Summary
여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
화학 적 고정은 세포와 조직의 초구조를 관찰하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이 방법은 세포의 초구조를 적절히 보존하지 못한다; 유물 및 셀 내용물의 추출은 일반적으로 관찰됩니다. 급속 동결은 세포 구조의 보존을 위한 더 나은 대안입니다. 살아있는 효모 또는 박테리아의 샌드위치 동결은 동결 대체에 선행되어 세포의 절묘한 자연 초구조를 관찰하는 데 사용되어 왔다. 최근에는 글루타랄데히드-고정 배양 세포 또는 인간 조직의 샌드위치 동결도 세포 및 조직의 초구조를 드러내는 데 사용되어 왔다.
이러한 연구는 지금까지 수제 샌드위치 동결 장치로 수행되었으며 다른 실험실에서 의 연구에 대한 응용 프로그램이 제한되었습니다. 새로운 샌드위치 동결 장치는 최근에 제작되었으며 현재 상용화되었습니다. 본 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 급속동결, 수지 포함, 블록 트리밍, 초박형 섹션 절단, 섹션 복구, 스테인링 및 지지 필름으로 그리드의 덮개를 위한 신속한 동결 및 절차 후 초박형 단면에 대한 시편의 준비도 도시되어 있다.
Introduction
전자 현미경 검사는 세포 초구조를 연구하기위한 강력한 도구입니다. 종래의 탈수 절차로 화학적 고정은 세포와 조직의 초구조를 관찰하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 방법은 세포의 초구조를 적절히 보존하지 않으며, 유물및 세포 내용물의 추출은 일반적으로 관찰된다. 세포와 조직의 신속한 동결 및 동결 대체는 세포 구조의 보존을 위한 더 나은 대안입니다.
3가지 주요 방법은 급속하게 세포를 동결하기 위해 사용되어왔다 1: 1) 플런지 동결은 프로판과 같은 냉각 된 극저온물질로 표본을 급락시킴으로써 수행되고, 1950년대 초부터 사용되었다2; 2) 차가운 금속 블록 동결은 액체 질소 또는 액체 헬륨3,4로냉각 된 금속 블록에 세포 와 조직을 빠르게 슬래밍하여 수행됩니다. 및 3) 고압 동결은 고압5,6,7하에서액체 질소를 가진 세포 및 조직을 동결시킴으로써 수행된다.
샌드위치 동결은 두 개의 구리 디스크 사이에 얇은 생물학적 물질을 끼워 액체 프로판8,9,10으로급락하여 빠르게 동결하여 수행 되는 플런지 동결의 일종이다. 이 방법에서는 매우 얇은 시편(몇 마이크로미터 두께)이 양쪽에서 열전도율이 좋은 금속을 사용하여 극저온으로 빠르게 냉각됩니다. 따라서, 이 방법은 효과적으로 시편에서 열을 제거하여 얼음 결정 손상없이 세포를 안정적으로 동결할 수 있게 합니다. 샌드위치 동결, 살아있는 효모 및 세균 세포의 동결 대체에 이어, 세포10,11,12,13, 14,15,16의자연적인 초구조를 드러낸다.
최근에는 글루타랄데히드 고정 미생물17,18,19,20,21,22,23, 24,배양세포25,26,27,인간 세포 및 조직1,28의 명확한 세포 이미지를 보존하는 데 유용한 것으로밝혀졌습니다. . 이러한 연구는 수제 샌드위치 동결장치(29)를이용하여 수행되고 있으며, 다른 실험실에서 다른 연구에 대한 응용 프로그램이 제한되어 있지만, 새로운 샌드위치 동결 장치(SFD)가28을 조작하여 현재 상용화되었습니다.
본 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 SFD를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 급속동결 후 초박형 단면에 대한 시편의 준비뿐만 아니라 동결 대체, 수지 포함, 블록 트리밍, 초박형 섹션 절단, 섹션 복구, 얼룩 및 지지 필름으로 그리드 덮개를 위한 절차가 표시됩니다.
Protocol
참고: 인간 표본에 대한 연구 프로토콜은 치바 대학 의과 대학의 생물 의학 연구 윤리위원회 (3085)에 의해 승인되었습니다. 오스뮴 테트옥사이드는 위험한 화학 물질이다; 연기 후드에 장갑을 끼고 처리해야합니다. 도 1은 샌드위치 동결 장치와 필요한도구(28)를나타낸다. 도 2는 샌드위치 동결 실험을 수행하는 데 필요한 재료를 보여줍니다. 유리 바이알은 오스뮴 테트산화물을 함유한 아세톤으로 채워지고 사용전까지 -80°C로유지됩니다(그림 2B). 구리 디스크는 직경 3mm이며 구멍이 없고 한쪽에 문자가 있으며 시판됩니다(그림2C).
1. 동결 대체를 위한 세포 현탁액의 신속한 동결
참고: 전체 절차는 그림 3에표시됩니다.
- 셀
- 박테리아, 효모(그림2A),배양된 세포 및 샌드위치 동결을 위한 분리된 세포의 세포 현탁액을 사용한다.
참고: 살아있는 및 글루타랄데히드 고정 세포는모두 28을사용할 수 있다.
- 박테리아, 효모(그림2A),배양된 세포 및 샌드위치 동결을 위한 분리된 세포의 세포 현탁액을 사용한다.
- 액체 프로판 의 준비
참고: 액체 질소를 취급할 때 극저고와 고글을 사용합니다. 프로판이 폭발적이기 때문에 같은 방에서 화재를 사용하지 않도록주의해야하며 창문을 열어 두어야합니다.- SFD의 액체 질소 용기를 액체질소(도 4A)로채웁니다. 미세노즐(도4B,C)을이용하여 프로판 가스를 도입하여 액체 프로판 용기를 액체 프로판으로 채웁니다. 냉각된 금속막대(도 1 및 도 4D,E)를사용하여 프로판의 응고를 가속화합니다.
- 구리 디스크 준비
- 노레터 사이드업(그림 2D)이있는 슬라이드 글래스에 구리 디스크를 놓고 10Pa, 400볼트, 30s(도4F,G)의1mA에서 광발 배출으로 치료하여 이온 스퍼터장치(30)를이온 스퍼터 장치(30)를 이온 스퍼터 장치(30)를 이온 스퍼터 장치를 사용하여 디스크 표면 친성성으로 만루하게 한다.
- 셀 서스펜션의 샌드위치 및 플런지 동결
- 셀 서스펜션을 실온(그림 5B,C)에서 10s용 2,900g ×에서 2mL 원심분리기 튜브(도5A)및 원심분리기로 전송한다. 상체를 제거하고 펠릿을 일시 중단하여 두꺼운 서스펜션을 얻습니다(토론 참조).
- 구리 디스크(도5D-F)에소량의 셀 서스펜션(~0.02 μL)을 놓고 다른 구리 디스크(도 5G)로 덮고 핀셋(도5H)으로디스크를 선택합니다.
참고: 세포 현탁액의 ~0.02 μL을 측정하려면 스테레오 현미경으로 서스펜션의 0.1 μL 방울을 관찰하고 이 부피의 1/5번째 액적물으로 나눕니다. - 얇은 금속 막대(도 5I)와고체 프로판의 중심에 잘 합니다. 핀셋을 SFD에 설정하고 장치의 사출 버튼을 눌러 신속하게동결(도 5J,K).
참고 : 시편을 건조하지 않고 두 개의 디스크를 완전히 서로 위에 놓지 않도록주의해야합니다 (그렇지 않으면 다음 단계에서 분리하는 것이 매우 어려워집니다).
- 동물과 인간 조직의 샌드위치 와 급락 동결
- 동물 및 인간 조직(~0.5mm x 0.5 mm x 1.5 mm)을 2.5% 글루타랄데히드-0.1 M 인산염 버퍼(pH 7.4)로 고정한다(그림6A,B)를사용한다. 스테레오현미경(그림6C,D)아래면도날로 0.1~0.2mm 두께의 섹션으로 자른다.
- 구리 디스크에 글루타랄데히드 용액의 작은 방울(~0.02 μL)을 놓습니다(그림6E,F). 그런 다음 핀셋을 사용하여 구리디스크(도 6G,H)에글루타랄데히드에 조직의 조각을 배치하고 다른 구리 디스크(도6I-K)로덮습니다.
- 섹션 1.4(그림5J,K)에설명된 바와 같이 SFD의 용융 프로판에서 조직으로 디스크를 신속하게 동결한다.
참고 : 글루타랄데히드는 위험한 화학 물질이기 때문에 연기 후드에 장갑을 착용처리해야합니다. 조직은 구리 디스크에 놓을 때 완충제로 세척해서는 안되지만 글루타랄데히드에 글루타랄데히드 용액에 담그면 방지 효과1을가지고 있기 때문입니다.
- 동물 및 인간 조직(~0.5mm x 0.5 mm x 1.5 mm)을 2.5% 글루타랄데히드-0.1 M 인산염 버퍼(pH 7.4)로 고정한다(그림6A,B)를사용한다. 스테레오현미경(그림6C,D)아래면도날로 0.1~0.2mm 두께의 섹션으로 자른다.
- osmium 아세톤으로 동결 대체
- 작업 용목욕탕에서 디스크를 액체 질소로 옮겨(그림 7A,B). 액체 질소에서 냉각된 핀셋 쌍을 사용하여 디스크를 분리하여 시편(그림7C-E)을노출합니다.
- 액체 질소에 배치되고 고화된 2% 오스뮴 테트옥사이드(도2B)를함유한 아세톤의 1mL로 채워진 유리 바이알(도7F)에세포를 넣은 디스크를 놓습니다(도4H).
- 디스크를 딥 냉동고로 옮기고 세포의 동결 대체를 위해 2-4일 동안 -80°C로 유지한다(그림3). 사용 된 핀셋을 실온에서 물에 담그고 다음 표본의 동결을 위해(그림 7G)를데우십시오.
참고: 시편을 처리하기 위한 핀셋은 차가운 핀셋이 급속동결 전에 시편을 동결하여 얼음 결정의 형성으로 이어질 수 있기 때문에 따뜻해야 합니다(실온).
- 샘플 온난화 및 포함
- 점차적으로 실온(-20°C에서 2시간, 4°C에서 2시간, 실온에서 15분, 도 3 및 도 8A)으로디스크를 옮기고, 디스크를 아세톤의 1mL로 채워진 2mL 플라스틱 튜브로 옮겨냅니다(그림3 및 도 8B,C).
- 교반기(도8D-F)를사용하여 일회용 플라스틱 용기에 시약을 혼합하여 에폭시 수지준비.
- 아세톤을 1.7.1단계로 연속 적으로 교환하여 30%의 수지(아세톤), 60%의 수지, 실온에서 90%의 수지로 각각 1h로 교환한다. 그런 다음 90%의 수지와 100% 수지의 수지를 하룻밤 사이에 37°C로 교환합니다. 마지막으로, 시료를 실리콘 임베딩 몰드에 100% 수지(도8G-J)에포함시키고, 24시간 동안 60°C로 중합한다(도3).
참고: 시편은 전체 절차 전반에 걸쳐 구리 디스크에 부착된 상태로 유지되어야 합니다(단면을 쉽게 만들려면). 그들은 세포로 수지의 침투에 거의 기여하기 때문에 회전 또는 흔들림 장치의 사용은 포함 과정에서 권장되지 않습니다. 더욱이, 장치의 진동은 때때로 시편이 구리 디스크에서 분리되는 원인이 됩니다. 하룻밤 사이에 37°C의 배양은 열 에너지로 인해 수지내의 침투를 가속화할 것입니다(수지는 가속기를 포함하지 않기 때문에 중합되지 않음).
- 표본 블록 트리밍
- 실리콘 포함금형(도 9A)에서중합된 블록을 꺼내십시오. 블록에 표본 번호를 적어 둡니다(도9B).
- 면도날(도9C,D)으로블록에서 구리 디스크를 제거하고 초음파 트리밍 블레이드(그림 9E)와 면도날(그림9F-H)을스테레오마이크로코프(31)로 사용하여 블록 표면에 내장된 표본을 0.7mm x 0.7mm로 다듬는다.
- 울트라 마이크로토메(그림9I)의표본 홀더에 블록을 설정하고 다이아몬드 트리밍 나이프로 블록의 얼굴을 매끄럽게 자른다(도9J,K).
- 초박형 섹션 절단
- 초미세토메(도10A)31에서블록을 제거하고, 스테레오마이크로코프로 설정하고, 면도날로 0.2mm x 0.3mm로 더 다듬는다(도10B,C).
- 그리드에 네오프렌을 적용하여접착제(그림 10D)를만듭니다. 초미세토메에 블록을 다시 설정하고, 플라스틱커버(도 10E)31로초미세토메를 덮고, 50-70-nm 두께의 단면을 잘라낸다(도10F-H).
- 루프(그림 10I)를사용하여 섹션을 검색하여 네오프렌으로 처리된 300 또는 400메쉬 구리 그리드에 장착하고 건조시(도10J).
- 전자 현미경의 밑에 단면도 및 관측의 염색
- 반 실리콘 튜브(도 11A)31의홈에 섹션으로 그리드를 설정하고, 소란 아세테이트 용액에 담그고 스테인링에 대해 각각 3 분 동안 구연산(도 11B-E)32.
- 효모 및 곰팡이 표본의 경우, 필터 용지 (4mm x 4mm)에 그리드를 놓고 핀셋으로 집어 들고 플라즈마 중합 된 냅탈렌 필름33으로 덮습니다(그림 11F,G). 그리드를 전자 현미경에 삽입하고 100 kV(도 11H,I)에서관찰하십시오.
2. 바이러스 및 거대 분자의 신속한 동결
- 액체 에탄의 준비
참고: 액체 질소를 취급할 때 극저고와 고글을 사용합니다. 에탄이 폭발하기 때문에 같은 방에서 화재를 사용하지 않도록주의해야하며 창문을 열어 두어야합니다. 에탄은 프로판이 없는 동안 전자 현미경에서 증발하기 때문에 사용됩니다.- SFD의 액체 질소 용기를 액체 질소로 채웁니다. 미세노즐을 통해 에탄 가스를 도입하여 액체 에탄 용기를 액체 에탄 용기로 채웁니다.
- 마이크로그리드 및 시편의 준비 및 신속한 동결
- 이온 스퍼터 장치(30)를 이온 스퍼터장치(30)를사용하여 글로우 방전(10Pa, 400 V, 1mA)으로 치료하여 마이크로그리드의 양면을 친성하게 만성하게 만드십시오.
- SFD에서 마이크로그리드를 설정하고 마이크로그리드에 바이러스 또는 대용량 분자 현탁액(1 mg 단백질/mL)의 2μL을 적용한다. 필터 용지를 사용하여 과도한 액체를 제거하고 장치의 사출 버튼을 눌러 마이크로 그리드를 신속하게 동결하십시오.
- 냉동 마이크로그리드의 동결마이크로그리드 설정 및 전자 현미경 하에서 관찰
- 액체 질소에서 냉동 마이크로 그리드를 전송하고, 액체 질소 온도에서 미리 냉각된 극저온 전달 홀더에 설정하고, 저온34에서전자 현미경으로 관찰한다.
Representative Results
현탁액에 있는 미생물의 살아있는 세포는 상술한 절차에 따라, 2개의 구리 디스크 사이 끼워진 원심분리에 의해 집합되고, SFD로 급속하게 동결된, 동결 대용품, 에폭시 수지에 내장된, 초박단면, 염색 및 전자 현미경의 밑에 관찰하였다. 도 12는 대장균의 초박형 부분(박테리아, 도 12A,B)16 및 사카로미세스 세레비시아(효모, 도 12C)15를나타낸다. 이미지는 매우 명확하고 자연 형태를 보여줍니다.
배양된 세포와 분리된 동물 세포의 글루타랄데히드 고정 세포 현탁액은 SFD로 빠르게 동결되고, 동결 대체, 전술한 절차에 따라 전자 현미경으로 관찰되었다. 도 13은 배양된 세포의 초박형 단면을나타낸다(도 13A-C)1,28 및 마우스 복강에서 분리된 세포(도13D)28. 도 14는 인간의 피부의 초박형부분(도 14A-D)및 버피 코트(도14E)1을나타낸다. 이미지는 또한 매우 명확하고 자연 형태를 보여줍니다. 도 15는 B형 간염 바이러스 코어 입자가 SFD로 급속히 동결되고 냉동 전자 현미경검사기(34)에의해 관찰된 것을 나타낸다. 다른 세포와 마찬가지로 이미지는 매우 명확하고 자연스러운 형태를 보여줍니다.
그림 1: 샌드위치 동결 장치(28)와 필요한 도구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 샌드위치 동결 실험을 수행하는 데 필요한 재료. (A)표본 : 사카로미세스 세레비시아 (효모)의 가벼운 현미경 사진. 스케일 바 = 10 μm.(B)유리 바이알 (10 mL) 2 % 오스뮴 테트산화물아세톤과 아세톤의 1 mL을 포함. (C)문자가 없는 표면(왼쪽)과 문자(오른쪽)가 있는 표면을 보여주는 구리 디스크. 스케일 바 = 3mm. 전자 현미경 검사. (D)문자가 없는 구리 디스크는 양면 접착제 테이프(*)가 있는 유리 슬라이드에 배치되었습니다. 스케일 바 = 3mm.(E)양날 면도기와 동물 과 인간 조직을 슬라이스하기위한 깨진 양날 면도기, 블록을 트리밍하기위한 단날 면도기, 동물과 인간의 조직을 슬라이스하기위한 파쇄 보드. (F)압출 폴리스티렌 폼핀핀을 가진 핀셋은 추위로부터 손가락을 보호합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 샌드위치 동결 방법을 사용하여 세포 현탁액의 표본 제제. 약어 : r.t. = 실온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 액체 프로판, 구리 디스크 및 고정제제의 제조. (A)액체 질소(arrow)는 샌드위치 동결 장치의 액체 질소 용기에 부었다. (B)프로판 가스는 미세노즐을 통해 액체 프로판 용기에 도입되었다. (C)액체 프로판 (화살표). (D)액체 프로판의 응고를 가속화하기 위해 액체 프로판을 냉각하는 금속 막대(화살표)를 사용하였다. (E)고화 프로판 (화살표). (F)이온 스퍼터 장치(arrow)는 구리 디스크를 광발성 으로 친성화하게 만들기 위한 장치(arrow). (G)글로우 방전. (H)유리 바이알은 작업 용욕에 액체 질소에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 샌드위치 동결 장치를 사용하여 세포 현탁액 (효모)의 신속한 동결. (A)효모 배양을 원심분리기 튜브로 옮기. (B)미세 원심 분리기. (C)원심분리기 관(arrow)에서 사카로미세스 세레비시아의 펠릿. (D)원심분리기 관으로부터 마이크로피펫으로 시편을 이송한다. (E)구리 디스크에 표본을 배치합니다. (F)구리 디스크(화살표)에 표본의 작은 방울. (G)다른 구리 디스크로 표본을 덮는다. (H)핀셋으로 두 개의 디스크를 따기. (I)얇은 금속 바를 사용하여 고체 프로판에 잘 만드는. (J)사출 버튼을 눌러 시편의 플런지 동결. (K)동결이 완료되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 인간 조직 (피부)의 표본을 준비합니다. (A, B) 페트리 접시에 글루타랄데히드에 고정된 인간의 피부 조직. 스케일 바 = 5mm.(C, D)조직 (화살표)은 파쇄 된 보드에 두 개의 양날 면도기로 슬라이스되었다. (E, F) 글루타랄데히드 용액(화살표)의 작은 방울이 구리 디스크에 배치되었습니다. (G, H) 핀셋을 사용하여 구리 디스크에 피부 조직의 조각을 배치했다. (I)또 다른 디스크는 피부 조직으로 구리 디스크를 커버하는 데 사용되었다. (J)샌드위치 디스크는 핀셋으로 집어 들었다. (K)샌드위치 디스크는 핀셋으로 부드럽게 붙잡았다. 조직을 분쇄하지 않도록 유지된 트위저 팁(화살표) 사이의 간격을 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 시편을 액체 질소로 옮기고 디스크를 분리합니다. (A)디스크(arrow)를 작업용 욕조에서 액체 질소로 옮킨다. (B)액체 질소 (화살표)의 디스크. (C)핀셋은 액체 질소에 배치되어 작업 용목욕탕에서 냉각하였다. (D, E) 핀셋을 사용하여 구리 디스크(화살표)를 분리합니다. (F)핀셋으로 유리 바이알에 디스크(화살표)를 전송합니다. (G)다음 시편을 동결하기 위해 물 속에서 핀셋을 데우는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 샘플 온난화 및 포함. (A)실온에서 유리 바이알에 표본. (B)핀셋이 있는 2mL 플라스틱 튜브로 디스크(화살표)를 전송합니다. (C)플라스틱 튜브의 아세톤에 구리 디스크(화살표). (D)주사 튜브 (화살표)와 수지 측정. (E)수지를 일회용 컵(화살표)으로 옮기. (F)교반기를 사용하여 수지를 혼합. (G)소량의 수지가 실리콘 내장 금형의 구멍에 배치되었다. (H)그리드내의 과잉 수지는 필터 용지로 제거하였다. (I, J) 표본이 있는 구리 디스크는 시편 측이 위로 있는 임베딩 몰드의 구멍 의 바닥에 배치되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 표본 블록을 트리밍. (A)포함 금형에서 중합 된 블록을 꺼내. (B)표본 번호가 블록에 기록되었습니다. (C, D) 구리 디스크는 면도기로 블록에서 제거되었습니다. (D)= 1mm.(E-G)시편을 초음파 절단 블레이드와 면도날로 트리밍하였다. (G) = 1mm.(H)높은 배율(G)에대한 스케일 바. 개별 밝은 점은 셀입니다. 세포는 단일층(10)에포함되었다. 스케일 바 = 10 μm.(I-K)블록의 표면은 다이아몬드 트리밍 나이프로 매끄럽게 절단되었습니다. (K)= 1mm에 대한 배율 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: 초박형 절삭. (A)시편 블록은 마이크로토메(31)로부터 제거되었다. (B, C) 시편은 면도날로 더 잘리게 되었습니다. (C)= 0.5 mm.(D)네오프렌에 대한 스케일 바는 그리드에 적용되어 스틱을 만들었다. (E)초미세먼지 절제 시 공기 흐름을 피하기 위해 초미세토메를 플라스틱으로 덮었다. (F)다이아몬드 나이프 보트는 물로 가득 찼습니다. (G, H) 초박형 섹션은 70 nm의 두께로 절단되었다. (H)= 1mm.(I, J)섹션은 루프를 사용하여 검색한 다음 건조하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 11: 염색 섹션. (A)그리드는 반 실리콘 튜브의 홈에 배치되었다. (B)그들은 염색을 위해 우라일 아세테이트에 담근. (C)사용 된 우라일 아세테이트는 자체 밀봉 왁시 필름에 수집되었다. (D)그리드는 워터 제트로 세척하고(E)다음 납 구연산에 담근. (F)플라즈마 중합체 나흐트할렌 필름은 물에 떠 있었고(G)4mm x 4mm 필터 용지에 놓인 격자를 커버하는 데 사용되었다. (H)그리드는 표본 홀더에 배치되었고(I)전자 현미경으로 관찰하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: 대장균의 초박형 섹션 (박테리아, A, B) 및 사카로미세스 세레비시아 (효모, C). (A)표본은 조밀하고 균일하게 내장되어 있으며 변형이 없음을 유의하십시오. (B, C) 멤브레인 구조는 명확하고 매끄러운 형태를 나타내며, 리보솜은 모든 입자를 열거 할 수있을만큼 분명하다16. (C)효모 핵과 바쿠올레는 그들의 자연적인 형태일지도 모르다 실제 원 모양을 보여줍니다. 미토콘드리아의 매트릭스는 급속동결에 의해 고정되는 살아있는 세포의 특성일 수 있는 전자 조밀한 외관을 나타낸다. 스케일 바 = 1 μm. 약어: CW = 세포벽; ER = 풍토성 망상; NM = 핵막; NP = 핵 모공; OM = 외부 멤브레인; PM = 플라즈마 멤브레인; R = 리보솜; N = 핵; M = 미토콘드리아. (B)야마다 등으로부터16일 무단전재 및 재배포를 하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 13: 초박형 섹션. (A-C)K562 배양 세포. (D)마우스에서 분리된 마스트 셀. (A)표본은 조밀하고 균일하게 내장되어 있으며 변형이 없음을 유의하십시오. 스케일 바 = 20 μm.(B-D)높은 배율, 핵, 핵, 핵솔루, 핵막, 핵 모공, 내피 성 망상, 미토콘드리아, 리보솜 및 과립이 명확하게 관찰된다. 스케일 바 = 2 μm(B),500 nm(C),2 μm(D). 약어: N = 핵; Nu = 핵골; NM = 핵막, NP = 핵 모공; ER = 풍토성 망상; M = 미토콘드리아; R = 리보솜; G = 과립; D = 셀 분할. (A)는야마구치 외1에서 무단으로 복제됩니다. (B-D)는야마구치 외28에서 허가를 받아 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 14: 초박형 섹션. (A-D)인간의 피부와(E)버피 코트. (A-E) 조직과 세포 이미지는 명확하고 자연적이며 섹션이 매우 얇지만 (50 nm)이 좋습니다. 미토콘드리아의 매트릭스는 급속히 얼어붙은 살아있는 세포의 조밀한 미토콘드리아 행렬과 유사한 조밀한 외관을나타낸다(D). 스케일 바 = 10 μm(A, E),200 nm(B-D). 약어: D = 데모좀; ER = 풍토성 망상; K = 각질 세포; KF = 케라틴 섬유; M = 미토콘드리아; N = 핵; NM = 핵막; P = 혈소판; R = 리보솜; W = 백혈구. 야마구치 외28에서 무단으로 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 15: B형 간염 바이러스(HBV) 코어 입자는 샌드위치 동결 장치를 사용하여 액체 에탄으로 급속히 동결되어 냉동 전자 현미경 검사법에 의해 관찰된다. 구형 중공 입자는 HBV 코어 입자입니다. 스케일 바 = 100 nm. 약어: HBV = B형 간염 바이러스; 나는 = 얼음. 야마구치 외28에서 무단으로 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
다음 토론은 36년 동안 실시된 75개 이상의 샘플에 대한 1,000개 이상의 샘플과 70개 이상의 플런지 동결-냉동 전자 현미경 실험에 대한 120개 이상의 샌드위치 동결 동결 대체 실험을 기반으로 합니다.
샌드위치 동결에 의해 좋은 동결에 대한 성공률
좋은 동결을 달성하는 성공률은 샘플에 따라 달라집니다. YPD 배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로스 2%)에서 배양된 사카로미세스 세레비시아(효모) 세포는 얼음 결정 형성 10,11,15,35,36없이 좋은 동결을 위해 거의100%성공을 거두었다. 기타 효모종은 시조사카로미세스(37),38,39,크립토코커스14개,40개,41개,42개,43종,44종,45종, 엑소피알라13,41, 46,47,48종, 49, 푸사리움50,51,52, 아우레로바시듐53, 칸디다54,55, 펠로미세스56, 아스퍼길러스57, 트리코스포론도 좋은 동결을 보였다. 진균균58,59 및 대장균16을포함한 박테리아도 좋은 동결을 보였다. 배양된 세포와 분리된 동물 세포는 살아있는 세포와 글루타랄데히드 고정 세포1,25, 26,27,60모두에 좋은 동결을 보였다. 글루타랄데히드-고정 된 동물 및 인간 조직 0.1 ~ 0.2 mm 두께또한 대부분의 시간1,28에좋은 동결을 보였다.
좋은 동결을위한 조건
적절한 성장 단계와 조건에서 세포만 사용하십시오. 배양에 있는 세포는 기하급수적인 단계에 있어야 합니다. 구리 디스크에 농축 된 샘플의 매우 적은 양의 세포 현탁액 (S. cerevisiae,~ 0.02 μL의 3-5 × 109 셀 / mL)을 적용하십시오. 동물 또는 인간 조직의 글루타랄데히드 고정 조각은 또한 매우 작아야 합니다 (바람직하게는 0.3 mm x 0.3 mm x 0.1 mm). 0.1mm 두께의 티슈 슬라이스를 자르는 것은 어렵기 때문에 많은 조직을 슬라이스하고 얇고 반 투명한 슬라이스를 선택합니다. 신속 하 게 하 고 신중 하 게 작업 하 고 샘플 건조 하지 않습니다. 핀셋으로 쌓인 구리 디스크를 집어 들때, 세포와 조직을 분쇄하지 않도록 디스크를 너무 세게 누르지 마십시오. 시편 하중은 성공적인 동결을 위한 가장 중요한 단계이며, 필요한 조건은 고압 동결을 위한 양호한 동결조건과 동일합니다. 독자는 맥도날드에 의해 우수한 리뷰를 참조해야61.
기타 응용 프로그램
이 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 고립 된 동물 세포, 인간 조직 및 바이러스 입자의 전자 현미경 그래프를 제시합니다. 우리는 글루타랄데히드 고정 해양 조류의 좋은 동결을 관찰했다. 그러나, 살아있는 민물 녹조류의 세포 구조는 얼음 결정 형성에 의해 파괴되었다. 20% 소 세럼 알부민(BSA)과 세포를 혼합하면 초구조가 얼음 결정 손상 없이 잘 보존되도록 했습니다. 20%의 BSA를 사용하면 버섯 줄기 세포의 초구조를 보존하는 데에도 도움이 되었습니다. 20%의 BSA를 적용하여 식물 세포 및 조직의 동결에 대한 실험이 진행 중이다. 샌드위치 동결-동결 대체 시료의 주사 전자 현미경 검사는 시도되지 않았지만, 잘 보존된 세포 구조의 관찰은 이전에보고되었다 9.
샌드위치 동결 방법에 대한 참고 사항
세포의 가까운 네이티브 울트라 구조는 살아있는 세포의 급속한 동결 및 동결 대체에 의해 관찰되는 것이 가장 좋습니다. SFD를 가진 얼음 결정 형성은 세포의 두께를 ≤30 μm1로제한함으로써 피할 수 있다. 글루타랄데히드로 조직을 고정하는 것은 종종 현탁액 배양 세포를 관찰하기 위한 세포 구조를 더 잘 보존하는 데 수반되는데, 글루타랄데히드 고정은 세포 구조를 보다 경직시키고 살아있는 세포의 수집 및 원심분리 시 가능한 초구조적 변화를 방지하기때문이다. 글루타랄데히드 고정은 또한 고압 동결(HPF) 방법에 의해 달성된 것과 유사한 0.2 mm1까지동결 깊이의 연장을 허용한다. 따라서, HPF 기계는 동물과 인간 조직의 깊은 동결을 위해 SFD로 대체될 수 있다.
글루타랄데히드 고정 조직은28년이상 보관할 수 있기 때문에 사용자의 편의에 따라 샌드위치 동결을 수행할 수 있습니다. 글루타랄데히드로 조직을 고정하면 조직이 고정되어 있기 때문에 조직 단면이 촉진됩니다. HPF 기계와는 달리, SFD는 극저온 전자 현미경 검사법과 박테리아 및 진핵 세포에 대한 바이러스의 신속한 동결에 사용될 수 있습니다. 또한 HPF 기계에 비해 SFD는 작고 휴대성이 뛰어나며 비용이 적게 들며 더 많은 실험실에서 획득할 수 있습니다. 우리는 SFD의 이러한 기능이 더 많은 실험실이 연구 목표28을달성하는 데 도움이되기를 바랍니다.
세포의 자연적인 형태의 특징
세포 구조는 외부 멤브레인(도12A,B),플라즈마 멤브레인(도12B,C)의 막 구조와 같은 외관을 보이면 자연 상태에있다. 그림 13A-D; 도 14E),핵봉투(도 12C, 도 13B-D및 도 14D-E),미토콘드리아(도12C, 도 13C,및 도 14D),및 바쿠올레(도12C)가매끄러운 윤곽을 보여준다. 핵과 바쿠올은 거의 원형이다(도12C). 리보솜은 ~20nm의 직경을 가진 맑은 전자 조밀한 외관을 보여줍니다(도 12B,C; 도 13C; 및 그림 14D). 세포질은 전자 루센트(도12B,C; 도 13C; 및 그림 14D).
세포 형태에 대한 글루타랄데히드 고정의 효과
글루타랄데히드 고정은 얼음 수정이 없는 울트라 구조를 얻기 위해 동결하기 전에 동물 또는 인간 조직을 위해 수행되었다. 이 방법에 의해 얻은 현미경 사진은 살아있는 조직의 급속한 동결에 의해 얻어진 것과 유사한 정교하게 선명한 심상을 보여줍니다(도 14)1. 효모 세포, 심해 미생물 및 배양 세포에 대한 연구는 초구조구조의 변형이 주로 실온1,17,18, 28에서에탄올에 의한 오스뮴 테트옥사이드 고정 및 탈수에 기인한다는 것을 보여준다. 스몰은 또한 글루타랄데히드 고정이 배양된 섬유아세포, 아세톤 또는 에탄올에 의한 오스뮴 테트옥사이드 고정 및 탈수의 액틴 조직을 파괴하지는 않지만 액틴조직(62)을파괴한다고 보고했다.
따라서 세포 형태에 대한 글루타랄데히드 고정의 효과에 대한 자세한 연구가 수행되어야합니다. 오노(Ohno)는혈액공급(63)을멈추지 않고 살아있는 조직이 급속히 동결되는 생체내 저온법을 개발하였다. 조직은 동결 대용품및 에폭시 수지에 내장되었고, 초박형 단면도가 관찰되었다. 전자 현미경 이미지는 화학 고정 -기존의 탈수및 신선한 고정되지 않은 조직의 급속한 동결에 의해 얻은 것과 비교하여 살아있는 조직의 가장 가까운 네이티브 울트라 구조를 보여 주었다. 따라서 글루타랄데히드 고정-동결 대체(본 방법)에 의해 얻어진 초구조를 비교하는 것이 재미있을 수 있으며, 생체 내 극저온 동결 대체체에 의해 글루타랄데히드 고정의 효과를 검사하는 것이 흥미로울 수 있다.
환경에 대한 고려 및 실험 효율성 향상
수지의 대체를 위해 2mL 플라스틱 튜브를 사용합니다. 희석 된 수지의 1 mL은 각 대체 단계에 충분합니다. 사용된 플라스틱 튜브는 각 실험 후에 폐기될 수 있다. 이것은 수지 대체에 사용될 때 유리 바이알을 씻는 시간과 노력을 절약 할 수 있습니다. 또한, 우라일 아세테이트 용액은 섹션염색(32)에반복적으로 사용될 수 있다. 단면을 염색한 후, 우라일 아세테이트 용액을 저장하고 재사용할 수 있습니다. 우라일 아세테이트는 방사성 물질이기 때문에, 그것의 재사용은 폐기물의 생성을 방지하고 환경 보호에 기여합니다.
플라즈마 중합 체압 나프탈렌 필름
플라즈마 중합 체포화 냅탈렌 필름은 광발방출(33)에서플라즈마 중합에 의해 냅탈렌 가스로 만든 3차원 중합탄소 필름이다. 이 필름은 전자 폭격 및 화학 물질에 대해 탄력적이며 전자에 대해 매우 깨끗하고 투명하며 평평한 표면과 비정질 구조를 가지고 있습니다. 따라서, 플라즈마 중합된 냅탈렌 필름은 시판되고, 우수하며, 지원 필름으로 권장된다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
| 10 mL glass vials | - | Scintillation counter vials for fixative | |
| Acetone | - | ||
| Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
| Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
| Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Slide glass | - | ||
| Double-sided adhesive tape | - | ||
| Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FAS-10 |
| Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FA-10 |
| Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
| Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Several pairs |
| Tweezers with polystyrene foam | - | One pair | |
| Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
| Liquid nitrogen | - | ||
| Propane gas | - | Cryogen | |
| Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
| Micropipette | - | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
| Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
| Disposable plastic container | - | 50 mL and 200 mL | |
| Ethane gas | - | Cryogen | |
| 2 mL Eppendorf tubes | - | For embedding | |
| Disposable plastic syringes | - | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
| Magnetic stirrer | - | ||
| Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
| Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
| Incubater | - | For 37 °C and 60 °C | |
| Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
| Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
| Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
| Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |
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