Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62431
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

Abstract

קיבעון כימי שימש להתבוננות אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים; חפצים ומיצוי של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה היא חלופה טובה יותר לשימור מבנה התא. הקפאת כריך של שמרים חיים או חיידקים ואחריו הקפאה-תחליף שימשה להתבוננות אולטרה-מבנה טבעי מעודן של תאים. לאחרונה, הקפאת כריך של תאים בתרבית קבוע glutaraldehyde או רקמות אנושיות שימש גם כדי לחשוף את ההשמדה ultrastructure של תאים ורקמות.

מחקרים אלה בוצעו עד כה עם מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד, ויישומים למחקרים במעבדות אחרות הוגבלו. מכשיר חדש להקפאת כריך מפוברק לאחרונה וכעת זמין מסחרית. המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים מתורבתים, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה והליכים להחלפת הקפאה, הטבעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים אולטרה-דקים, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.

Introduction

מיקרוסקופיית אלקטרונים היא כלי רב עוצמה לחקר אולטרה-מבנה תאים. קיבעון כימי עם הליכי התייבשות קונבנציונליים שימש לצפייה אולטרה מבנה של תאים ורקמות. עם זאת, שיטה זו אינה משמרת כראוי את ההשמדה האולטרה של תאים, וחפצים ואת החילוץ של תוכן התא נצפים בדרך כלל. הקפאה מהירה והקפאה של תאים ורקמות הן חלופות טובות יותר לשימור מבנה התא.

שלוש שיטות עיקריות שימשו להקפאת תאים במהירות1: 1) הקפאת צלילה מבוצעת על ידי צלילה דגימות לתוך קריוגן מקורר, כגון פרופאן, והיה בשימוש מאז תחילת שנות ה -502; 2) הקפאת בלוק מתכת קרה מבוצעת על ידי טריקה מהירה של תאים ורקמות על בלוק מתכת מקורר עם חנקן נוזלי או הליום נוזלי3,4; ו 3) הקפאה בלחץ גבוה נעשית על ידי הקפאת תאים ורקמות עם חנקן נוזלי בלחץ גבוה5,6,7.

הקפאת כריך היא סוג של הקפאת צלילה המתבצעת על ידי כריכת חומרים ביולוגיים דקים בין שני דיסקים נחושת והקפאתם במהירות על ידי צלילה לתוך פרופן נוזלי8,9,10. בשיטה זו, דגימות דקות מאוד (בעובי של כמה מיקרומטרים) מקוררות במהירות עם קריוגן באמצעות מתכת שיש לה מוליכות תרמית טובה משני הצדדים. לכן, שיטה זו מסירה ביעילות חום מן הדגימות, מה שמאפשר להקפיא בייצוב תאים ללא נזק לקרח. הקפאת כריך, ואחריה הקפאת החלפה של שמרים חיים ותאי חיידקים, מגלה את ההשמדה הטבעית של תאים10,11,12,13,14,15,16.

לאחרונה, שיטה זו נמצאה שימושית לשימור תמונות תאים ברורים של מיקרואורגניזמים קבועים גלוטרלדהיד17,18,19,20,21,22,23,24, תאים מתורבתים25,26,27, ותאים ורקמות אנושיים1,28 . למרות שמחקרים אלה בוצעו באמצעות מכשיר הקפאת כריך בעבודת יד29, ויישומים למחקרים אחרים במעבדות אחרות הוגבלו, מכשיר הקפאת כריך חדש (SFD) כברמפוברק 28 והוא זמין כעת מסחרית.

המאמר הנוכחי מראה כיצד להשתמש ב- SFD להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. כמו כן מוצגת הכנת דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה, כמו גם נהלים להחלפת הקפאה, הטמעת שרף, חיתוך בלוקים, חיתוך מקטעים דקים במיוחד, שחזור מקטעים, כתמים וכיסוי של רשתות עם סרטי תמיכה.

Protocol

הערה: פרוטוקול המחקר לדגימות אנושיות אושר על ידי ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי של בית הספר לרפואה לתארים מתקדמים, אוניברסיטת צ'יבה (3085). אוסמיום טסטרוקסיד הוא כימיקל מסוכן; זה צריך להיות מטופל לובש כפפות במכסה המנוע האדים. איור 1 מציג את מכשיר הקפאת הכריכים ואת הכלים הדרושים28. איור 2 מראה את החומרים הדרושים לביצוע ניסויים בהקפאת כריך. בקבוקוני זכוכית מלאים באצטון המכיל אוסמיום טסטרוקסיד ונשמרים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש(איור 2B). דיסקי נחושת בקוטר 3 מ"מ, ללא חורים, יש אות בצד אחד, והם זמינים מסחרית(איור 2C).

1. הקפאה מהירה של השעיות תאים להחלפת הקפאה

הערה: ההליך כולו מוצג באיור 3.

  1. תאים
    1. השתמשו בהשעיות תאים של חיידקים, שמרים (איור 2A), תאים מתורבתים ותאים מבודדים להקפאת כריך.
      הערה: ניתן להשתמש הן בתאים חיים והן בתאים קבועים של גלוטרדהיד28.
  2. הכנת פרופן נוזלי
    הערה: השתמש cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול חנקן נוזלי. כמו פרופאן הוא נפץ, יש להקפיד לא להשתמש בשריפות באותו החדר, וחלונות צריכים להישמר פתוחים.
    1. מלאו את מיכל החנקן הנוזלי של ה-SFD בחנקן נוזלי(איור 4A). מלאו את מיכל הפרופן הנוזלי בפרופן נוזלי על ידי החדרת גז פרופן באמצעות זרבובית עדינה(איור 4B,C). האצו את התגבשות הפרופן באמצעות מוט מתכת מקורר(איור 1 ואיור 4D,E).
  3. הכנת דיסקי נחושת
    1. הניחו דיסקי נחושת על זכוכית שקופית עם הצד ללא אותיותלמעלה (איור 2D)ופינקו בפריקה זוהרת ב- 10 Pa, 400 וולט, 1 mA ל - 30 s (איור 4F,G) כדי להפוך את משטח הדיסק הידרופילי באמצעות מנגנון יון מקרטעת30.
  4. כריך וצליפה-הקפאה של השעיית התא
    1. העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה בגודל 2 מ"ל(איור 5A)וצנטריפוגה ב-2,900 × גרם ל-10 מעלות בטמפרטורת החדר(איור 5B,C). הסר את supernatant, ולהשעות את הכדור כדי לקבל מתלה עבה (ראה דיון).
    2. הניחו כמות קטנה של מתלה התא (~0.02 μL) על דיסק נחושת(איור 5D-F),כסו אותו בדיסק נחושת אחר(איור 5G),ובחרו את הדיסקים עם פינצטה(איור 5H).
      הערה: כדי למדוד ~ 0.02 μL של השעיית התא, לצפות 0.1 טיפות μL של ההשעיה תחת סטריאוטימיקרופ ולחלק אותם טיפות כי הם 1/5th של נפח זה.
    3. הפוך באר במרכז הפרופן המוצק עם מוט המתכת הדק(איור 5I). הגדר את פינצטה ב- SFD והקפיא אותם במהירות על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון (איור 5J,K).
      הערה: יש להקפיד לא לייבש את הדגימות ולא להניח את שני הדיסקים לחלוטין זה על זה (אחרת, ניתוקם יהיה קשה מאוד בשלב הבא).
  5. כריך וצלילה הקפאה של בעלי חיים ורקמות אנושיות
    1. השתמש ברקמות בעלי חיים ובני אדם (~ 0.5 מ"מ x 0.5 מ"מ x 1.5 מ"מ) קבוע ב 2.5% glutaraldehyde-0.1 M חוצץ פוספט (pH 7.4) (איור 6A,B). פרוס אותם למקטעים בעובי 0.1 עד 0.2 מ"מ עם סכין גילוח מתחת לסטריאומיקוסקופ(איור 6C,D).
      1. הנח טיפה קטנה (~ 0.02 μL) של פתרון glutaraldehyde על דיסק נחושת (איור 6E, F). לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח פיסת רקמה בגלוטארלדהיד על דיסק הנחושת(איור 6G,H)ולכסות אותה בדיסק נחושת אחר (איור 6I-K).
      2. להקפיא במהירות את הדיסקים עם הרקמות בפרופאן ההיתוך של SFD, כמתואר בסעיף 1.4 (איור 5J,K).
        הערה: כמו glutaraldehyde הוא כימי מסוכן, זה צריך להיות מטופל לובש כפפות במכסה המנוע אדים. רקמות לא צריך להיות שטף עם חוצצים כאשר להציב על דיסק נחושת אבל נשמר ספוג פתרון glutaraldehyde כי glutaraldehyde יש אפקט אנטי הקפאה1.
  6. הקפאה-החלפה עם אוסמיום אצטון
    1. מעבירים את הדיסקים לחנקן נוזלי באמבט עבודה(איור 7A,B). באמצעות זוג פינצטה מקורר בחנקן נוזלי, לנתק את הדיסקים אחד מהשני כדי לחשוף את הדגימה (איור 7C-E).
    2. מקם את הדיסקים עם התאים ב בקבוקון זכוכית (איור 7F) כי הוא מלא 1 מ"ל של אצטון המכיל 2% osmium tetroxide (איור 2B)כי כבר להציב חנקן נוזלי מוצק (איור 4H).
    3. העבירו את הדיסקים למקפיא עמוק ושמו אותם בטמפרטורה של -80°C למשך יומיים-ארבעה להקפאת התאים(איור 3). השרו את פינצטה משומשת במים בטמפרטורת החדר כדי לחמם אותם (איור 7G) להקפאת הדגימות הבאות.
      הערה: פינצטה לטיפול בדגימה צריכה להיות חמה (טמפרטורת החדר) מכיוון שפינצטה קרה עלולה להקפיא את הדגימה לפני הקפאה מהירה, מה שמוביל להיווצרות גבישי קרח.
  7. התחממות והטבעה לדוגמה
    1. הביאו בהדרגה את הדגימות לטמפרטורת החדר (2 שעות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, 2 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-15 דקות בטמפרטורת החדר, איור 3 ואיור 8A),והעבירו את הדיסקים לצינורות פלסטיק בגודל 2 מ"ל המלאים ב-1 מ"ל שלאצטון (איור 3 ואיור 8B,C).
    2. הכן שרף אפוקסי על ידי ערבוב ריאגנטים במיכל פלסטיק חד פעמי באמצעות מערבל(איור 8D-F).
    3. החליפו את האצטון בשלב 1.7.1 ברציפות עם 30% שרף (באצטון), 60% שרף, ו 90% שרף בטמפרטורת החדר עבור 1 שעה כל אחד. לאחר מכן, להחליף את שרף 90% עם 100% שרף ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לבסוף, הטמינו את הדגימות ב-100%שרף (איור 8G-J)בתבנית הטמעת הסיליקון, והטמינו אותן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות(איור 3).
      הערה: הדגימות צריכות להישאר מחוברות לדיסקים הנחושת לאורך כל ההליך (כדי להקל על החתך). השימוש במנגנון מסתובב או רועד אינו מומלץ במהלך תהליך ההטבעה מכיוון שהם תורמים מעט לחדירת השרף לתא. יתר על כן, הרטט מהמנגנון לפעמים גורם לדגימות להתנתק מדיסק הנחושת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה היה להאיץ את החדירה של שרף לתוך התא בשל אנרגיה תרמית (השרף לא פולימר כי זה לא מכיל כל מאיץ).
  8. חיתוך בלוקים של דגימות
    1. הוציאו את הבלוקים הפולימריים מתבניות הסיליקון(איור 9A). כתוב את מספר הדגימה על הבלוק (איור 9B).
    2. הסר את דיסקי הנחושת מהבלוק עם סכין גילוח (איור 9C,D)ולחתוך את הדגימות מוטבע על פני השטח בלוק ל 0.7 מ"מ x 0.7 מ"מ באמצעות להב חיתוך קולי (איור 9E) וסכיני גילוח (איור 9F-H) תחת סטרימוקרופ31.
    3. מניחים את הבלוק במחזיק דגימה של אולטרה-מיקרודום(איור 9I)וחתכו את פני הבלוק בצורה חלקה עם סכין חיתוך יהלום(איור 9J,K).
  9. חיתוך מקטעים דקים במיוחד
    1. הסר את הבלוק מהמיקרוביום האולטרה-מיקרודום (איור 10A)31,הגדר אותו בסטריאומיקרוסקופ וחתוך אותו עוד יותר ל- 0.2 מ"מ x 0.3 מ"מ עם סכין גילוח (איור 10B, C).
    2. החל ניאופרן על הרשתות כדי להפוך אותם דבק(איור 10D). החזירו את הבלוק לאולטרה-מיקרודום, כסו את האולטרה-מיקרודום בכיסוי פלסטיק(איור 10E)31וחתכו קטעים בעובי 50-70 ננומטר(איור 10F-H).
    3. אחזרו את המקטעים באמצעות לולאה(איור 10I),הרכיבו אותם על רשתות נחושת של רשת 300 או 400 שטופלו בניאופרן, וייבשו אותם(איור 10J).
  10. הכתמת מקטעים ותצפית מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים
    1. הגדר את הרשתות עם קטעים בחריץ של צינור חצי סיליקון (איור 11A)31,ולהשרות בתמיסת אצטט אורניל וצטט עופרת במשך 3 דקות כל אחד להכתמה (איור 11B-E)32.
    2. עבור שמרים ודגימות פטרייתיות, מניחים את הרשתות על נייר סינון (4 מ"מ x 4 מ"מ), מרימים אותן עם פינצטה, ומכסים אותן בסרט נפטליןפלזמה 33 על פני המים(איור 11F,G). הכנס את הרשתות למיקרוסקופ אלקטרונים והתבונן ב- 100 kV (איור 11H,I).

2. הקפאה מהירה של וירוסים ומקרומולקולים

  1. הכנת אתאן נוזלי
    הערה: השתמש cryogloves ומשקפי מגן בעת טיפול חנקן נוזלי. כמו אתאן הוא נפץ, יש להקפיד לא להשתמש בשריפות באותו החדר, וחלונות צריך להישמר פתוח. אתאן משמש כי הוא מתאדה במיקרוסקופ האלקטרונים בעוד פרופן לא.
    1. מלא את מיכל החנקן הנוזלי של ה- SFD בחנקן נוזלי. מלא את מיכל האתאן הנוזלי באתאן נוזלי על ידי החדרת גז אתאן דרך זרבובית עדינה.
  2. הכנה והקפאה מהירה של מיקרוגרידים ודגימות
    1. הפוך את שני הפנים של הידרופילי microgrids על ידי טיפול בהם עם פריקה זוהרת (10 Pa, 400 V, 1 mA) באמצעות מנגנון יון sputter30.
    2. הגדר את microgrid ב- SFD ולהחיל 2 μL של הנגיף או השעיה macromolecular (1 חלבון מ"ג / מ"ל) על microgrids. הסר נוזל עודף באמצעות נייר מסנן ולהקפיא במהירות את microgrid על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון.
  3. הגדרת המיקרוגריד הקפוא במחזיק העברת הקפאה ותצפית מתחת למיקרוסקופ האלקטרונים
    1. מעבירים את המיקרוגרידים הקפואים בחנקן נוזלי, מוגדרים במחזיק העברת קריו מקורר בטמפרטורת חנקן נוזלי מראש, וצופים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בטמפרטורה נמוכה34.

Representative Results

תאים חיים של מיקרואורגניזמים בהשעיה נאספו על ידי צנטריפוגה, נדחקו בין שני דיסקי נחושת, קפואים במהירות עם SFD, מוחלפים בהקפאה, מוטבעים בשרף אפוקסי, אולטרה-חתך, מוכתם, ונצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים על ידי ביצוע ההליכים שתוארו לעיל. איור 12 מציג קטעים דקים במיוחד של Escherichia coli (חיידקים, איור 12A,B)16 ו-Saccharomyces cerevisiae (שמרים, איור 12C)15. שימו לב שהתמונות מאוד ברורות ומציגות מורפולוגיה טבעית.

השעיות תאים קבועות של גלוטרלדהיד של תאים בתרבית ותאי בעלי חיים מבודדים נאספו והוקפאו במהירות עם SFD, הוחלפו בהקפאה, ונצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים על ידי ביצוע ההליכים שתוארו לעיל. איור 13 מציג חלקים דקים במיוחד של תאים בתרבית (איור 13A-C)1,28 ותאים מבודדים מחלל הבטן של העכבר ( איור13D)28. איור 14 מציג חלקים דקים במיוחד של עור האדם (איור 14A-D)ומעיל באפי(איור 14E)1. שים לב כי התמונות הן גם ברור מאוד להראות מורפולוגיה טבעית. איור 15 מראה חלקיקי הליבה של נגיף הפטיטיס B קפואים במהירות עם SFD ונצפתה על ידי מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית34. כמו עם התאים האחרים, התמונות ברורות מאוד ומציגות מורפולוגיה טבעית.

Figure 1
איור 1: מכשיר הקפאתכריך 28 והכלים הדרושים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: חומרים הדרושים לביצוע ניסויים בהקפאת כריך. (א)דגימה: מיקרוגרף קל של סרביסיה סכרומיצס (שמרים). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B)בקבוקוני זכוכית (10 מ"ל) המכילים 1 מ"ל של אצטון עם 2% אוסמיום tetroxide. (ג)דיסקי נחושת המציגים משטח ללא אות (משמאל) ומשטח עם אות (מימין). סרגל קנה מידה = 3 מ"מ. סורק מיקרוסקופיית אלקטרונים. (D)דיסקי נחושת ללא אותיות בצד למעלה הונחו על שקופית זכוכית עם סרט דבק דו צדדי (*). מוט קנה מידה = 3 מ"מ. (E) סכין גילוח פיפיות וסכין גילוח שבור פיפיות לחיתוך רקמות של בעלי חיים ובני אדם, סכין גילוח חד-צדדי לגיזום בלוקים, ולוח גרוס לחיתוך רקמות של בעלי חיים ובני אדם. (ו)פינצטה עם קצף פוליסטירן בולט כדי להגן על האצבעות מפני הקור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכנת הדגמה של השעיות תאים בשיטת הקפאת הכריך. קיצורים: r.t. = טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הכנת פרופן נוזלי, דיסקי נחושת וקיבוע. (A)חנקן נוזלי (חץ) נשפך לתוך מיכל החנקן הנוזלי של מכשיר הקפאת הכריך. (B)גז פרופן הוכנס לתוך מיכל פרופן נוזלי דרך זרבובית עדינה. (C)פרופן נוזלי (חץ). (D)מוט מתכת (חץ) שימש לקירור פרופן נוזלי כדי להאיץ את התגבשותו של פרופן נוזלי. (ה)פרופן מוצק (חץ). (F)מנגנון יון מקרטעת (חץ) להכנת דיסקי נחושת הידרופיליים עם פריקה זוהרת. (G)פריקה זוהרת. (ח)בקבוקוני זכוכית שהונחו בחנקן נוזלי באמבט עבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הקפאה מהירה של השעיית תאים (שמרים) באמצעות מכשיר הקפאת הכריך. (א)העברת תרבית השמרים לצינור הצנטריפוגה. (B)מיקרוצנטריפוגה. (C)גלולה של cerevisiae Saccharomyces בצינור הצנטריפוגה (חץ). (D)העברת הדגימה עם מיקרופיפט מצינור הצנטריפוגה. (ה)הצבת הדגימה על דיסק הנחושת. (ו)טיפה קטנה של דגימה בדיסק הנחושת (חץ). (ז)מכסה את הדגימה עם דיסק נחושת אחר. (ח)בחירת שני הדיסקים עם פינצטה. (אני)ביצוע באר פרופן מוצק באמצעות מוט מתכת דק. (J)לצלול הקפאה של הדגימה על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה. (K)ההקפאה הושלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הכנת דגימה של רקמות אנושיות (עור). (A, B) רקמת עור אנושית קבועה בגלוטרדהיד בצלחת פטרי. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. (C, D)רקמות (חץ) נחתכו באמצעות שני סכיני גילוח כפולים על לוח מגורר. (E, F) טיפה קטנה של פתרון גלוטרדהיד (חץ) הונחה על דיסק נחושת. (ז, H) פיסת רקמת עור הונחה על דיסק הנחושת באמצעות פינצטה. (I)דיסק נוסף שימש לכיסוי דיסק הנחושת ברקמת העור. הדיסקיםהסנדוויצים נאספו עם פינצטה. (K)הדיסקים הדחוסים הוחזקו בעדינות עם פינצטה. שים לב את הפער בין קצות פינצטה (חץ) נשמר כדי למנוע ריסוק הרקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: העברת הדגימה לחנקן נוזלי וניתוק הדיסקים. (א)העברת הדיסקים (חץ) לחנקן נוזלי באמבט עבודה. (B)דיסקים בחנקן נוזלי (חץ). (ג)פינצטה הונחה בחנקן נוזלי כדי לקרר אותם באמבט העבודה. (D, E) ניתוק דיסקי הנחושת (חצים) באמצעות פינצטה. (ו)העברת הדיסק (חץ) לתוך בקבוקון הזכוכית עם פינצטה. (ז)חימום פינצטה במים להקפאת הדגימה הבאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: דגימת התחממות והטבעה. (A)דגימות בבקבוקוני זכוכית בטמפרטורת החדר. (B)העברת הדיסקים (חץ) לתוך צינור פלסטיק 2 מ"ל עם פינצטה. (C)דיסקי נחושת (חץ) באצטון בצינור פלסטיק. (D)מדידת צפים עם צינור הזרקה (חץ). (ה)העברת השרף לכוס חד פעמית (חץ). (ו)ערבוב השרף באמצעות מערבל. (ז)כמות קטנה של שרף הונחה בחורי עובש הסיליקון. (H)שרף עודף ברשתות הוסר עם נייר סינון. (אני, J) דיסקי נחושת עם דגימות הונחו בתחתית החורים של התבנית המטביעה עם הצד הדגימה למעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: חיתוך בלוק הדגימה. (A)הוצאת בלוקים פולימריים מהתבניות המטביעות. (B)מספר הדגימה נכתב על הבלוק. (C, D) דיסק הנחושת הוסר מהבלוק עם סכין גילוח. סרגל קנה מידה עבור (D) = 1 מ"מ. (E-G)הדגימה נחתכה עם להב חיתוך קולי וסכין גילוח. סרגל קנה מידה עבור (G) = 1 מ"מ. (H) הגדלה גבוהה של (G). נקודת אור בודדת היא תא. תאים הוטבעו בשכבה אחת10. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (I-K)פני השטח של הבלוק נחתכו חלק עם סכין חיתוך יהלום. סרגל קנה מידה עבור (K) = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: חיתוך מקטעים דקים במיוחד. (A)בלוק הדגימה הוסר מהמיקרוטום31. (B, C) הדגימה קוצצה עוד יותר עם סכין גילוח. סרגל קנה מידה עבור (C) = 0.5 מ"מ. (D)Neoprene הוחל על רשתות כדי לגרום להם להידבק. האולטרה-מיקרודום היה מכוסה בפלסטיק כדי למנוע זרימת אוויר במהלך חתך אולטרה-דק. (ו)סירת סכיני היהלום הייתה מלאה במים. (ז, H) מקטעים דקים במיוחד נחתכו לעובי של 70 ננומטר. סרגל קנה מידה עבור (H) = 1 מ"מ. (I, J) המקטעים אוחזרו באמצעות לולאה ולאחר מכן התייבשו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: מקטעי הכתמה. (א)הרשתות הונחו בחריץ של צינור חצי הסיליקון. (B)הם היו ספוגים אצטט אורניל להכתמה. (C)אצטט אורניל משומש נאסף על סרט שעווה איטום עצמי. (D)הרשתות נשטפו עם סילון מים ו (E) לאחר מכן ספוג ציטוט עופרת. (F)סרט נפטלין פלזמה-פילמרי צף על מים ו (G) משמש לכיסוי רשת להציב על נייר מסנן 4 מ"מ x 4 מ"מ. (H)הרשת הונחה במחזיק דגימה ו (I) נצפתה במיקרוסקופ אלקטרונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 12
איור 12: קטעים דקים במיוחד של Escherichia coli (חיידקים, A, B) ו-Saccharomyces cerevisiae (שמרים, ג). (א)שים לב שדגימות מוטבעות בצפיפות ובהומוגניות ולא מראות עיוות. (B, ג) מבני ממברנה מראים מורפולוגיה ברורה וחלקה, וריבוזומים ברורים מספיק כדי שניתן למנות כל חלקיק16. (C)גרעין השמרים והחווליות מראים צורת מעגל אמיתית, שעשויה להיות המורפולוגיה הטבעית שלהם. המטריצה של המיטוכונדריה מראה מראה צפוף אלקטרונים, אשר עשוי להיות מאפיין של תאים חיים כי הם קבועים על ידי הקפאה מהירה. סרגלי קנה מידה = 1 מיקרומטר. קיצורים: CW = קיר תא; ER = רטיקולום אנדופלסמי; NM = ממברנה גרעינית; NP = נקבוביות גרעיניות; OM = ממברנה החיצונית; PM = פלזמה ממברנות; R = ריבוזומים; N = גרעין; M = מיטוכונדריה. (ב)משוחזר מיאמאדה ואח '16 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 13
איור 13: מקטעים דקים במיוחד. (A-C) תאים בתרבית K562. (D)תא תורן מבודד מהעכבר. (א)שים לב שדגימות מוטבעות בצפיפות ובהומוגניות ולא מראות עיוות. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B-D) בהגדלה גבוהה, גרעין, גרעין, נוקלאולוס, קרום גרעיני, נקבוביות גרעיניות, רטיקולום אנדופלסמי, מיטוכונדריה, ריבוזומים וגרגרים נצפים בבירור. סרגלי קנה מידה = 2 מיקרומטר(B),500 ננומטר(C),2 מיקרומטר(D). קיצורים: N = גרעין; Nu = nu = nucleolus; NM = ממברנה גרעינית, NP = נקבוביות גרעיניות; ER = רטיקולום אנדופלסמי; M = מיטוכונדריה; R = ריבוזומים; G = גרגירים; D = חלוקת תאים. (א)משוחזר מיאמאגוצ'י ואח '1 באישור. (ב-ד) משוחזרים מיאמאגוצ'י ואח '28 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 14
איור 14: חלקים דקים במיוחד. (A-D)עור אנושי ומעיל באפי (E). (A-E) שים לב כי תמונות רקמות ותאים ברורים וטבעיים ומראים ניגודיות טובה, אם כי המקטעים דקים מאוד (50 ננומטר). המטריצה של המיטוכונדריה מראה מראה צפוף, הדומה לאלו של מטריצות מיטוכונדריאליות צפופות של תאים חיים קפואים במהירות (D). סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר(A, E), 200 ננומטר(B-D). קיצורים: D = desmosomes; ER = רטיקולום אנדופלסמי; K = keratinocyte; KF = סיבי קרטין; M = מיטוכונדריה; N = גרעין; NM = ממברנה גרעינית; P = טסיות דם; R = ריבוזומים; W = תאי דם לבנים. שוחזר מיאמאגוצ'י ואח'28 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 15
איור 15: חלקיקי הליבה של נגיף הפטיטיס B (HBV) קפואים במהירות עם אתאן נוזלי באמצעות מכשיר הקפאת הכריך ונצפתה על ידי מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. חלקיקים כדוריים חלולים הם חלקיקי ליבת HBV. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. קיצורים: HBV = וירוס הפטיטיס B; אני = קרח. שוחזר מיאמאגוצ'י ואח'28 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הדיון הבא מבוסס על יותר מ-120 ניסויי החלפת הקפאת סנדוויץ' ביותר מ-1,000 דגימות ויותר מ-70 ניסויים במיקרוסקופיה הקפאת-הקפאה-אלקטרונים ביותר מ-75 דגימות שנערכו במשך 36 שנים.

שיעור הצלחה להקפאה טובה על ידי הקפאת כריך
שיעור ההצלחה בהשגת הקפאה טובה תלוי בדגימות. תאי Saccharomyces cerevisiae (שמרים) בתרבית בינונית YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטונה, 2% דקסטרוז) נתנו כמעט 100% הצלחה להקפאה טובה ללא היווצרות גביש קרח10,11,15,35,36. מינים אחרים של שמרים, כולל Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, קנדידה54,55, פלומייס56, אספרגילוס57, ו Trichosporon, גם הראה הקפאה טובה. חיידקים, כולל Mycobacterium58,59 ו- E. coli16, הראו גם הקפאה טובה. תאים בתרבית ותאי בעלי חיים מבודדים הראו הקפאה טובה הן לתאים חיים והן לתאים קבועים של גלוטרדהיד1,25,26,27,60. רקמות בעלי חיים ורקמות אנושיות קבועות של גלוטארלדהיד פרוסות לעובי של 0.1 עד 0.2 מ"מ הראו גם הקפאה טובה רוב הזמן1,28.

תנאים להקפאה טובה
השתמש רק בתאים בשלב הגדילה ובמצב המתאימים. תאים בתרבית צריכים להיות בשלב המעריכי. החל כמויות קטנות מאוד של השעיות תאים של דגימות מרוכזות (עבור S. cerevisiae, ~ 0.02 μL של 3-5 × 109 תאים / מ"ל) על דיסק הנחושת. פרוסות קבועות גלוטרדהיד של רקמות בעלי חיים או בני אדם צריכות להיות גם קטנות מאוד (רצוי 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.1 מ"מ). מכיוון שקשה לחתוך פרוסות רקמות בעובי 0.1 מ"מ, פורסים רקמות רבות ובוחרים פרוסות דקות ושקופות למחצה. עבוד במהירות אך בזהירות, ואל תתנו לדגימות להתייבש. באיסוף דיסקי נחושת מוערמים עם פינצטה, לא ללחוץ על הדיסקים קשה מדי כדי למנוע ריסוק התאים והרקמות. טעינת דגימה היא הצעד החשוב ביותר להקפאה מוצלחת, והתנאים הנדרשים זהים לתנאים להקפאה טובה להקפאה בלחץ גבוה. הקוראים צריכים להתייחס לביקורת המצוינת של מקדונלד61.

יישומים אחרים
מאמר זה מציג מיקרוגרפים אלקטרונים של חיידק, שמרים, תאים בתרבית, תאים בעלי חיים מבודדים, רקמות אנושיות וחלקיקי וירוס. ראינו הקפאה טובה של אצות ימיות קבועות של גלוטרדהיד. עם זאת, מבני התאים של אצות ירוקות במים מתוקים חיים נהרסו על ידי היווצרות גביש קרח. ערבוב תאים עם אלבומין סרום בקר 20% (BSA) הבטיח כי ההשמדה האולטרה-מבנית נשמרה היטב ללא נזק לקרח. השימוש של 20% BSA היה מועיל גם לשימור אולטרה מבנה של תאי גבעול של פטרייה. ניסויים על הקפאת תאים ורקמות צמח על ידי החלת 20% BSA נמשכים. למרות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים של דגימות הקפאה-הקפאה סנדוויץ 'לא נוסה, תצפית של מבני תאים שמורים היטב דווחה בעבר9.

הערות על שיטת הקפאת הכריך
ההשמדה האולטרה-מבנית של התאים היא הטובה ביותר על ידי הקפאה מהירה והקפאה של תאים חיים. היווצרות גבישי קרח עם SFD ניתן להימנע על ידי הגבלת עובי התאים ≤30 מיקרומטר1. תיקון רקמות עם גלוטרלדהיד לעתים קרובות מניב שימור טוב יותר של מבנה התא להתבוננות בתאים בתרבית השעיה מכיוון קיבעון glutaraldehyde הופך את מבנה התא נוקשה יותר ומונע את השינויים האולטרה-מבניים האפשריים במהלך איסוף וצנטריפוגה של תאים חיים1. קיבוע גלוטרדהיד מאפשר גם את הארכת עומק ההקפאה עד 0.2 מ"מ1, בדומה לזו שהושגה בשיטת הקפאה בלחץ גבוה (HPF). לכן, ניתן להחליף את מכונת HPF ב- SFD להקפאה עמוקה של רקמות בעלי חיים ובני אדם.

כי רקמות קבוע glutaraldehyde ניתן לאחסן במשך יותר מ 2 שנים28, הקפאת כריך יכול להתבצע על פי הנוחות של המשתמש. תיקון רקמות עם glutaraldehyde גם מקל על חלוקת רקמות כי הרקמות להיות נוקשה יותר עם קיבעון. שלא כמו מכונת HPF, ה- SFD יכול לשמש להקפאה מהירה של וירוסים למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית ולתאים אאוקריוטים. יתר על כן, בהשוואה למכונת HPF, ה- SFD קטן, נייד, פחות יקר, וניתן לרכוש אותו על ידי מעבדות נוספות. אנו מקווים כי תכונות אלה של SFD לעזור מעבדות נוספות להשיג את מטרות המחקר שלהם28.

תכונות של המורפולוגיה הטבעית של תאים
מבני התאים נמצאים במצבם הטבעי אם הם מראים את המראה הבא: מבני הממברנה של הממברנה החיצונית (איור 12A, B), קרום פלזמה ( איור12B,C; איור 13א-ד; ואיור 14E), מעטפת גרעינית (איור 12C, איור 13B-D, ואיור 14D-E), מיטוכונדריה ( איור12C, איור 13C, ואיור 14D), וחלילים ( איור12C) להראות קווי המתאר החלקים. הגרעין והחיילות כמעט עגולים(איור 12C). ריבוזומים מראים מראה ברור של אלקטרון צפוף בקוטר של כ-20 ננומטר(איור 12B,C; איור 13C; ואיור 14D). הציטופלסמה היא אלקטרון-רווחי (איור 12B, C; איור 13C; ואיור 14D).

ההשפעה של קיבוע גלוטרדהיד על מורפולוגיה של תאים
קיבוע גלוטרדהיד בוצע עבור רקמות בעלי חיים או בני אדם לפני הקפאת כריך כדי להשיג אולטרה-מבנה נטול קריסטל קרח. המיקרוגרפים שהתקבלו בשיטה זו מראים תמונות ברורות להפליא דומות לאלה שהושגו על ידי הקפאה מהירה של רקמות חיות (איור 14)1. המחקרים על תאי שמרים, מיקרואורגניזמים במעמקי הים ותאים מתורבתים מראים כי העיוות של אולטרה מבנה נובע בעיקר קיבעון אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אתנול בטמפרטורת החדר1,17,18,28. סמול דיווח גם כי למרות קיבוע glutaraldehyde אינו להרוס את הארגון של actin בפיברובלסטים תרבותיים, קיבוע אוסמיום tetroxide והתייבשות על ידי אצטון או אתנול בטמפרטורת החדר להרוס actin ארגון62.

לפיכך, מחקר מפורט על ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde על מורפולוגיה התא צריך להתבצע. אונו פיתחה שיטת קריופיקסיציה in vivo שבה רקמות חיות קפואות במהירות מבלי לעצור את אספקת הדם63. הרקמות הוחלפו בהקפאה והוטמעו בשרף אפוקסי, וקטעים אולטרה-דקים נצפו. התמונות המיקרוסקופיות של האלקטרונים הראו את ההשמדה האולטרה-מבנית הקרובה ביותר לילידית של רקמות חיות בהשוואה לאלו שהושגו על ידי התייבשות כימית-קונבנציונלית ועל ידי הקפאה מהירה של רקמות טריות שלא התמלאו. לכן, זה עשוי להיות מעניין להשוות את ההשמדה ultrastructure המתקבל על ידי תחליף קיבוע גלוטרלדהיד (השיטה הנוכחית) ואלה על ידי in vivo cryofixation-הקפאת תחליף כדי לבחון את ההשפעות של קיבוע glutaraldehyde.

התחשבות בסביבה ויעילות ניסיונית מוגברת
אנו משתמשים בצינורות פלסטיק 2 מ"ל להחלפת השרף. ML אחד של שרף מדולל מספיק לכל שלב החלפה. צינורות הפלסטיק המשומשים עשויים להיות מושלכים לאחר כל ניסוי. זה יכול לחסוך זמן ומאמץ לשטיפת בקבוקוני זכוכית כאשר הם משמשים להחלפת שרף. בנוסף, פתרון אצטט אורניל ניתן להשתמש שוב ושוב עבור סעיף כתמים32. לאחר הכתמת החלקים, ניתן לשמור ולהשתמש מחדש בפתרון אצטט אורניל. כמו אצטט אורניל הוא חומר רדיואקטיבי, השימוש החוזר שלה מסייע למנוע את הדור של פסולת ותורם להגנה על הסביבה.

סרט נפטלין עם פילם פילמרי פלזמה
סרט נפטלין פלזמה-פילמרי הוא סרט פחמן פולימרי תלת מימדי עשוי גז נפטלין על ידי פילמור פלזמה תחתפריקה זוהרת 33. הסרט עמיד בפני הפגזת אלקטרונים וכימיקלים, נקי מאוד, שקוף מפני אלקטרונים, ויש לו משטח שטוח ומבנה אמורפי. לכן, סרט נפטלין פלזמה פולימר, אשר זמין מסחרית, הוא מעולה ומומלץ כסרט תמיכה.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

ללא

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials - Scintillation counter vials for fixative
Acetone -
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Slide glass -
Double-sided adhesive tape -
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Several pairs
Tweezers with polystyrene foam - One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen -
Propane gas - Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette - For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container - 50 mL and 200 mL
Ethane gas - Cryogen
2 mL Eppendorf tubes - For embedding
Disposable plastic syringes - 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer -
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater - For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Super Support Film Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo 647
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, In Japanese 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

Tags

ביולוגיה גיליון 173 מיקרוסקופיית אלקטרונים הקפאה-החלפה רקמות קבועות גלוטרלדהיד הקפאה בלחץ גבוה הטמעת קרח תאים חיים הקפאת צלילה הקפאה מהירה הכנת דגימה מכשיר הקפאת כריך אולטרה-מבנה מקטעים אולטרה-דקים
הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi,… More

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter