Summary
Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.
Abstract
Chemische fixatie is gebruikt voor het observeren van de ultrastructuur van cellen en weefsels. Deze methode behoudt echter niet voldoende de ultrastructuur van cellen; artefacten en extractie van celinhoud worden meestal waargenomen. Snel invriezen is een beter alternatief voor het behoud van de celstructuur. Sandwichvriezen van levende gist of bacteriën gevolgd door vriessubstitutie is gebruikt voor het observeren van de prachtige natuurlijke ultrastructuur van cellen. Onlangs is sandwichbevriezing van glutaaraldehyde-gefixeerde gekweekte cellen of menselijke weefsels ook gebruikt om de ultrastructuur van cellen en weefsels te onthullen.
Deze studies zijn tot nu toe uitgevoerd met een handgemaakt sandwich-vriesapparaat en toepassingen voor studies in andere laboratoria zijn beperkt. Een nieuw sandwich vriesapparaat is onlangs gefabriceerd en is nu commercieel verkrijgbaar. Het huidige artikel laat zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. Ook getoond is de voorbereiding van monsters voor ultradunne secties na snel invriezen en procedures voor vriesvervanging, harsinbedding, trimmen van blokken, snijden van ultradunne secties, terugwinnen van secties, kleuren en bedekken van roosters met steunfilms.
Introduction
Elektronenmicroscopie is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van cel-ultrastructuur. Chemische fixatie met conventionele dehydratieprocedures is gebruikt voor het observeren van de ultrastructuur van cellen en weefsels. Deze methode behoudt echter niet voldoende de ultrastructuur van cellen en artefacten en de extractie van celinhoud worden meestal waargenomen. Snelle bevriezing en vriessubstitutie van cellen en weefsels zijn betere alternatieven voor het behoud van de celstructuur.
Drie belangrijke methoden zijn gebruikt voor het snel invriezen van cellen1:1) plunge-freezing wordt uitgevoerd door monsters in een gekoeld cryogeen, zoals propaan, te storten en werd gebruikt sinds de vroege jaren 19502; 2) koud metaalblokvriezen wordt uitgevoerd door cellen en weefsels snel op een metalen blok te slaan dat is gekoeld met vloeibare stikstof of vloeibaar helium3,4; en 3) hogedrukbevriezen gebeurt door cellen en weefsels met vloeibare stikstof onder hoge druk te bevriezen5,6,7.
Sandwichvriezen is een soort plunge-freezing die wordt uitgevoerd door dunne biologische materialen tussen twee koperschijven te sandwichen en ze snel in te vriezen door ze in vloeibaar propaante storten 8,9,10. Bij deze methode worden zeer dunne monsters (een paar micrometer dik) snel gekoeld met cryogeen met behulp van een metaal dat aan beide zijden een goede thermische geleidbaarheid heeft. Deze methode verwijdert dus effectief warmte van de monsters, waardoor het mogelijk is om cellen stabiel te bevriezen zonder schade aan ijskristallen. Sandwichvriezen, gevolgd door vriessubstitutie van levende gist en bacteriële cellen, onthult de natuurlijke ultrastructuur van cellen10,11,12,13,14,15,16.
Onlangs is gebleken dat deze methode nuttig is voor het bewaren van heldere celbeelden van glutaaraldehyde-gefixeerde micro-organismen17,18,19,20,21,22,23,24,gekweekte cellen25,26,27en menselijke cellen en weefsels1,28 . Hoewel deze studies zijn uitgevoerd met behulp van een handgemaakt sandwich-vriesapparaat29en toepassingen voor andere studies in andere laboratoria beperkt zijn, is een nieuw sandwich-vriesapparaat (SFD) vervaardigd28 en is het nu commercieel verkrijgbaar.
Het huidige artikel laat zien hoe de SFD kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. Ook getoond is de voorbereiding van monsters voor ultradunne secties na snel invriezen, evenals procedures voor vriesvervanging, harsinbedding, trimmen van blokken, snijden van ultradunne secties, herstellen van secties, kleuren en afdekken van roosters met ondersteunende films.
Protocol
OPMERKING: Het protocol van de studie voor menselijke monsters werd goedgekeurd door de Biomedical Research Ethics Committee van de Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmiumtetroxide is een gevaarlijke chemische stof; het moet worden behandeld met handschoenen in de zuurkast. Figuur 1 toont het sandwich-vriesapparaat en de benodigde gereedschappen28. Figuur 2 toont de materialen die nodig zijn om sandwich-vriesexperimenten uit te voeren. Glazen injectieflacons worden gevuld met aceton dat osmiumtetroxide bevat en tot gebruik op -80°C gehouden(figuur 2B). Koperen schijven hebben een diameter van 3 mm, hebben geen gaten, hebben een letter aan één kant en zijn in de handel verkrijgbaar(figuur 2C).
1. Snelle bevriezing van celsuspensies voor vriesvervanging
OPMERKING: De hele procedure is weergegeven in figuur 3.
- Cellen
- Gebruik celsuspensies van bacteriën, gist(figuur 2A),gekweekte cellen en geïsoleerde cellen voor het invriezen van sandwichs.
OPMERKING: Zowel levende als glutaaraldehyde-vaste cellen kunnen worden gebruikt28.
- Gebruik celsuspensies van bacteriën, gist(figuur 2A),gekweekte cellen en geïsoleerde cellen voor het invriezen van sandwichs.
- Bereiding van vloeibaar propaan
OPMERKING: Gebruik cryogloves en brillen bij het hanteren van vloeibare stikstof. Omdat propaan explosief is, moet ervoor worden gezorgd dat er geen branden in dezelfde kamer worden gebruikt en moeten ramen open worden gehouden.- Vul de vloeibare stikstofcontainer van de SFD met vloeibare stikstof(figuur 4A). Vul de vloeibare propaancontainer met vloeibaar propaan door propaangas in te brengen met behulp van een fijn mondstuk(Figuur 4B,C). Versnel de stolling van propaan met behulp van een gekoelde metalen staaf(figuur 1 en figuur 4D,E).
- Voorbereiding van koperen schijven
- Plaats koperen schijven op een schuifglas met de no-letter-side naar boven (Figuur 2D) en behandel met gloethenontlading bij 10 Pa, 400 volt, 1 mA gedurende 30 s (Figuur 4F,G) om het schijfoppervlak hydrofiel te maken met behulp van een ionensputterapparaat30.
- Sandwichen en invriezen van de celsuspensie
- Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 2 ml(figuur 5A)en centrifugeer met 2.900 × g gedurende 10 s bijkamertemperatuur (figuur 5B,C). Verwijder het supernatant en hang de pellet op om een dikke suspensie te verkrijgen (zie discussie).
- Plaats een kleine hoeveelheid van de celsuspensie (~ 0,02 μL) op een koperen schijf(figuur 5D-F),bedek deze met een andere koperen schijf(figuur 5G)en pak de schijven op met een pincet(figuur 5H).
OPMERKING: Om ~ 0,02 μL van de celsuspensie te meten, observeer 0,1 μL druppels van de suspensie onder de stereomicroscoop en verdeel ze in druppels die1/5e van dit volume zijn. - Maak een put in het midden van het vaste propaan met de dunne metalen staaf(Figuur 5I). Zet het pincet in een SFD en vries ze snel in door op de injectieknop van het apparaat te drukken(Figuur 5J,K).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de monsters niet worden gedroogd en de twee schijven niet volledig over elkaar worden gelegd (anders zou het losmaken ervan in de volgende stap erg moeilijk worden).
- Sandwichen en invriezen van dierlijke en menselijke weefsels
- Gebruik dierlijke en menselijke weefsels (~ 0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde-0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) (Figuur 6A,B). Snijd ze in 0,1- tot 0,2- mm dikke secties met een scheermesje onder een stereomicroscoop(Figuur 6C,D).
- Plaats een kleine druppel (~ 0,02 μL) glutaaraldehyde-oplossing op een koperen schijf(Figuur 6E,F). Gebruik vervolgens een pincet om een stuk weefsel in het glutaaraldehyde op de koperen schijf te plaatsen (Figuur 6G,H) en bedek het met een andere koperen schijf ( Figuur6I-K).
- Vries de schijven met de weefsels in het smeltende propaan van de SFD snel in, zoals beschreven in rubriek 1.4 (Figuur 5J,K).
OPMERKING: Aangezien glutaaraldehyde een gevaarlijke chemische stof is, moet het worden behandeld met handschoenen in de zuurkast. Weefsels mogen niet worden gewassen met buffers wanneer ze op een koperen schijf worden geplaatst, maar gedrenkt in glutaaraldehyde-oplossing worden bewaard, omdat glutaaraldehyde een antivrieseffect heeft1.
- Gebruik dierlijke en menselijke weefsels (~ 0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde-0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) (Figuur 6A,B). Snijd ze in 0,1- tot 0,2- mm dikke secties met een scheermesje onder een stereomicroscoop(Figuur 6C,D).
- Vriessubstitutie met osmiumaceton
- Breng de schijven over in vloeibare stikstof in een werkbad(figuur 7A,B). Met behulp van een pincet gekoeld in vloeibare stikstof, maak de schijven van elkaar los om het monster bloot te leggen (Figuur 7C-E).
- Plaats de schijven met de cellen in een glazen injectieflacon (figuur 7F) die is gevuld met 1 ml aceton met 2% osmiumtetroxide (figuur 2B) die in vloeibare stikstof is geplaatst en gestold (figuur 4H).
- Breng de schijven over naar een diepvriezer en bewaar ze gedurende 2-4 dagen op -80 °C voor vriessubstitutie van de cellen(figuur 3). Week het gebruikte pincet in water op kamertemperatuur om ze te verwarmen (Figuur 7G) voor het bevriezen van de volgende exemplaren.
OPMERKING: Pincetten voor het hanteren van het monster moeten warm zijn (kamertemperatuur) omdat een koud pincet het monster kan bevriezen voordat het snel bevriest, wat leidt tot de vorming van ijskristallen.
- Monsteropwarming en inbedding
- Breng de monsters geleidelijk op kamertemperatuur (2 uur bij -20 °C, 2 uur bij 4 °C en 15 minuten bij kamertemperatuur, figuur 3 en figuur 8A) en breng de schijven over naar plastic buizen van 2 ml die zijn gevuld met 1 ml aceton (figuur 3 en figuur 8B,C).
- Bereid epoxyhars door de reagentia in een plastic wegwerpcontainer te mengen met behulp van een roerder(Figuur 8D-F).
- Wissel de aceton in stap 1.7.1 achtereenvolgens af met 30% hars (in aceton), 60% hars en 90% hars bij kamertemperatuur gedurende elk 1 uur. Vervang vervolgens de 90% hars met 100% hars bij 37°C een nacht. Sluit ten slotte de monsters in 100% hars(figuur 8G-J)in de siliconen inbeddingsmal en polymeriseer ze bij 60 °C gedurende 24 uur(figuur 3).
OPMERKING: De monsters moeten gedurende de hele procedure aan de koperen schijven blijven vastzitten (om het doorsnijden gemakkelijker te maken). Het gebruik van een roterend of schuddend apparaat wordt niet aanbevolen tijdens het inbeddingsproces omdat ze weinig bijdragen aan de penetratie van de hars in de cel. Bovendien zorgt de trilling van het apparaat er soms voor dat de monsters loskomen van de koperschijven. Incubatie bij 37 °C 's nachts zou de penetratie van de hars in de cel versnellen als gevolg van thermische energie (de hars zou niet polymeriseren omdat het geen versneller bevat).
- Trimmen van specimenblokken
- Verwijder de gepolymeriseerde blokken uit de silicium insluitvormen(figuur 9A). Schrijf het specimennummer op het blok (figuur 9B).
- Verwijder de koperen schijven uit het blok met een scheermesje(figuur 9C,D)en snijd de monsters die op het blokoppervlak zijn ingebed tot 0,7 mm x 0,7 mm met behulp van een ultrasoon trimmesje (figuur 9E) en scheermesjes ( figuur9F-H) onder een stereomicroscoop31.
- Plaats het blok in een monsterhouder van een ultramicrotoom (Figuur 9I) en snijd de voorkant van het blok glad met een diamantsnijmes (Figuur 9J,K).
- Ultradunne secties snijden
- Verwijder het blok van de ultramicrotoom(Figuur 10A)31,zet het in een stereomicroscoop en trim het verder tot 0,2 mm x 0,3 mm met een scheermesje(Figuur 10B,C).
- Breng neopreen aan op de roosters om ze klevend te maken(figuur 10D). Plaats het blok terug op de ultramicrotoom, bedek de ultramicrotoom met een plastic deksel(figuur 10E)31en snijd 50-70 nm dikke secties (figuur 10F-H).
- Haal de secties op met behulp van een lus(figuur 10I),monteer ze op 300 of 400 gaas koperen roosters behandeld met neopreen en droog ze (figuur 10J).
- Kleuring van secties en observatie onder de elektronenmicroscoop
- Stel de roosters in met secties in de groef van de halve siliconenbuis (Figuur 11A)31en week in uranylacetaatoplossing en loodcitraat gedurende 3 minuten elk voor kleuring (Figuur 11B-E)32.
- Voor gist- en schimmelmonsters plaatst u de roosters op een filterpapier (4 mm x 4 mm), pakt u ze op met een pincet en bedekt u ze met plasmapolymeriseerde naftaleenfilm33 op het wateroppervlak (Figuur 11F,G). Plaats de roosters in een elektronenmicroscoop en observeer bij 100 kV (Figuur 11H, I).
2. Snelle bevriezing van virussen en macromoleculen
- Bereiding van vloeibaar ethaan
OPMERKING: Gebruik cryogloves en brillen bij het hanteren van vloeibare stikstof. Omdat ethaan explosief is, moet ervoor worden gezorgd dat er geen branden in dezelfde kamer worden gebruikt en moeten ramen open worden gehouden. Ethaan wordt gebruikt omdat het verdampt in de elektronenmicroscoop, terwijl propaan dat niet doet.- Vul de vloeibare stikstof container van de SFD met vloeibare stikstof. Vul de vloeibare ethaancontainer met vloeibaar ethaan door ethaangas door een fijn mondstuk in te brengen.
- Voorbereiding en snel invriezen van microgrids en specimens
- Maak beide vlakken van de microgrids hydrofiel door ze te behandelen met gloemontlading (10 Pa, 400 V, 1 mA) met behulp van een ionensputterapparaat30.
- Stel het microgrid in de SFD in en breng 2 μL van het virus of macromoleculaire suspensie (1 mg eiwit / ml) aan op de microgrids. Verwijder overtollige vloeistof met behulp van filtreerpapier en vries het microgrid snel in door op de injectieknop van het apparaat te drukken.
- Instelling van het bevroren microgrid in een cryo-transferhouder en observatie onder de elektronenmicroscoop
- Breng de bevroren microgrids over in vloeibare stikstof, ingesteld in een cryo-transferhouder die vooraf is gekoeld bij vloeibare stikstoftemperatuur, en observeer onder een elektronenmicroscoop bij lage temperatuur34.
Representative Results
Levende cellen van micro-organismen in suspensie werden verzameld door centrifugatie, ingeklemd tussen twee koperen schijven, snel bevroren met SFD, bevroren vervangen, ingebed in epoxyhars, ultradunne sectie, gekleurd en waargenomen onder een elektronenmicroscoop door de hierboven beschreven procedures te volgen. Figuur 12 toont ultradunne secties van Escherichia coli (bacteriën, figuur 12A,B)16 en Saccharomyces cerevisiae (gist, figuur 12C)15. Merk op dat de afbeeldingen zeer duidelijk zijn en een natuurlijke morfologie laten zien.
Glutaaraldehyde-vaste celsuspensies van gekweekte cellen en geïsoleerde dierlijke cellen werden verzameld en snel ingevroren met SFD, bevroren gesubstitueerd en waargenomen onder een elektronenmicroscoop door de hierboven beschreven procedures te volgen. Figuur 13 toont ultradunne delen van gekweekte cellen (Figuur 13A-C)1,28 en geïsoleerde cellen uit de buikholte van muizen ( Figuur13D)28. Figuur 14 toont ultradunne delen van de menselijke huid (Figuur 14A-D) en buffy vacht ( Figuur14E)1. Merk op dat de afbeeldingen ook erg duidelijk zijn en een natuurlijke morfologie laten zien. Figuur 15 toont kerndeeltjes van het hepatitis B-virus die snel bevroren zijn met SFD en waargenomen door cryo-elektronenmicroscopie34. Net als bij de andere cellen zijn de beelden zeer duidelijk en vertonen ze een natuurlijke morfologie.
Figuur 1: Sandwich vriesapparaat28 en de benodigde gereedschappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Materialen die nodig zijn voor het invriezen van sandwichen. (A) Specimen: Lichte micrografie van Saccharomyces cerevisiae (gist). Schaalbalk = 10 μm. (B) Glazen injectieflacons (10 ml) met 1 ml aceton met 2% osmiumtetroxide. (C) Koperen schijven met een oppervlak zonder letter (links) en een oppervlak met een letter (rechts). Schaalbalk = 3 mm. Scanning elektronenmicroscopie. (D) Koperen schijven zonder letterzijde omhoog werden op een glasplaat geplaatst met dubbelzijdig plakband (*). Schaalbalk = 3 mm. (E) Een tweesnijdend scheermes en een gebroken tweesnijdend scheermes voor het snijden van dierlijke en menselijke weefsels, een enkelzijdig scheermes voor het trimmen van blokken en versnipperd karton voor het snijden van dierlijke en menselijke weefsels. (F) Pincet met geëxtrudeerd polystyreenschuim om de vingers te beschermen tegen de kou. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Monsterbereiding van celsuspensies met behulp van de sandwichbevriezingsmethode. Afkortingen: r.t. = kamertemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bereiding van vloeibaar propaan, koperschijven en fixatief. (A) Vloeibare stikstof (pijl) werd in de vloeibare stikstofcontainer van het sandwichbevriezingsapparaat gegoten. (B) Propaangas werd via een fijn mondstuk in een vloeibare propaancontainer gebracht. (C) Vloeibaar propaan (pijl). (D) Een metalen staaf (pijl) werd gebruikt om vloeibaar propaan af te koelen om de stolling van vloeibaar propaan te versnellen. (E) Gestold propaan (pijl). (F) Ionen sputter apparaat (pijl) voor het hydrofiel maken van koperschijven met gloedafscheiding. (G) Gloeiend ontlading. (H) Glazen injectieflacons geplaatst in vloeibare stikstof in een werkbad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Snelle bevriezing van celsuspensie (gist) met behulp van de sandwich-vriesinrichting. (A) Overdracht van gistcultuur in de centrifugebuis. (B) Microcentrifuge. (C) Pellet van Saccharomyces cerevisiae in de centrifugebuis (pijl). D)Het monster overbrengen met een micropipette uit de centrifugebuis. (E) Het monster op de koperen schijf plaatsen. (F) Een kleine druppel van een monster op de koperen schijf (pijl). (G) Het monster bedekken met een andere koperen schijf. (H) De twee schijven oppakken met een pincet. (I) Het maken van een put in het vaste propaan met behulp van de dunne metalen staaf. (J) Dompel het bevriezen van het monster door op de injectieknop te drukken. (K) Invriezen is voltooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbereiding van een monster van menselijke weefsels (huid). (A, B) Menselijk huidweefsel gefixeerd in glutaaraldehyde in een petrischaaltje. Schaalbalk = 5 mm. (C, D) Weefsels (pijl) werden gesneden met behulp van twee tweesnijdende scheerapparaten op een versnipperd bord. (E, F) Een kleine druppel glutaaraldehyde-oplossing (pijl) werd op een koperen schijf geplaatst. (G, H) Een stukje huidweefsel werd met een pincet op de koperen schijf geplaatst. (I) Een andere schijf werd gebruikt om de koperen schijf met het huidweefsel te bedekken. (J) De ingeklemde schijven werden met een pincet opgehaald. (K) De ingeklemde schijven werden voorzichtig vastgehouden met een pincet. Let op de opening tussen de pincetpunten (pijl) die wordt gehandhaafd om te voorkomen dat de weefsels worden verbrijzeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Het monster overbrengen in vloeibare stikstof en de schijven losmaken. (A) De schijven overbrengen (pijl) in vloeibare stikstof in een werkbad. (B) Schijven in vloeibare stikstof (pijl). (C) Pincetten werden in vloeibare stikstof geplaatst om ze in het werkbad te koelen. (D, E) Het losmaken van de koperen schijven (pijlen) met een pincet. (F) Breng de schijf (pijl) over in de glazen injectieflacon met een pincet. (G) Het pincet opwarmen in water om het volgende exemplaar in te vriezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Monsterverwarming en inbedding. (A) Monsters in glazen injectieflacons bij kamertemperatuur. (B) Overbrengen van de schijven (pijl) in een 2 ml plastic buis met pincet. (C) Koperen schijven (pijl) in aceton in een plastic buis. (D) Het meten van harsen met een injectiebuis (pijl). (E) Breng de hars over in een wegwerpbeker (pijl). (F) Het mengen van de hars met behulp van een roerder. (G) Een kleine hoeveelheid hars werd in de gaten van de siliconen inbeddingsvorm geplaatst. (H) Overtollige hars in de roosters werd verwijderd met filterpapier. (I, J) Koperen schijven met monsters werden in de bodem van de gaten van de inbeddingsvorm geplaatst met het monster naar boven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Bijsnijden van het monsterblok. (A) Het verwijderen van gepolymeriseerde blokken uit de inbeddingsmallen. (B) Specimennummer werd op het blok geschreven. (C, D) De koperen schijf werd met een scheermes uit het blok gehaald. Schaalbalk voor (D) = 1 mm. (E-G) Het monster werd bijgesneden met een ultrasoon snijmesje en een scheermesje. Schaalbalk voor (G) = 1 mm. (H) Hoge vergroting van (G). Een individueel lichtpuntje is een cel. Cellen werden ingebed in een enkele laag10. Schaalbalk = 10 μm. (I-K) Het oppervlak van het blok werd glad gesneden met een diamantsnijmes. Schaalbalk voor (K) = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Snijden van ultradunne secties. (A) Het monsterblok werd verwijderd van de microtoom31. (B, C) Het exemplaar werd verder bijgesneden met een scheermesje. Schaalbalk voor (C) = 0,5 mm. (D) Neopreen werd op roosters aangebracht om ze te laten plakken. (E) De ultramicrotoom was bedekt met plastic om luchtstroom tijdens ultradunne secties te voorkomen. (F) De diamantmesboot was gevuld met water. (G, H) Ultradunne secties werden gesneden tot een dikte van 70 nm. Schaalbalk voor (H) = 1 mm. (I, J) De secties werden met behulp van een lus opgehaald en vervolgens gedroogd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Kleuringssecties. (A) De roosters werden in de groef van de halve siliconenbuis geplaatst. (B) Ze werden gedrenkt in uranylacetaat voor kleuring. (C) Het gebruikte uranylacetaat werd verzameld op zelfdichtende wasachtige folie. (D) De roosters werden gewassen met een waterstraal en (E) vervolgens gedrenkt in loodcitraat. (F) Plasma-gepolymeriseerde naftaleenfilm werd op water gedreven en (G) gebruikt om een rooster te bedekken dat op filterpapier van 4 mm x 4 mm was geplaatst. (H) Het raster werd in een monsterhouder geplaatst en (I) waargenomen in een elektronenmicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Ultradunne secties van Escherichia coli (bacteriën, A, B) en Saccharomyces cerevisiae (gist, C). (A) Merk op dat monsters dicht en homogeen zijn ingebed en geen vervorming vertonen. (B, C) Membraanstructuren vertonen een duidelijke en gladde morfologie en ribosomen zijn duidelijk genoeg dat elk deeltje kan worden opgesomd16. (C) Gistkern en vacuolen vertonen een echte cirkelvorm, wat hun natuurlijke morfologie kan zijn. De matrix van de mitochondriën vertoont een elektronendicht uiterlijk, wat een kenmerk kan zijn van levende cellen die worden gefixeerd door snel bevriezen. Schaalbalken = 1 μm. Afkortingen: CW = celwand; ER = endoplasmatisch reticulum; NM = kernmembraan; NP = nucleaire poriën; OM = buitenmembraan; PM = plasmamembranen; R = ribosomen; N = kern; M = mitochondriën. (B) is met toestemming overgenomen uit Yamada et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Ultradunne secties. (A-C) K562 gekweekte cellen. (D) Een geïsoleerde mestcel van de muis. (A) Merk op dat monsters dicht en homogeen zijn ingebed en geen vervorming vertonen. Schaalbalk = 20 μm. (B-D) Bij hoge vergroting worden kern, nucleolus, kernmembraan, nucleaire poriën, endoplasmatisch reticulum, mitochondriën, ribosomen en korrels duidelijk waargenomen. Schaalstaven = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Afkortingen: N = nucleus; Nu = nucleolus; NM = kernmembraan, NP = kernporiën; ER = endoplasmatisch reticulum; M = mitochondriën; R = ribosomen; G = korrels; D = delende cellen. (A) is overgenomen van Yamaguchi et al.1 met toestemming. (B-D) zijn overgenomen van Yamaguchi et al.28 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 14: Ultradunne secties. (A-D) menselijke huid en (E) buffy vacht. (A-E) Merk op dat weefsel- en celbeelden helder en natuurlijk zijn en een goed contrast vertonen, hoewel de secties erg dun zijn (50 nm). De matrix van de mitochondriën vertoont een dicht uiterlijk, dat vergelijkbaar is met die van dichte mitochondriale matrices van snel bevroren levende cellen (D). Schaalstaven = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Afkortingen: D = desmosomes; ER = endoplasmatisch reticulum; K = keratinocyt; KF = keratinevezels; M = mitochondriën; N = kern; NM = kernmembraan; P = bloedplaatje; R = ribosomen; W = witte bloedcellen. Overgenomen van Yamaguchi et al.28 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 15: Kerndeeltjes van het Hepatitis B-virus (HBV) snel ingevroren met vloeibaar ethaan met behulp van het sandwichbevriezingsapparaat en waargenomen door cryo-elektronenmicroscopie. Bolvormige holle deeltjes zijn HBV-kerndeeltjes. Schaalbalk = 100 nm. Afkortingen: HBV = hepatitis B virus; I = ijs. Overgenomen van Yamaguchi et al.28 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De volgende discussie is gebaseerd op meer dan 120 sandwich freezing-freeze substitutie-experimenten op meer dan 1.000 monsters en meer dan 70 plunge-freezing-cryo-electron microscopie-experimenten op meer dan 75 monsters uitgevoerd gedurende 36 jaar.
Slagingspercentage voor goed invriezen door sandwich invriezen
De mate van succes bij het bereiken van een goede bevriezing hangt af van de monsters. Saccharomyces cerevisiae (gist) cellen gekweekt in YPD medium (1% gist extract, 2% pepton, 2% dextrose) gaven bijna 100% succes voor goed bevriezen zonder ijskristalvorming10,11,15,35,36. Andere gistsoorten, waaronder Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57en Trichosporon, toonden ook een goede bevriezing. Ook bacteriën, waaronder Mycobacterium58,59 en E. coli16, vertoonden een goede bevriezing. Gekweekte cellen en geïsoleerde dierlijke cellen vertoonden een goede bevriezing voor zowel levende als glutaaraldehyde-vaste cellen1,25,26,27,60. Glutaaraldehyde-gefixeerde dierlijke en menselijke weefsels gesneden tot 0,1 tot 0,2 mm dikte vertoonden ook een goede bevriezing meestal1,28.
Voorwaarden voor een goede bevriezing
Gebruik alleen cellen in de juiste groeifase en conditie. Cellen in cultuur moeten zich in de exponentiële fase bevinden. Breng zeer kleine hoeveelheden celsuspensies van geconcentreerde monsters (voor S. cerevisiae, ~ 0,02 μL van 3-5 × 109 cellen / ml) aan op de koperen schijf. Glutaaraldehyde-gefixeerde plakjes dierlijk of menselijk weefsel moeten ook erg klein zijn (bij voorkeur 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Omdat het snijden van 0,1 mm dikke plakjes weefsel moeilijk is, snijdt u veel weefsels en selecteert u dunne en halftransparante plakjes. Werk snel maar voorzichtig en laat de monsters niet uitdrogen. Bij het oppakken van de gestapelde koperen schijven met een pincet, druk niet te hard op de schijven om te voorkomen dat de cellen en weefsels worden verbrijzeld. Het laden van monsters is de belangrijkste stap voor succesvol invriezen en de vereiste omstandigheden zijn dezelfde als de voorwaarden voor goed invriezen voor hogedrukbevriezing. Lezers moeten verwijzen naar de uitstekende recensie van McDonald61.
Andere toepassingen
Dit artikel presenteert elektronenmicrofoto's van een bacterie, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde dierlijke cellen, menselijke weefsels en virusdeeltjes. We zagen een goede bevriezing van geglutaraldehyde-gefixeerde zeealgen. De celstructuren van levende zoetwatergroenalgen werden echter vernietigd door ijskristalvorming. Het mengen van cellen met 20% runderserumalbumine (BSA) zorgde ervoor dat de ultrastructuur goed bewaard bleef zonder schade aan ijskristallen. Het gebruik van 20% BSA was ook gunstig voor het behoud van de ultrastructuur van stengelcellen van een paddenstoel. Experimenten met het bevriezen van plantencellen en weefsels door het toepassen van 20% BSA zijn aan de gang. Hoewel scanning elektronenmicroscopie van sandwich freezing-freeze-gesubstitueerde monsters niet is geprobeerd, is eerder observatie van goed bewaard gebleven celstructuren gemeld9.
Opmerkingen over de methode om boterhammen in te vriezen
De dicht bij-inheemse ultrastructuur van cellen wordt het best waargenomen door snelle bevriezing en bevriezingssubstitutie van levende cellen. IJskristalvorming met de SFD kan worden vermeden door de dikte van cellen te beperken tot ≤30 μm1. Het fixeren van weefsels met glutaaraldehyde levert vaak een beter behoud van de celstructuur op voor het observeren van suspensie-gekweekte cellen, omdat glutaaraldehydefixatie de celstructuur stijver maakt en de mogelijke ultrastructurele veranderingen tijdens het verzamelen en centrifugeren van levende cellen voorkomt1. Glutaaraldehydefixatie maakt ook de uitbreiding van de vriesdiepte tot maar liefst 0,2 mm1mogelijk, vergelijkbaar met die bereikt door de hogedrukbevriezingsmethode (HPF). Daarom kan de HPF-machine worden vervangen door de SFD voor het diepvriezen van dierlijke en menselijke weefsels.
Omdat glutaaraldehyde-gefixeerde weefsels langer dan 2 jaaren 28kunnen worden bewaard, kan het invriezen van sandwichen worden uitgevoerd volgens het gemak van de gebruiker. Het fixeren van weefsels met glutaaraldehyde vergemakkelijkt ook weefselsectie omdat de weefsels stijver worden met fixatie. In tegenstelling tot de HPF-machine kan de SFD worden gebruikt voor het snel invriezen van virussen voor cryo-elektronenmicroscopie en voor bacteriën en eukaryote cellen. Bovendien is de SFD in vergelijking met de HPF-machine klein, draagbaar, minder duur en kan deze door meer laboratoria worden verkregen. We hopen dat deze kenmerken van de SFD meer laboratoria helpen hun onderzoeksdoelen te bereiken28.
Kenmerken van de natuurlijke morfologie van cellen
Celstructuren bevinden zich in hun natuurlijke staat als ze het volgende uiterlijk vertonen: Membraanstructuren van het buitenmembraan (Figuur 12A, B), plasmamembraan ( Figuur12B,C; Figuur 13A-D; en figuur 14E), nucleaire enveloppe (figuur 12C, figuur 13B-Den figuur 14D-E), mitochondriën ( figuur12C, figuur 13Cen figuur 14D) en vacuolen ( figuur12C) vertonen vloeiende contouren. De kern en vacuolen zijn bijna cirkelvormig (figuur 12C). Ribosomen vertonen een helder elektrondicht uiterlijk met een diameter van ~20 nm (Figuur 12B,C; Figuur 13C; en figuur 14D). Het cytoplasma is elektron-lucent (Figuur 12B,C; Figuur 13C; en figuur 14D).
Effect van glutaaraldehydefixatie op celmorfologie
Glutaaraldehyde-fixatie werd uitgevoerd voor dierlijke of menselijke weefsels vóór het invriezen van de sandwich om ijskristalvrije ultrastructuur te verkrijgen. De micrografieën die met deze methode worden verkregen, tonen prachtig heldere beelden die vergelijkbaar zijn met die verkregen door het snel invriezen van levende weefsels (Figuur 14)1. De studies op gistcellen, diepzee-micro-organismen en gekweekte cellen tonen aan dat de vervorming van de ultrastructuur voornamelijk te wijten is aan osmiumtetroxidefixatie en dehydratatie door ethanol bij kamertemperatuur1,17,18,28. Small meldde ook dat hoewel glutaaraldehydefixatie de organisatie van actine in gekweekte fibroblasten niet vernietigt, osmiumtetroxidefixatie en dehydratatie door aceton of ethanol bij kamertemperatuur actineorganisatie vernietigen62.
Daarom moet een gedetailleerd onderzoek worden uitgevoerd naar de effecten van glutaaraldehydefixatie op de celmorfologie. Ohno ontwikkelde een in vivo cryofixatiemethode waarbij levende weefsels snel worden ingevroren zonder de bloedtoevoer te stoppen63. De weefsels werden bevroren vervangen en ingebed in epoxyhars, en ultradunne secties werden waargenomen. De elektronenmicroscopische beelden toonden de dichtstbijzijnde inheemse ultrastructuur van levende weefsels in vergelijking met die verkregen door chemische fixatie-conventionele uitdroging en door het snel bevriezen van verse niet-gefixeerde weefsels. Daarom kan het interessant zijn om de ultrastructuur verkregen door glutaaraldehyde fixatie-vries substitutie (de huidige methode) te vergelijken met die door in vivo cryofixatie-vriessubstitutie om de effecten van glutaaraldehydefixatie te onderzoeken.
Aandacht voor het milieu en verhoogde experimentele efficiëntie
We gebruiken 2 ml plastic buizen voor de vervanging van de hars. Eén ml verdunde hars is voldoende voor elke substitutiestap. De gebruikte plastic buizen mogen na elk experiment worden weggegooid. Dit kan tijd en moeite besparen voor het wassen van glazen injectieflacons wanneer ze worden gebruikt voor harsvervanging. Bovendien kan uranylacetaatoplossing herhaaldelijk worden gebruikt voor sectiekleuring32. Na het kleuren van de secties kan de uranylacetaatoplossing worden opgeslagen en opnieuw worden gebruikt. Aangezien uranylacetaat een radioactieve stof is, helpt het hergebruik ervan de vorming van afval te voorkomen en draagt het bij aan de bescherming van het milieu.
Plasma-gepolymeriseerde naftaleenfilm
Plasma-gepolymeriseerde naftaleenfilm is een driedimensionaal gepolymeriseerde koolstoffilm gemaakt van naftaleengas door plasmapolymerisatie onder gloedontlading33. De film is bestand tegen elektronenbombardementen en chemicaliën, zeer schoon, transparant tegen elektronen en heeft een plat oppervlak en amorfe structuur. De plasma-gepolymeriseerde naftaleenfilm, die in de handel verkrijgbaar is, is dus uitstekend en wordt aanbevolen als ondersteuningsfilm.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
| 10 mL glass vials | - | Scintillation counter vials for fixative | |
| Acetone | - | ||
| Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
| Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
| Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Slide glass | - | ||
| Double-sided adhesive tape | - | ||
| Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FAS-10 |
| Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Feather, FA-10 |
| Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
| Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | - | Several pairs |
| Tweezers with polystyrene foam | - | One pair | |
| Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
| Liquid nitrogen | - | ||
| Propane gas | - | Cryogen | |
| Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
| Micropipette | - | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
| Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
| Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | - | SMZ 645 |
| LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
| Disposable plastic container | - | 50 mL and 200 mL | |
| Ethane gas | - | Cryogen | |
| 2 mL Eppendorf tubes | - | For embedding | |
| Disposable plastic syringes | - | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
| Magnetic stirrer | - | ||
| Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
| Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
| Incubater | - | For 37 °C and 60 °C | |
| Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
| LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | - | Refer to this paper |
| Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
| Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
| 0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
| Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
| Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |
References
- Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
- Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
- Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
- Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
- McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
- Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
- Costello, M. J.
- Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
- Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
- Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
- Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
- Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
- Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
- Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
- Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
- Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
- Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
- Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
- Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
- Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
- Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
- Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
- Yamaguchi, M.
- Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
- Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
- Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
- Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
- Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
- Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
- Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
- Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
- Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
- Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
- Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
- Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
- Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
- Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
- Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
- Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
- Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
- Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
- Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
- Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
- Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
- Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
- Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
- Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
- Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
- Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
- Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
- Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
- Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
- Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).
