteres med handsker i røghætten. Figur 1 viser sandwichfrysningsanordningen og de nødvendige værktøjer28. Figur 2 viser de materialer, der er nødvendige for at udføre sandwichfrysningsforsøg. Glasglasglas fyldes med acetone, der indeholder osmiumtteoxid, og opbevares ved -80 °C, indtil de anvendes (Figur 2B). Kobberskiver er 3 mm i diameter, uden huller, har et bogstav på den ene side og er kommercielt tilgængelige (Figur 2C).

1. Hurtig frysning af celleaffjedring til frysesubstitution

BEMÆRK: Hele proceduren er vist i figur 3.

  1. Celler
    1. Brug celle suspensioner af bakterier, gær (Figur 2A), dyrkede celler, og isolerede celler til sandwich frysning.
      BEMÆRK: Både levende og glutaraldehyd-faste celler kan bruges28.
  2. Fremstilling af flydende propan
    BEMÆRK: Brug cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende nitrogen. Da propan er eksplosiv, skal man passe på ikke at bruge brande i samme rum, og vinduer skal holdes åbne.
    1. Fyld SFD'ens flydende nitrogenbeholder med flydende nitrogen (Figur 4A). Fyld væskepropbeholderen med flydende propan ved at indføre propangas ved hjælp af en fin dyse (Figur 4B, C). Fremskynde størkning af propan ved hjælp af en afkølet metalstang (Figur 1 og Figur 4D,E).
  3. Forberedelse af kobberskiver
    1. Placer kobberskiver på et diasglas med no-letter-side op (Figur 2D) og behandle med glød udledning på 10 Pa, 400 volt, 1 mA for 30 s (Figur 4F, G) for at gøre disken overflade hydrofil ved hjælp af en ion sputter apparat30.
  4. Sandwiching og frysning af cellen
    1. Celleaffjedringen overføres til et 2-mL centrifugerør (Figur 5A) og centrifuge ved 2.900 × g for 10 s ved stuetemperatur (Figur 5B, C). Fjern supernatanten, og ophæng pelleten for at opnå en tyk affjedring (se diskussion).
    2. Placer en lille mængde af celleaffjedringen (~0,02 μL) på en kobberskive (Figur 5D-F), dæk den med en anden kobberskive (Figur 5G), og tag diskene op med pincet (Figur 5H).
      BEMÆRK: For at måle ~0,02 μL af celleaffjedringen skal du observere 0,1 μL dråber af suspensionen under stereomikroskopet og opdele dem i dråber, der er 1/5th af dette volumen.
    3. Lav en brønd i midten af den faste propan med den tynde metalstang(Figur 5I). Sæt pincet i en SFD og fastfrys dem hurtigt ved at trykke på apparatets injektionsknap (Figur 5J, K).
      BEMÆRK: Man skal passe på ikke at tørre prøverne og ikke lægge de to diske helt over hinanden (ellers ville det blive meget vanskeligt at løsne dem i næste trin).
  5. Sandwiching og frysning af animalske og menneskelige væv
    1. Brug animalske og humane væv (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm), der er fastgjort i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) (figur 6A,B). Skær dem i 0,1- til 0,2 mm tykke sektioner med et barberblad under et stereomikroskop (Figur 6C,D).
      1. Placer en lille dråbe (~0,02 μL) glutaraldehydopløsning på en kobberdisk (Figur 6E, F). Brug derefter pincet til at placere et stykke væv i glutaraldehyd på kobberskiven (Figur 6G, H) og dække det med en anden kobberskive ( Figur6I-K).
      2. Fastfryse diskene med vævene i SFD'ens smeltende propan som beskrevet i punkt 1.4 (Figur 5J, K).
        BEMÆRK: Da glutaraldehyd er et farligt kemikalie, skal det håndteres iført handsker i røghætten. Væv bør ikke vaskes med buffere, når de placeres på en kobberskive, men holdes gennemblødt i glutaraldehydopløsning, fordi glutaraldehyd har en antifrysningseffekt1.
  6. Frysesubstitution med osmium acetone
    1. Diske overføres til flydende nitrogen i et arbejdsbad (Figur 7A, B). Brug et par pincet afkølet i flydende nitrogen, løsrive diskene fra hinanden for at eksponere prøven (Figur 7C-E).
    2. Anbring diskene med cellerne i et glasglas (Figur 7F), der er fyldt med 1 ml acetone indeholdende 2 % osmiumtetroxid (Figur 2B), der er anbragt i flydende nitrogen og størknet (Figur 4H).
    3. Overfør diskene til en dybfryser, og opbevar dem ved -80 °C i 2-4 dage for frysesubstitution af cellerne (Figur 3). Læg de brugte pincet i blød i vand ved stuetemperatur for at opvarme dem (figur 7G) til frysning af følgende prøver.
      BEMÆRK: Pincet til håndtering af prøven skal være varm (stuetemperatur), fordi kolde pincet kan fryse prøven før hurtig frysning, hvilket fører til dannelse af iskrystaller.
  7. Prøve opvarmning og indlejring
    1. Bring gradvist prøverne til stuetemperatur (2 timer ved -20 °C, 2 time ved 4 °C og 15 min ved stuetemperatur, figur 3 og figur 8A),og overfør diskene til 2 ml plastrør, der fyldes med 1 ml acetone (figur 3 og figur 8B, C).
    2. Forbered epoxyharpiks ved at blande reagenserne i en engangsplastbeholder ved hjælp af en omrører (Figur 8D-F).
    3. Byt acetone i trin 1.7.1 successivt med 30% harpiks (i acetone), 60% harpiks, og 90% harpiks ved stuetemperatur i 1 time hver. Derefter udveksles 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 ° C natten over. Endelig integrere prøverne i 100% harpiks (Figur 8G-J) i silicium indlejring skimmel, og polymerisere dem ved 60 ° C for 24 h (Figur 3).
      BEMÆRK: Prøverne skal forblive fastgjort til kobberdisketterne under hele proceduren (for at gøre det lettere at dele). Brugen af et roterende eller rystende apparat anbefales ikke under indlejringsprocessen, fordi de ikke bidrager meget til harpiksens indtrængning i cellen. Desuden får vibrationerne fra apparatet nogle gange prøverne til at løsne sig fra kobberskiverne. Inkubation ved 37 ° C natten ville fremskynde indtrængning af harpiks i cellen på grund af termisk energi (harpiksen ville ikke polymerisere, fordi det ikke indeholder nogen accelerator).
  8. Trimning af prøveblokke
    1. Tag de polymeriserede blokke ud af siliciumindlejringsformene (Figur 9A). Skriv prøvenummeret på blokken (Figur 9B).
    2. Fjern kobberskiverne fra blokken med et barberblad (Figur 9C, D ), og trim deprøver,der er indlejret på blokoverfladen, til 0,7 mm x 0,7 mm ved hjælp af et ultralydsbeskæringsblad (Figur 9E) og barberblade (Figur 9F-H) under et stereomikroskop31.
    3. Sæt blokken i en prøveholder af en ultramikrotom (Figur 9I) og skær blokkens ansigt glat med en diamanttrimningskniv (Figur 9J,K).
  9. Skæring ultratynde sektioner
    1. Fjern blokken fra ultramikrotomen (Figur 10A)31, sæt den i et stereomikroskop, og trim den yderligere til 0,2 mm x 0,3 mm med et barberblad (Figur 10B, C).
    2. Påfør neopren på gitrene for at gøre dem klæbende (Figur 10D). Sæt blokken tilbage på ultramikrotomen, dæk ultramikrotomen med et plastikdæksel (Figur 10E)31, og skær 50-70-nm tykke sektioner (Figur 10F-H).
    3. Hent sektionerne ved hjælp af en løkke (Figur 10I), monter dem på 300 eller 400 mesh kobbergitre behandlet med neopren, og tør dem (Figur 10J).
  10. Farvning af sektioner og observation under elektronmikroskopet
    1. Sæt gitrene med sektioner i rillen på det halve silikonerør (Figur 11A)31, og blød i uranylacetatopløsning og blycitrat i 3 min hver til farvning (Figur 11B-E)32.
    2. For gær- og svampeprøver skal gitrene placeres på et filterpapir (4 mm x 4 mm), samle dem op med pincet og dække dem med plasmapolymeriseret naphthalenfilm33 på vandets overflade (Figur 11F, G). Sæt gitrene i et elektronmikroskop, og hold øje med 100 kV (Figur 11H, I).

2. Hurtig frysning af vira og makromolekyler

  1. Fremstilling af flydende ethan
    BEMÆRK: Brug cryogloves og beskyttelsesbriller ved håndtering af flydende nitrogen. Da ethan er eksplosivt, skal man passe på ikke at bruge brande i samme rum, og vinduer skal holdes åbne. Ethan bruges, fordi det fordamper i elektronmikroskopet, mens propan ikke gør.
    1. Fyld SFD'ens flydende nitrogenbeholder med flydende nitrogen. Fyld væskedehanbeholderen med flydende ethan ved at indføre ethangas gennem en fin dyse.
  2. Forberedelse og hurtig frysning af mikrogrider og prøver
    1. Gør begge ansigter af mikrogrids hydrofile ved at behandle dem med glød udledning (10 Pa, 400 V, 1 mA) ved hjælp af en ion sputter apparat30.
    2. Sæt mikrogrebet i SFD'en, og påfør 2 μL af virus- eller makromolekylær suspension (1 mg protein/mL) på mikrogriderne. Fjern overskydende væske ved hjælp af filterpapir, og frysning hurtigt mikrogrebet ved at trykke på apparatets injektionsknap.
  3. Indstilling af det frosne mikronet i en kryooverførselsholder og observation under elektronmikroskopet
    1. Overfør de frosne mikrogrider i flydende nitrogen, der er indstillet i en kryooverførselsholder, der er afkølet ved flydende nitrogentemperatur på forhånd, og observere under et elektronmikroskop ved lav temperatur34.

Representative Results

Levende celler af mikroorganismer i suspension blev indsamlet ved centrifugering, klemt inde mellem to kobber diske, hurtigt frosset med SFD, fryse-erstattet, indlejret i epoxy harpiks, ultratynd-sektionsafsnittet, farves, og observeret under en elektron mikroskop ved at følge de procedurer, der er beskrevet ovenfor. Figur 12 viser ultratynde dele af Escherichia coli (bakterier, figur 12A, B)16 og Saccharomyces cerevisiae (gær, figur 12C)15. Bemærk, at billederne er meget klare og viser naturlig morfologi.

Glutaraldehyd-faste celle suspensioner af dyrkede celler og isolerede dyreceller blev indsamlet og hurtigt frosset med SFD, fryse-erstattet, og observeret under en elektron mikroskop ved at følge de procedurer, der er beskrevet ovenfor. Figur 13 viser ultratynde dele af dyrkede celler (Figur 13A-C)1,28 og isolerede celler fra musens bughule ( Figur13D)28. Figur 14 viser ultratynde dele af huden på mennesker (Figur 14A-D) og buffy coat ( Figur14E)1. Bemærk, at billederne også er meget klare og viser naturlig morfologi. Figur 15 viser hepatitis B-viruskernepartikler, der hurtigt fryses med SFD og observeres ved kryoelektronmikroskopi34. Som med de andre celler er billederne meget klare og viser naturlig morfologi.

Figure 1
Figur 1: Sandwichfrysningsenhed28 og de nødvendige værktøjer.

Figure 2
Figur 2: Materialer, der er nødvendige for at udføre sandwichfrysningsforsøg. Vægtstang = 10 μm. (B) Glasglas (10 ml), der indeholder 1 ml acetone med 2% osmium tetroxid. (C) Kobberskiver, der viser en overflade uden bogstav (venstre) og en overflade med et bogstav (højre). Skalastang = 3 mm. Scanning elektronmikroskopi. (D) Kobberskiver uden bogstav-side op blev placeret på et glas dias med dobbeltsidet tape (*). Vægtstang = 3 mm. (E) En dobbeltkantet barbermaskine og en ødelagt dobbeltkantet barbermaskine til udskæring af dyre- og humane væv, en enkantet barbermaskine til trimning af blokke og strimlet bord til udskæring af dyre- og humane væv. (F) Pincet med ekstruderet polystyren skum for at beskytte fingrene mod kulden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Prøveforberedelse af celleaffjedring ved hjælp af sandwichfrysningsmetoden. Forkortelser: r.t. = stuetemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Fremstilling af flydende propan, kobberskiver og fiksativ. (A) Flydende nitrogen (pil) blev hældt i sandwichfrysningsanordningens flydende nitrogenbeholder. (B) Propangas blev indført i en flydende propanbeholder gennem en fin dyse. (C) Flydende propan (pil). (D) En metalstang (pil) blev brugt til at afkøle flydende propan for at fremskynde størkningen af flydende propan. (E) Størknet propan (pil). (F) Ion sputter apparat (pil) til fremstilling af kobber diske hydrofil med glød udledning. (G) Glød udledning. (H) Glasglas anbringes i flydende nitrogen i et arbejdsbad. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Hurtig frysning af celleophæng (gær) ved hjælp af sandwichfrysningsanordningen. (B) Mikrocentrifuge. (C) Pellet af Saccharomyces cerevisiae i centrifugerøret (pil). (D) Overførsel af prøven med en mikropipette fra centrifugerøret. (E) Placering af prøven på kobberskiven. (F) En lille dråbe af en prøve på kobberskiven (pil). (G) Dækker prøven med en anden kobberskive. (H) Picking de to diske op med pincet. (I) At lave en brønd i den faste propan ved hjælp af den tynde metalstang. (J) Dykfrysning af prøven ved at trykke på injektionsknappen. (K) Frysningen er fuldført. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Forberedelse af en prøve af humant væv (hud). (A, B) Human hudvæv fastgjort i glutaraldehyd i en petriskål. Skalastang = 5 mm. (C, D) Væv (pil) blev skåret ved hjælp af to tveæggede barbermaskiner på et strimlet bord. (E, F) En lille dråbe glutaraldehydopløsning (pil) blev placeret på en kobberdisk. (G, H) Et stykke hudvæv blev placeret på kobberskiven ved hjælp af pincet. (I) En anden disk blev brugt til at dække kobberskiven med hudvævet. Desandwichede diske blev samlet op med pincet. (K) De klemte diske blev forsigtigt holdt med pincet. Bemærk kløften mellem pincetspidserne (pilen), der opretholdes for at undgå at knuse vævene. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Overførsel af prøven til flydende nitrogen og løsrivelse af diskene. (A) Overførsel af diske (pil) til flydende nitrogen i et arbejdsbad. (B) Diske i flydende nitrogen (pil). (C)Pincet blev anbragt i flydende nitrogen for at afkøle dem i arbejdsbadet. (D, E) Afmontering af kobberdisketterne (pile) ved hjælp af pincet. (F) Overførsel af disken (pilen) til glasglasset med pincet. (G) Opvarmning af pincet i vand til frysning af den næste prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Prøveopvarmning og indlejring. (A) Prøver i glasglasglas ved stuetemperatur. (B) Overførsel af diske (pil) til et 2 mL plastrør med pincet. (C) Kobberskiver (pil) i acetone i et plastikrør. (D) Måling af harpikser med et injektionsrør (pil). (E) Overførsel af harpiksen til en engangskop (pil). (F) Blanding af harpiks ved hjælp af en omrører. (G) En lille mængde harpiks blev placeret i hullerne i silikoneindlejringsformen. (H) Overskydende harpiks i gitrene blev fjernet med filterpapir. (I, J) Kobberskiver med prøver blev placeret i bunden af hullerne i indlejringsformen med prøvesiden op. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Trimning af prøveblokken. (A) Udtagning af polymeriserede blokke fra indlejringsformene. (B) Prøvenummeret blev skrevet på blokken. (C, D) Kobberskiven blev fjernet fra blokken med en barbermaskine. Skalastang til (D) = 1 mm. (E-G) Prøven blev trimmet med et ultralydsskæreblad og et barberblad. Skalastang for (G) = 1 mm. (H) Høj forstørrelse af (G). Et individuelt lyspunkt er en celle. Celler blev integreret i et enkelt lag10. Vægtstang = 10 μm. (I-K) Overfladen af blokken blev skåret glat med en diamanttrimningskniv. Skalalinje for (K) = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Opskæring af ultratynde sektioner. (A) Prøveblokken er fjernet fra mikrotomet31. (B, C) Prøven blev yderligere trimmet med et barberblad. Skalastang for (C) = 0,5 mm. (D) Neopren blev anvendt på gitre for at få dem til at holde fast. (E) Ultramicrotomet var dækket af plast for at undgå luftstrøm under ultratyndsnit. Diamantknivbåden var fyldt med vand. (G, H) Ultratynde sektioner blev skåret til en tykkelse på 70 nm. Skalastang for (H) = 1 mm. (I, J) Sektionerne blev hentet ved hjælp af en løkke og derefter tørret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Farvningssektioner. (A) Gitrene blev placeret i rillen på det halve silikonerør. (B) De blev gennemblødt i uranylacetat til farvning. (C) Det anvendte uranylacetat blev indsamlet på selvlukkende voksagtig film. (D) Gitsterne blev vasket med en vandstråle og (E) derefter gennemblødt i blycitrat. (F) Plasmapolymeriseret naphthalenfilm blev flød på vand og (G) anvendes til at dække et gitter, der er anbragt på 4 mm x 4 mm filterpapir. (H) Gitteret blev anbragt i en prøveholder og (I) observeret i et elektronmikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: Ultratynde dele af Escherichia coli (bakterier, A, B) og Saccharomyces cerevisiae (gær, C). (A) Bemærk at prøverne er indlejret tæt og homogent og ikke viser nogen deformation. (B, C) Membranstrukturer viser klar og glat morfologi, og ribosomer er klare nok til, at hver partikel kan opregnes16. (C) Gærkernen og vakuolerne viser en sand cirkelform, som kan være deres naturlige morfologi. Mitokondrierens matrix viser et elektrontæt udseende, som kan være karakteristisk for levende celler, der er fastgjort ved hurtig frysning. Skalastænger = 1 μm. Forkortelser: CW = cellevæg; ER = endoplasmisk reticulum; NM = atommembran; NP = nukleare porer; OM = ydre membran; PM = plasmamembraner; R = ribosomer; N = kerne; M = mitokondrier. (B) gengives fra Yamada et al.16 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: Ultratynde afsnit. (A-C) K562 kultiverede celler. (D) En isoleret mastcelle fra musen. (A) Bemærk at prøverne er indlejret tæt og homogent og ikke viser nogen deformation. Skalastang = 20 μm. (B-D) Ved høj forstørrelse observeres kerne, nukleolus, atommembran, kerne porer, endoplasmisk reticulum, mitokondrier, ribosomer og granulater tydeligt. Skalastænger = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Forkortelser: N = kerne; Nu = nucleolus; NM = nuklear membran, NP = kerneporer; ER = endoplasmisk reticulum; M = mitokondrier; R = ribosomer; G = granulater; D = opdeling af celler. (A) gengives fra Yamaguchi et al.1 med tilladelse. (B-D) gengives fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14: Ultratynde afsnit. (A-E) Bemærk, at vævs- og cellebilleder er klare og naturlige og viser god kontrast, selvom sektionerne er meget tynde (50 nm). Mitokondrierens matrix viser et tæt udseende, som ligner det, der gælder for tætte mitokondriematricer af hurtigt frosne levende celler (D). Skalastænger = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Forkortelser: D = desmosomes; ER = endoplasmisk reticulum; K = keratinocyte; KF = keratinfibre; M = mitokondrier; N = kerne; NM = atommembran; P = blodplade; R = ribosomer; W = hvide blodlegemer. Gengivet fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 15
Figur 15: Hepatitis B-virus (HBV) kernepartikler, der hurtigt fryses med flydende ethan ved hjælp af sandwichfrysningsanordningen og observeres ved kryoelektronmikroskopi. Sfæriske hule partikler er HBV kernepartikler. Skalalinje = 100 nm. Forkortelser: HBV = hepatitis B-virus; I = is. Gengivet fra Yamaguchi et al.28 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Følgende diskussion er baseret på mere end 120 sandwich fryse-fryse substitution eksperimenter på mere end 1.000 prøver og mere end 70 springet-frysning-cryo-elektron mikroskopi eksperimenter på mere end 75 prøver udført over 36 år.

Succesrate for god frysning ved sandwich frysning
Succesraten for at opnå god frysning afhænger af prøverne. Saccharomyces cerevisiae (gær) celler dyrkes i YPD medium (1% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% dextrose) gav næsten 100% succes for god frysning uden iskrystal dannelse10,11,15,35,36. Andre gærarter, herunder Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57og Trichosporon viste også god frysning. Bakterier, herunder Mycobacterium58,59 og E. coli16, viste også god frysning. Dyrkede celler og isolerede dyreceller viste god frysning for både levende og glutaraldehydfaste celler1,25,26,27,60. Glutaraldehydfaste dyre- og humane væv skåret til 0,1 til 0,2 mm tykkelse viste også god frysning det meste af tiden1,28.

Betingelser for god frysning
Brug kun celler i det relevante vækststadium og tilstand. Celler i kultur bør være i den eksponentielle fase. Påfør meget små mængder celleops suspensioner af koncentrerede prøver (for S. cerevisiae, ~0,02 μL på 3-5 × 109 celler/mL) på kobberskiven. Glutaraldehydfaste skiver af animalsk eller humant væv skal også være meget små (helst 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Da det er svært at skære 0,1 mm tykke vævsskiver, skal du skære mange væv i skiver og vælge tynde og halvgennemsigtige skiver. Arbejd hurtigt, men omhyggeligt, og lad ikke prøverne tørre ud. Når du samler de stablede kobberskiver op med pincet, skal du ikke trykke for hårdt på diskene for at undgå at knuse celler og væv. Prøvebelastning er det vigtigste skridt for vellykket frysning, og de nødvendige betingelser er de samme som betingelserne for god frysning til højtryksfrysning. Læsere bør henvise til den fremragende anmeldelse af McDonald61.

Andre programmer
Dette papir præsenterer elektron mikrografer af en bakterie, gær, kultiverede celler, isolerede dyreceller, humane væv, og viruspartikler. Vi observerede god frysning af glutaraldehyd-faste marine alger. Imidlertid blev cellestrukturerne i levende ferskvandsgrønalger ødelagt af iskrystalformation. Blanding af celler med 20% kvæg serum albumin (BSA) sikrede, at ultrastrukturen var velbevaret uden iskrystalskader. Brugen af 20% BSA var også gavnlig for at bevare ultrastrukturen af stilkeceller i en svamp. Forsøg med frysning af planteceller og væv ved at anvende 20% BSA er i gang. Selv om scanning elektronmikroskopi af sandwich fryse-fryse-erstattede prøver ikke er blevet forsøgt, observation af velbevarede cellestrukturer er blevet rapporteret tidligere9.

Bemærkninger om sandwichfrysningsmetoden
Den tæt-til-indfødte ultrastruktur af celler observeres bedst ved hurtig frysning og frysesubstitution af levende celler. Iskrystalformation med SFD kan undgås ved at begrænse cellernes tykkelse til ≤30 μm1. Fastsættelse væv med glutaraldehyd ofte giver bedre bevarelse af cellestrukturen til observation suspension-dyrkede celler, fordi glutaraldehyd fiksering gør cellestrukturen mere stiv og forhindrer de mulige ultrastrukturelle ændringer under indsamling og centrifugering af levende celler1. Glutaraldehydfiksering gør det også muligt at forlænge frysedybden til helt op til 0,2 mm 1 ,svarendetil den, der opnås ved højtryksfrysningsmetoden (HPF). Derfor kan HPF-maskinen udskiftes med SFD til dybfrysning af dyre- og humane væv.

Fordi glutaraldehyd-faste væv kan opbevares i mere end 2 år28, sandwich frysning kan udføres i henhold til brugerens bekvemmelighed. Fastsættelse væv med glutaraldehyd letter også vævssektion, fordi vævene bliver mere stive med fiksering. I modsætning til HPF-maskinen kan SFD bruges til hurtig frysning af vira til kryo-elektronmikroskopi og til bakterier og eukaryote celler. Sammenlignet med HPF-maskinen er SFD desuden lille, bærbar, billigere og kan erhverves af flere laboratorier. Vi håber, at disse funktioner i SFD hjælpe flere laboratorier nå deres forskning mål28.

Funktioner af cellernes naturlige morfologi
Cellestrukturerne er i deres naturlige tilstand , hvis de viser følgende udseende: Membranstrukturer i den ydre membran (Figur 12A, B), plasmamembran ( Figur12B,C; Figur 13A-D; og figur 14E), nuklear kuvert (figur 12C, figur 13B-Dog figur 14D-E), mitokondrier ( figur12C, figur 13Cog figur 14D) og vakuoler ( Figur12C) udviser glatte konturer. Kernen og vakuolerne er næsten cirkulære (Figur 12C). Ribosomer viser et klart elektrontæt udseende med en diameter på ~ 20 nm (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D). Cytoplasmaet er elektron lucent (figur 12B, C; Figur 13C; og figur 14D).

Effekt af glutaraldehydfiksering på cellemorfologi
Glutaraldehyd fiksering blev udført for animalske eller menneskelige væv før sandwich frysning for at opnå i-krystal-fri ultrastruktur. De mikrografer, der opnås ved denne metode, viser udsøgt klare billeder svarende til dem, der opnås ved hurtig frysning af levende væv (Figur 14)1. Undersøgelserne af gærceller, dybhavsmikroorganismer og kultiverede celler viser, at deformationen af ultrastruktur hovedsagelig skyldes osmium tetroxidfiksering og dehydrering ved ethanol ved stuetemperatur1,17,18,28. Small rapporterede også, at selv om glutaraldehyd fiksering ikke ødelægger organiseringen af actin i dyrkede fibroblaster, osmium tetroxid fiksering og dehydrering af acetone eller ethanol ved stuetemperatur ødelægge actin organisation62.

Derfor bør der udføres en detaljeret undersøgelse af virkningerne af glutaraldehydfiksering på cellemorfologi. Ohno udviklet en in vivo kryofixation metode, hvori levende væv er hurtigt frosset uden at stoppe blodforsyningen63. Vævene blev fryse-erstattet og indlejret i epoxyharpiks, og ultratynde sektioner blev observeret. De mikroskopiske elektronbilleder viste den nærmeste-til-indfødte ultrastruktur af levende væv sammenlignet med dem, der opnås ved kemisk fiksering-konventionel dehydrering og ved hurtig frysning af frisk ufikset væv. Derfor kan det være interessant at sammenligne den ultrastruktur, der opnås ved glutaraldehydfikseringsfrysningssubstitution (den nuværende metode) og ved in vivo kryofixation-frysesubstitution for at undersøge virkningerne af glutaraldehydfiksering.

Hensyntagen til miljøet og øget eksperimentel effektivitet
Vi bruger 2 ML plastrør til udskiftning af harpiksen. En mL fortyndet harpiks er nok til hvert substitutionstrin. De brugte plastrør kan kasseres efter hvert forsøg. Dette kan spare tid og kræfter til vask glas hætteglas, når de bruges til harpiks substitution. Derudover kan uranylacetatopløsning bruges gentagne gange til sektionsfarvning32. Efter farvning af sektionerne kan uranylacetatopløsningen gemmes og genbruges. Da uranylacetat er et radioaktivt stof, hjælper genbrugen med at undgå generering af affald og bidrager til miljøbeskyttelse.

Plasma-polymeriseret naphthalenfilm
Plasma-polymeriseret naphthalen film er en tre-dimensionelt polymeriseret carbon film fremstillet af naphthalengas ved plasma-polymerisering under glød udledning33. Filmen er modstandsdygtig mod elektronbombardement og kemikalier, meget ren, gennemsigtig mod elektroner og har en flad overflade og amorf struktur. Således er den plasmapolymeriserede naphthalenfilm, som er kommercielt tilgængelig, fremragende og anbefales som en støttefilm.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials - Scintillation counter vials for fixative
Acetone -
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Slide glass -
Double-sided adhesive tape -
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Several pairs
Tweezers with polystyrene foam - One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen -
Propane gas - Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette - For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container - 50 mL and 200 mL
Ethane gas - Cryogen
2 mL Eppendorf tubes - For embedding
Disposable plastic syringes - 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer -
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater - For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Super Support Film Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo 647
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, In Japanese 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

Tags

Biologi Udgave 173 Elektronmikroskopi frysesubstitution glutaraldehydfast væv højtryksfrysning is-indlejring levende celler dykfrysning hurtig frysning prøveforberedelse sandwichfrysningsanordning ultrastruktur ultratynde sektioner
Hurtig frysning ved hjælp af Sandwich Frysning Device for god ultrastrukturel bevarelse af biologiske prøver i ElektronMikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi,… More

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter