Summary
Här visar vi hur man använder sandwichfrysningsanordningen för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Vi visar också hur man förbereder prover för ultrathinsektionering efter snabb frysning.
Abstract
Kemisk fixering har använts för att observera ultrastrukturen i celler och vävnader. Denna metod bevarar dock inte cellernas ultrastruktur på ett tillfredsställande sätt. artefakter och extraktion av cellinnehåll observeras vanligtvis. Snabb frysning är ett bättre alternativ för bevarande av cellstruktur. Sandwichfrysning av levande jäst eller bakterier följt av frysersättning har använts för att observera cellernas utsökta naturliga ultrastruktur. Nyligen har smörgåsfrysning av glutaraldehyd-fasta odlade celler eller mänskliga vävnader också använts för att avslöja ultrastrukturen i celler och vävnader.
Dessa studier har hittills utförts med en handgjord sandwichfrysanordning, och ansökningarna till studier i andra laboratorier har begränsats. En ny sandwichfrysningsanordning har nyligen tillverkats och är nu kommersiellt tillgänglig. Det aktuella dokumentet visar hur man använder sandwichfrysningsanordningen för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Också visas beredningen av exemplar för ultrathin sektionering efter snabb frysning och förfaranden för frysersättning, harts inbäddning, trimning av block, skärning av ultrathin sektioner, återvinning av sektioner, färgning och täckning av galler med stödfilmer.
Introduction
Elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att studera cell ultrastruktur. Kemisk fixering med konventionella uttorkning förfaranden har använts för att observera ultrastructure av celler och vävnader. Denna metod bevarar dock inte cellernas ultrastruktur på ett tillfredsställande sätt, och artefakter och extraktion av cellinnehåll observeras vanligtvis. Snabb frysning och frysersättning av celler och vävnader är bättre alternativ för bevarande av cellstruktur.
Tre huvudmetoder har använts för frysning av celler snabbt1:1) doppfrysning utförs genom att kasta exemplar i en kyld kryogen, såsom propan, och användes sedan början av 1950-talet2; 2) Frysning av kalla metallblock utförs genom att snabbt slå celler och vävnader på ett metallblock som kyls med flytande kväve eller flytande helium3,4; och 3) högtrycksfrysning görs genom frysning av celler och vävnader med flytande kväve under högt tryck5,6,7.
Sandwichfrysning är en typ av doppfrysning som utförs genom att smöra tunna biologiska material mellan två kopparskivor och snabbt frysa dem genom att kasta sig i flytande propan8,9,10. I denna metod kyls mycket tunna exemplar (några mikrometer tjocka) snabbt med kryogen med en metall som har god värmeledningsförmåga från båda sidor. Således tar denna metod effektivt bort värme från proverna, vilket gör det möjligt att stabilt frysa celler utan iskristallskador. Sandwichfrysning, följt av frysersättning av levande jäst och bakterieceller, avslöjar den naturliga ultrastrukturen i cellerna10,11,12,13,14,15,16.
Nyligen har denna metod visat sig vara användbar för att bevara tydliga cellbilder av glutaraldehyd-fasta mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, odlade celler25,26,27och mänskliga celler och vävnader1,28 . Även om dessa studier har utförts med hjälp av en handgjord sandwichfrysanordning29, och ansökningarna till andra studier i andra laboratorier har begränsats, har en ny sandwichfrysanordning (SFD) tillverkats28 och är nu kommersiellt tillgänglig.
Det aktuella dokumentet visar hur man använder SFD för snabb frysning av biologiska exemplar, inklusive bakterier, jäst, odlade celler, isolerade celler, djur- och mänskliga vävnader och virus. Också visas beredningen av exemplar för ultrathin sektionering efter snabb frysning, liksom förfaranden för frysersättning, harts inbäddning, trimning av block, skärning av ultrathin sektioner, återvinning av sektioner, färgning och täckning av galler med stödfilmer.
Protocol
OBS: Studiens protokoll för humanprover godkändes av Biomedical Research Ethics Committee vid Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmium tetroxid är en farlig kemikalie; Den ska hanteras med handskar i rökhuven. Bild 1 visar sandwichfrysningsanordningen och de nödvändiga verktygen28. Figur 2 visar de material som krävs för att utföra sandwichfrysningsexperiment. Glasflaskor fylls med aceton som innehåller osmiumtetroxid och hålls vid -80 °C fram till användning (figur 2B). Kopparskivor är 3 mm i diameter, utan hål, har en bokstav på ena sidan och är kommersiellt tillgängliga(figur 2C).
1. Snabb frysning av cellavstängningar för frysersättning
OBS: Hela proceduren visas i figur 3.
- Celler
- Använd cell suspensioner av bakterier, jäst (figur 2A), odlade celler och isolerade celler för sandwichfrysning.
OBS: Både levande och glutaraldehyd-fasta celler kan användas28.
- Använd cell suspensioner av bakterier, jäst (figur 2A), odlade celler och isolerade celler för sandwichfrysning.
- Beredning av flytande propan
OBS: Använd kryoglovener och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve. Eftersom propan är explosiv bör man se till att inte använda bränder i samma rum och fönster bör hållas öppna.- Fyll SFD:s flytande kvävebehållare med flytande kväve(figur 4A). Fyll vätskepropanbehållaren med flytande propan genom att föra in propangas med ett fint munstycke(figur 4B,C). Påskynda stelningen av propan med hjälp av en kyld metallstång(figur 1 och figur 4D,E).
- Beredning av kopparskivor
- Placera kopparskivor på ett bildglas med bokstavssidan uppåt (figur 2D) och behandla med glödurladdning vid 10 Pa, 400 volt, 1 mA för 30 s (figur 4F,G) för att göra diskytan hydrofil med hjälp av en jonsputterapparat30.
- Sandwiching och doppfrysning av cellupphängningen
- Överför cellfjädringen till ett 2 ml centrifugrör(figur 5A)och centrifugera vid 2 900 × g i 10 s vid rumstemperatur(figur 5B,C). Ta bort supernatanten och suspendera pelleten för att få en tjock suspension (se diskussion).
- Placera en liten mängd av cellupphängningen (~0,02 μL) på en kopparskiva (figur 5D-F), täck den med en annan kopparskiva (figur 5G) och plocka upp skivorna med pincett(figur 5H).
OBS: Observera 0,1 μL droppar av suspensionen under stereomikroskopet för att mäta ~0,02 μL av cellupphängningen och dela upp dem i droppar som är 1/5av denna volym. - Gör en brunn i mitten av den fasta propanen med den tunna metallstången (figur 5I). Ställ pincetterna i en SFD och frys dem snabbt genom att trycka på apparatens injektionsknapp (figur 5J, K).
OBS: Var försiktig så att du inte torkar proverna och inte lägger de två skivorna helt över varandra (annars skulle det bli mycket svårt att lossa dem i nästa steg).
- Sandwiching och doppfrysning av djur- och människovävnader
- Använd vävnader från djur och människa (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) fixerade i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4)(figur 6A,B). Skär dem i 0,1 till 0,2 mm tjocka sektioner med ett rakblad under ett stereomikroscope(figur 6C, D).
- Placera en liten droppe glutaraldehydlösning (~0,02 μL) på en kopparskiva(figur 6E, F). Använd sedan pincett för att placera en bit vävnad i glutaraldehyden på kopparskivan (figur 6G, H) och täck den med en annan kopparskiva ( figur6I-K).
- Frys snabbt skivorna med vävnaderna i SFD:s smältande propan enligt beskrivningen i avsnitt 1.4 (figur 5J,K).
OBS: Eftersom glutaraldehyd är en farlig kemikalie bör den hanteras med handskar i rökhuven. Vävnader bör inte tvättas med buffertar när de placeras på en kopparskiva utan hållas blöta i glutaraldehydlösning eftersom glutaraldehyd har en frysskyddseffekt1.
- Använd vävnader från djur och människa (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) fixerade i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4)(figur 6A,B). Skär dem i 0,1 till 0,2 mm tjocka sektioner med ett rakblad under ett stereomikroscope(figur 6C, D).
- Frysersättning med osmiumacetton
- Överför skivorna till flytande kväve i ett arbetsbad (figur 7A,B). Använd ett par pincett som kyls i flytande kväve och ta bort skivorna från varandra för att exponera provet (figur 7C-E).
- Placera skivorna med cellerna i en glasflaska (figur 7F) som är fylld med 1 ml aceton som innehåller 2% osmium tetroxid(figur 2B) som har placerats i flytande kväve och stelnat (figur 4H).
- Överför skivorna till en frys och förvara dem vid -80 °C i 2-4 dagar för frysersättning av cellerna (figur 3). Blötlägg de använda pincetterna i vatten vid rumstemperatur för att värma dem (figur 7G) för frysning av följande exemplar.
OBS: Pincett för hantering av provet bör vara varma (rumstemperatur) eftersom kalla pincett kan frysa provet före snabb frysning, vilket leder till bildandet av iskristaller.
- Provuppvärmning och inbäddning
- För gradvis proverna till rumstemperatur (2 h vid -20 °C, 2 h vid 4°C och 15 min vid rumstemperatur, figur 3 och figur 8A),och överför skivorna till 2 mL plaströr som är fyllda med 1 ml aceton(figur 3 och figur 8B,C).
- Förbered epoxiharts genom att blanda reagenserna i en engångsplastbehållare med hjälp av en omrörare (figur 8D-F).
- Byt aceton i steg 1,7,1 successivt med 30% harts (i aceton), 60% harts och 90% harts vid rumstemperatur i 1 h vardera. Byt sedan ut 90% harts med 100% harts vid 37 °C över natten. Slutligen bädda in proverna i 100% harts (figur 8G-J) i kiselinbäddningsformen och polymerisera dem vid 60 °C i 24 timmar (figur 3).
OBS: Proverna ska vara fästa på kopparskivorna under hela proceduren (för att underlätta sektionering). Användning av en roterande eller skakapparat rekommenderas inte under inbäddningsprocessen eftersom de bidrar lite till penetreringen av hartset i cellen. Dessutom orsakar vibrationen från apparaten ibland att proverna lossnar från kopparskivorna. Inkubation vid 37 °C över natten skulle påskynda penetreringen av hartset i cellen på grund av termisk energi (hartset skulle inte polymerisera eftersom det inte innehåller någon accelerator).
- Trimning av provblock
- Ta ut de polymeriserade blocken från kiselinbäddningsformarna (figur 9A). Skriv provnumret på blocket (bild 9B).
- Ta bort kopparskivorna från blocket med ett rakblad(figur 9C,D) och trimma proverna som är inbäddade på blockytan till 0,7 mm x 0,7 mm med hjälp av ett ultraljuds trimblad(figur 9E) och rakblad(figur 9F-H) under ett stereomikroscope31.
- Sätt blocket i en provhållare på en ultramicrotom(figur 9I) och skär blockets yta smidigt med en diamanttrimmerkniv(figur 9J,K).
- Kapa ultrathin sektioner
- Ta bort blocket från ultramicrotom(figur 10A)31, ställ in det i ett stereomikroscope och trimma det ytterligare till 0,2 mm x 0,3 mm med ett rakblad(figur 10B, C).
- Applicera neopren på gallret för att göra dem självhäftande (figur 10D). Sätt tillbaka blocket på ultramicrotom, täck ultramicrotomet med ett plasthölje (figur 10E)31och skär 50-70 nm tjocka sektioner (figur 10F-H).
- Hämta sektionerna med hjälp av en slinga (figur 10I), montera dem på 300 eller 400 kopparnät med maskor som behandlats med neopren och torka dem (figur 10J).
- Färgning av sektioner och observation under elektronmikroskopet
- Ställ gallren med sektioner i spåret på det halva silikonröret (figur 11A)31, och blötlägg i uranylacetatlösning och blycitrat i 3 minuter vardera för färgning (figur 11B-E)32.
- För jäst- och svampprover, placera gallret på ett filterpapper (4 mm x 4 mm), plocka upp dem med pincett och täck dem med plasmapolymeriserad naftalenfilm33 på vattenytan(figur 11F, G). Sätt in gallret i ett elektronmikroskop och observera vid 100 kV (figur 11H, I).
2. Snabb frysning av virus och makromolekyler
- Beredning av flytande etan
OBS: Använd kryoglovener och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve. Eftersom etan är explosiv bör man se till att inte använda bränder i samma rum och fönstren ska hållas öppna. Etan används eftersom den avdunstar i elektronmikroskopet medan propan inte gör det.- Fyll SFD:s flytande kvävebehållare med flytande kväve. Fyll den flytande etanbehållaren med flytande etan genom att föra etangas genom ett fint munstycke.
- Beredning och snabb frysning av mikronät och prover
- Gör mikronätens båda ansikten hydrofila genom att behandla dem med glödurladdning (10 Pa, 400 V, 1 mA) med hjälp av en jonsputterapparat30.
- Ställ in mikronätet i SFD och applicera 2 μL av viruset eller makromolekylär suspension (1 mg protein/ml) på mikronäten. Ta bort överflödig vätska med filterpapper och frys snabbt mikronätet genom att trycka på apparatens injektionsknapp.
- Inställning av det frusna mikronätet i en kryoöverföringshållare och observation under elektronmikroskopet
- Överför de frysta mikronäten i flytande kväve, sätt i en kryoöverföringshållare som kyls vid flytande kvävetemperatur i förväg och observera under ett elektronmikroskop vid låg temperatur34.
Representative Results
Levande celler av mikroorganismer i suspension samlades in genom centrifugering, inklämda mellan två kopparskivor, snabbt frysta med SFD, frysersättning, inbäddade i epoxiharts, ultrathin-sektionerade, färgade och observerade under ett elektronmikroskop genom att följa de förfaranden som beskrivs ovan. Figur 12 visar ultrathin delar av Escherichia coli (bakterier, figur 12A,B)16 och Saccharomyces cerevisiae (jäst, figur 12C)15. Observera att bilderna är mycket tydliga och visar naturlig morfologi.
Glutaraldehyd-fasta cell suspensioner av odlade celler och isolerade djurceller samlades in och frystes snabbt med SFD, frys-ersätter och observerades under ett elektronmikroskop genom att följa de förfaranden som beskrivs ovan. Figur 13 visar ultrathin sektioner av odlade celler (figur 13A-C)1,28 och isolerade celler från musens bukhåla ( figur13D)28. Figur 14 visar ultrathin delar av mänsklig hud (figur 14A-D) och buffy coat ( figur14E)1. Observera att bilderna också är mycket tydliga och visar naturlig morfologi. Figur 15 visar hepatit B-viruskärnpartiklar som snabbt fryses med SFD och observeras av kryoelektronmikroskopi34. Liksom med de andra cellerna är bilderna mycket tydliga och visar naturlig morfologi.
Bild 1: Sandwich frysanordning28 och nödvändiga verktyg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Material som är nödvändigaför att utföra experiment med sandwichfrysning. Skalstång = 10 μm. (B) Glasflaskor (10 ml) som innehåller 1 ml aceton med 2% osmium tetroxid. C)Kopparskivor som visar en yta utan bokstav (vänster) och en yta med en bokstav (höger). Skalstång = 3 mm. Scanning elektronmikroskopi. (D) Kopparskivor utan bokstavssidan upp placerades på en glasrutschbana med dubbelhäftande tejp (*). Skalstång = 3 mm. (E) En dubbelkantad rakhyvel och en trasig dubbelkantad rakhyvel för skivning av djur- och mänskliga vävnader, en enkelkantad rakhyvel för trimning av block och strimlad bräda för skivning av djur- och mänskliga vävnader. ( F) Pincett med extruderat polystyrenskum för att skydda fingrarna från kylan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3:Provberedning av cellupphängningar med sandwichfrysningsmetoden. Förkortningar: r.t. = rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Beredning av flytande propan, kopparskivor och fixativ. (A) Flytande kväve (pil) hälldes i den flytande kvävebehållaren i sandwichfrysningsanordningens flytande kvävebehållare. (B) Propangas fördes in i en flytande propanbehållare genom ett fint munstycke. C)Flytande propan (pil). ( D) En metallstång (pil) användes för att kyla flytande propan för att påskynda stelningen av flytande propan. e)Stelnad propan (pil). (F) Jon sputterapparat (pil) för att göra kopparskivor hydrofila med glödurladdning. g)Glödurladdning. h)Glasflaskor placerade i flytande kväve i ett arbetsbad. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Snabb frysning av cellfjädring (jäst) med hjälp av sandwichfrysningsanordningen. b)Mikrocentrifuge. C)Pellet av Sackaromyces cerevisiae i centrifugröret (pil). d)Överföring av provexemplaret med en mikropipett från centrifugröret. (E)Placera provexemplaret på kopparskivan. f)En liten droppe prov på kopparskivan (pil). g)Täcker provexemplaret med en annan kopparskiva. (H) Plocka upp de två skivorna med pincett. (I) Göra en brunn i den fasta propanen med hjälp av den tunna metallstången. ( J)Doppfrysning av provet genom att trycka på injektionsknappen. (K)Frysningen är klar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Förbereda ett prov av mänskliga vävnader (hud). (A, B) Mänsklig hudvävnad fixerad i glutaraldehyd i en Petriskål. Skalstång = 5 mm. (C, D) Vävnader (pil) skars med två dubbeleggade rakhyvlar på ett strimlat bräde. (E, F) En liten droppe glutaraldehydlösning (pil) placerades på en kopparskiva. (G, H) En bit hudvävnad placerades på kopparskivan med pincett. (I) En annan skiva användes för att täcka kopparskivan med hudvävnaden. J)De inklämda skivorna plockades upp med pincett. ( K) De inklämda skivorna hölls försiktigt med pincett. Notera gapet mellan pincettspetsarna (pilen) som upprätthålls för att undvika att vävnaderna krossas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Överföra provexemplaret till flytande kväve och lossa skivorna. (B)Skivor i flytande kväve (pil). C)Pincett placerades i flytande kväve för att kyla dem i arbetsbadet. (D, E) Lossa kopparskivorna (pilarna) med pincett. f)Överföra skivan (pilen) till glasflaskan med pincett. g)Uppvärmning av pincetterna i vatten för att frysa nästa prov. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Provuppvärmning och inbäddning. (B) Överföra skivorna (pilen) till ett 2 ml plaströr med pincett. (C) Kopparskivor (pil) i aceton i ett plaströr. ( D)Mäta hartser med ett injektionsrör (pil). (E)Överföra hartset till en engångsmugg (pil). f)Blanda hartset med en omrörare. ( G) En liten mängd harts placerades i hålen i silikoninbäddningsformen. (H) Överflödigt harts i gallret avlägsnades med filterpapper. (I, J) Kopparskivor med prover placerades i botten av hålen i inbäddningsformen med provsidan upp. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 9: Trimning av provblocket. (A) Ta ut polymeriserade block från inbäddningsformarna. b)Provnumret skrevs på blocket. (C, D) Kopparskivan togs bort från blocket med en rakhyvel. Skalstång för (D) = 1 mm. (E-G) Provet trimmades med ett ultraljudsskärblad och ett rakblad. Skalstång för (G) = 1 mm. (H) Hög förstoring av (G). En enskild ljuspunkt är en cell. Cellerna var inbäddade i ett enda lager10. Skalstång = 10 μm. (I-K) Blockets yta var slät med en diamanttrimmerkniv. Skalstreck för (K) = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 10: Kapning av ultrathinsektioner. (A) Provblocket avlägsnades från mikrotomen31. (B, C) Exemplaret trimmades ytterligare med ett rakblad. Skalstång för (C) = 0,5 mm. (D) Neopren applicerades på galler för att få dem att fastna. (E) Ultramicrotomen var täckt med plast för att undvika luftflöde under ultrathinsektion. F)Diamantknivbåten var fylld med vatten. (G, H) Ultrathin sektioner skärs till en tjocklek av 70 nm. Skalstång för (H) = 1 mm. (I, J) Sektionerna hämtades med hjälp av en slinga och torkades sedan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 11: Färgningssektionerna. (A) Gallorna placerades i spåret på det halva silikonröret. b)De dränktes i uranylacetat för färgning. (C) Det använda uranylacetatet samlades in på självförseglingsvaxig film. ( D) Gallren tvättades med en vattenstråle och (E) blötläggdes sedan i blycitrat. f)Plasmapolymeriserad naftalenfilm flöt på vatten och (G) användes för att täcka ett galler placerat på 4 mm x 4 mm filterpapper. h)Gallret placerades i en provhållare och (I) observerades i ett elektronmikroskop. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 12:Ultrathin delar av Escherichia coli (bakterier, A, B) och Saccharomyces cerevisiae (jäst, C). a) Observera att proverna är inbäddade tätt och homogent och inte uppvisar någon deformation. (B, C) Membranstrukturer visar tydlig och slät morfologi, och ribosomer är tillräckligt tydliga för att varje partikel kan räknas upp16. C)Jästkärna och vakuoler uppvisar en sann cirkelform, vilket kan vara deras naturliga morfologi. Mitokondriernas matris visar ett elektrontät utseende, vilket kan vara ett kännetecken för levande celler som fixeras genom snabb frysning. Skalstänger = 1 μm. Förkortningar: CW = cellvägg; ER = endoplasmiskt retikulum; NM = kärnmembran; NP = nukleära porer; OM = yttre membran; PM = plasmamembran; R = ribosomer; N = kärna; M = mitokondrier. b) återges från Yamada etal.16 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 13: Ultrathin sektioner. (A-C) K562 odlade celler. ( D) En isolerad mastcell från musen. a) Observera att proverna är inbäddade tätt och homogent och inte uppvisar någon deformation. Skalstång = 20 μm. (B-D) Vid hög förstoring observeras kärnan, nukleolerna, kärnmembranet, kärnporerna, endoplasmiskt retikulum, mitokondrier, ribosomer och granulat tydligt. Skalstänger = 2 μm (B, 500 nm (C), 2 μm (D). Förkortningar: N = nucleus; Nu = nukleas; NM = kärnmembran, NP = nukleära porer; ER = endoplasmiskt retikulum; M = mitokondrier; R = ribosomer; G = granulat; D = dela celler. A) återges från Yamaguchi etal.1 med tillstånd. (B-D) återges från Yamaguchi etal.28 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 14:Ultrathin sektioner. (A-D) mänsklig hud och (E) buffy coat. (A-E) Observera att vävnads- och cellbilder är tydliga och naturliga och visar god kontrast, även om sektionerna är mycket tunna (50 nm). Mitokondriernas matris visar ett tätt utseende, som liknar det hos täta mitokondriella matriser av snabbt frusna levande celler (D). Skalstänger = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Förkortningar: D = desmosomes; ER = endoplasmiskt retikulum; K = keratinocyt; KF = keratinfibrer; M = mitokondrier; N = kärna; NM = kärnmembran; P = trombocyt; R = ribosomer; W = vita blodkroppar. Reproducerad från Yamaguchi et al.28 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 15: Hbv-kärnpartiklar (Hepatit B) fryses snabbt med flytande etan med hjälp av sandwichfrysningsanordningen och observerades med kryoelektronmikroskopi. Sfäriska ihåliga partiklar är HBV-kärnpartiklar. Skalstreck = 100 nm. Förkortningar: HBV = hepatit B-virus; I = is. Reproducerad från Yamaguchi et al.28 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Följande diskussion bygger på mer än 120 sandwich frysfrysnings-substitutionsexperiment på mer än 1 000 prover och mer än 70 dykfrysningselektronmikroskopiexperiment på mer än 75 prover som utförts under 36 år.
Framgångsgrad för god frysning genom smörgåsfrysning
Graden av framgång för att uppnå god frysning beror på proverna. Saccharomyces cerevisiae (jäst) celler odlade i YPD medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% dextros) gav nästan 100% framgång för god frysning utan iskristallbildning10,11,15,35,36. Andra jästarter, inklusive Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57och Trichosporon, visade också god frysning. Bakterier, inklusive Mycobacterium58,59 och E. coli16,visade också god frysning. Odlade celler och isolerade djurceller visade god frysning för både levande och glutaraldehyd-fasta celler1,25,26,27,60. Glutaraldehyd-fasta djur- och mänskliga vävnader som skivats till 0,1 till 0,2 mm tjocklek visade också god frysning för det mesta1,28.
Förhållanden för god frysning
Använd endast celler i lämpligt tillväxtstadium och tillstånd. Celler i kulturen bör vara i den exponentiella fasen. Applicera mycket små mängder cellupphängningar av koncentrerade prover (för S. cerevisiae, ~0,02 μL 3-5 × 109 celler/ml) på kopparskivan. Glutaraldehyd-fixerade skivor av djur- eller människovävnader bör också vara mycket små (helst 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Eftersom det är svårt att skära 0,1 mm tjocka vävnadsskivor, skiva många vävnader och välj tunna och halvtransparenta skivor. Arbeta snabbt men försiktigt och låt inte proverna torka ut. När du plockar upp de staplade kopparskivorna med pincett, tryck inte på skivorna för hårt för att undvika att krossa cellerna och vävnaderna. Provbelastning är det viktigaste steget för framgångsrik frysning, och de förhållanden som krävs är desamma som förutsättningarna för god frysning för högtrycksfrysning. Läsare bör hänvisa till den utmärkta recensionen av McDonald61.
Andra applikationer
Detta dokument presenterar elektronmikrografer av en bakterie, jäst, odlade celler, isolerade djurceller, mänskliga vävnader och viruspartiklar. Vi observerade god frysning av glutaraldehyd-fasta marina alger. Cellstrukturerna hos levande sötvattengröna alger förstördes dock av iskristallbildning. Blandning av celler med 20% bovin serum albumin (BSA) säkerställde att ultrastructure var välbevarad utan is-kristall skador. Användningen av 20% BSA var också fördelaktigt för att bevara ultrastrukturen av stjälkceller av en svamp. Experiment med frysning av växtceller och vävnader genom att applicera 20% BSA pågår. Även om skanning av elektronmikroskopi av sandwich frysfrys-ersatta prover inte har försökts, har observation av välbevarade cellstrukturer rapporterats tidigare9.
Anteckningar om smörgåsfrysningsmetoden
Cellernas nära infödda ultrastruktur observeras bäst genom snabb frysning och frysersättning av levande celler. Iskristallbildning med SFD kan undvikas genom att begränsa cellernas tjocklek till ≤30 μm1. Fixering av vävnader med glutaraldehyd ger ofta bättre bevarande av cellstrukturen för observation av suspensionskulturerade celler eftersom glutaraldehydfixering gör cellstrukturen mer styv och förhindrar eventuella strukturella förändringar under insamling och centrifugering av levande celler1. Glutaraldehydfixering gör det också möjligt att förlänga frysdjupet till så mycket som 0,2 mm1, liknande det som uppnås med högtrycksfrysningsmetoden (HPF). Därför kan HPF-maskinen ersättas med SFD för djupfrysning av djur- och människovävnader.
Eftersom glutaraldehydfixerade vävnader kan lagras i mer än 2 år28kan smörgåsfrysning utföras enligt användarens bekvämlighet. Fixering av vävnader med glutaraldehyd underlättar också vävnadssektionering eftersom vävnaderna blir styvare med fixering. Till skillnad från HPF-maskinen kan SFD användas för snabb frysning av virus för kryoelektronmikroskopi och för bakterier och eukaryota celler. Jämfört med HPF-maskinen är SFD dessutom liten, bärbar, billigare och kan förvärvas av fler laboratorier. Vi hoppas att dessa funktioner i SFD hjälper fler laboratorier att uppnå sina forskningsmål28.
Egenskaper hos cellernas naturliga morfologi
Cellstrukturerna är i sitt naturliga tillstånd om de uppvisar följande utseende: Membranstrukturer i det yttre membranet (figur 12A, B),plasmamembran (figur 12B,C; Figur 13A-D; och figur 14E),kärnhölje (figur 12C,figur 13B-Doch figur 14D-E), mitokondrier(figur 12C,figur 13Coch figur 14D)och vakuoler(figur 12C)visar släta konturer. Kärnan och vakuolerna är nästan cirkulära (figur 12C). Ribosomer visar ett tydligt elektrontät utseende med en diameter på ~20 nm (figur 12B, C; Figur 13C. och figur 14D). Cytoplasman är elektron-lucent (figur 12B, C; Figur 13C. och figur 14D).
Effekten av glutaraldehydfixering på cellmorfologi
Glutaraldehyd fixering utfördes för djur eller mänskliga vävnader före smörgås frysning för att erhålla iskristallfria ultrastructure. De mikrografer som erhålls med denna metod visar utsökt tydliga bilder som liknar de som erhålls genom snabb frysning av levande vävnader (figur 14)1. Studierna på jästceller, djuphavsmikroorganismer och odlade celler visar att deformationen av ultrastruktur främst beror på osmium tetroxid fixering och uttorkning av etanol vid rumstemperatur1,17,18,28. Small rapporterade också att även om glutaraldehydfixering inte förstör organisationen av aktin i odlade fibroblaster, förstör osmium tetroxidfixering och uttorkning genom aceton eller etanol vid rumstemperatur aktinorganisation62.
Därför bör en detaljerad studie om effekterna av glutaraldehydfixering på cellmorfologi utföras. Ohno utvecklade en in vivo cryofixation metod där levande vävnader snabbt fryses utan att stoppa blodtillförseln63. Vävnaderna var frys-ersätter och inbäddas i epoxiharts, och ultrathin avsnitt observerades. Elektron mikroskopiska bilder visade närmast infödda ultrastructure av levande vävnader jämfört med de som erhållits genom kemisk fixering-konventionell uttorkning och genom snabb frysning av färska ofixerade vävnader. Därför kan det vara intressant att jämföra den ultrastruktur som erhålls genom glutaraldehyd fixering-frysning substitution (den nuvarande metoden) och de genom in vivo cryofixation-freeze substitution för att undersöka effekterna av glutaraldehyd fixering.
Hänsyn till miljön och ökad experimentell effektivitet
Vi använder 2 ml plaströr för att ersätta hartset. En ml utspädd harts är tillräckligt för varje substitutionssteg. De använda plaströren får kasseras efter varje experiment. Detta kan spara tid och ansträngning för tvättning av glasflaskor när de används för hartsersättning. Dessutom kan uranylacetatlösning användas upprepade gånger för sektionsfärgning32. Efter färgning av sektionerna kan uranylacetatlösningen sparas och återanvändas. Eftersom uranylacetat är ett radioaktivt ämne bidrar återanvändningen av den till att undvika generering av avfall och bidrar till att skydda miljön.
Plasmapolymeriserad naftalenfilm
Plasmapolymeriserad naftalenfilm är en tredimensionellt polymeriserad kolfilm tillverkad av naftalengas genom plasmapolymerisering under glödurladdning33. Filmen är motståndskraftig mot elektronbeskjutning och kemikalier, mycket ren, transparent mot elektroner och har en plan yta och amorf struktur. Således är den plasmapolymeriserade naftalenfilmen, som är kommersiellt tillgänglig, utmärkt och rekommenderas som stödfilm.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
| 10 mL glass vials | - | Scintillation counter vials for fixative | |
| Acetone | - | ||
| Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
| Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
| Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Slide glass | - | ||
| Double-sided adhesive tape | - | ||
| Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FAS-10 |
| Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FA-10 |
| Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
| Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Several pairs |
| Tweezers with polystyrene foam | - | One pair | |
| Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
| Liquid nitrogen | - | ||
| Propane gas | - | Cryogen | |
| Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
| Micropipette | - | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
| Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
| Disposable plastic container | - | 50 mL and 200 mL | |
| Ethane gas | - | Cryogen | |
| 2 mL Eppendorf tubes | - | For embedding | |
| Disposable plastic syringes | - | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
| Magnetic stirrer | - | ||
| Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
| Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
| Incubater | - | For 37 °C and 60 °C | |
| Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
| Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
| Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
| Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |
References
- Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
- Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
- Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
- Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
- McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
- Costello, M. J.
- Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
- Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
- Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
- Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
- Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
- Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
- Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
- Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
- Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
- Yamaguchi, M.
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
- Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
- Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
- Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
- Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
- Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
- Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
- Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
- Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
- Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
- Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
- Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
- Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
- Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
- Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
- Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
- Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
- Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
- Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
- Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
- Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
- Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
- Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
- Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
- Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).
