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Biology

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में जैविक नमूनों के अच्छे अल्ट्रास्ट्रक्चरल संरक्षण के लिए सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग करके तेजी से ठंड

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62431
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

यहां हम दिखाते हैं कि बैक्टीरिया, खमीर, सुसंस्कृत कोशिकाओं, अलग-अलग कोशिकाओं, पशु और मानव ऊतकों और वायरस सहित जैविक नमूनों की तेजी से ठंड के लिए सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए। हम यह भी दिखाते हैं कि तेजी से ठंड के बाद अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के लिए नमूने कैसे तैयार किए जाएं।

Abstract

रासायनिक निर्धारण का उपयोग कोशिकाओं और ऊतकों की अल्ट्रास्ट्रक्चर को देखने के लिए किया गया है। हालांकि, यह विधि कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर को पर्याप्त रूप से संरक्षित नहीं करती है; कलाकृतियों और सेल सामग्री के निष्कर्षण आमतौर पर मनाया जाता है। तेजी से ठंड सेल संरचना के संरक्षण के लिए एक बेहतर विकल्प है। कोशिकाओं के अति सुंदर प्राकृतिक अल्ट्रास्ट्रक्चर को देखने के लिए फ्रीज-प्रतिस्थापन के बाद जीवित खमीर या बैक्टीरिया की सैंडविच फ्रीजिंग का उपयोग किया गया है। हाल ही में, ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड सुसंस्कृत कोशिकाओं या मानव ऊतकों के सैंडविच फ्रीजिंग का उपयोग कोशिकाओं और ऊतकों की अल्ट्रास्ट्रक्चर को प्रकट करने के लिए भी किया गया है।

इन अध्ययनों को अब तक एक हस्तनिर्मित सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस के साथ किया गया है, और अन्य प्रयोगशालाओं में अध्ययन के लिए अनुप्रयोगों को सीमित किया गया है। एक नया सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस हाल ही में गढ़ा गया है और अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। वर्तमान पेपर से पता चलता है कि बैक्टीरिया, खमीर, सुसंस्कृत कोशिकाओं, अलग-अलग कोशिकाओं, पशु और मानव ऊतकों और वायरस सहित जैविक नमूनों की तेजी से ठंड के लिए सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग कैसे किया जाए। इसके अलावा तेजी से ठंड और फ्रीज प्रतिस्थापन, राल एम्बेडिंग, ब्लॉकों की trimming, ultrathin वर्गों के काटने, वर्गों की वसूली, धुंधला, और समर्थन फिल्मों के साथ ग्रिड के कवर के लिए प्रक्रियाओं के बाद ultrathin sectioning के लिए नमूनों की तैयारी दिखाया गया है।

Introduction

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। पारंपरिक निर्जलीकरण प्रक्रियाओं के साथ रासायनिक निर्धारण का उपयोग कोशिकाओं और ऊतकों की अल्ट्रास्ट्रक्चर को देखने के लिए किया गया है। हालांकि, यह विधि कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर को पर्याप्त रूप से संरक्षित नहीं करती है, और कलाकृतियों और सेल सामग्री का निष्कर्षण आमतौर पर मनाया जाता है। कोशिकाओं और ऊतकों की तेजी से ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन सेल संरचना के संरक्षण के लिए बेहतर विकल्प हैं।

कोशिकाओं को तेजी से ठंडा करने के लिए तीन मुख्य तरीकों का उपयोग किया गया है1:1) डुबकी-ठंड एक ठंडे क्रायोजेन में नमूनों को डुबोकर किया जाता है, जैसे कि प्रोपेन, और 1950 के दशक की शुरुआत से इसका उपयोग किया गया था2; 2) ठंडे धातु ब्लॉक ठंड तेजी से तरल नाइट्रोजन या तरल हीलियम3,4 के साथ ठंडा एक धातु ब्लॉक पर कोशिकाओं और ऊतकों को बंद करके किया जाताहै; और 3) उच्च दबाव ठंड उच्च दबाव5,6,7 के तहत तरल नाइट्रोजन के साथ कोशिकाओं और ऊतकों को ठंडा करके किया जाताहै।

सैंडविच फ्रीजिंग एक प्रकार का डुबकी-फ्रीजिंग है जो दो तांबे की डिस्क के बीच पतली जैविक सामग्रियों को सैंडविच करके औरतरल प्रोपेन8,9,10में डुबोकर उन्हें तेजी से ठंडा करके किया जाता है। इस विधि में, बहुत पतले नमूनों (कुछ माइक्रोमीटर मोटी) को क्रायोजेन के साथ तेजी से ठंडा किया जाता है, जिसमें एक धातु का उपयोग किया जाता है जिसमें दोनों तरफ से अच्छी थर्मल चालकता होती है। इस प्रकार, यह विधि प्रभावी रूप से नमूनों से गर्मी को हटा देती है, जिससे बर्फ-क्रिस्टल क्षति के बिना कोशिकाओं को स्थिर रूप से फ्रीज करना संभव हो जाता है। सैंडविच फ्रीजिंग, जीवित खमीर और जीवाणु कोशिकाओं के फ्रीज-प्रतिस्थापन के बाद, कोशिकाओं की प्राकृतिक अल्ट्रास्ट्रक्चर को प्रकट करता है10,11,12,13,14, 15,16।

हाल ही में, इस विधि को ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड सूक्ष्मजीवों17, 18, 19,20, 21, 22,23,24,सुसंस्कृत कोशिकाओं25,26,27,और मानव कोशिकाओं और ऊतकों1, 28की स्पष्ट कोशिका छवियों को संरक्षित करने के लिए उपयोगी पाया गयाहै . यद्यपि इन अध्ययनों को एक हस्तनिर्मित सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस29का उपयोग करके किया गया है, और अन्य प्रयोगशालाओं में अन्य अध्ययनों के लिए अनुप्रयोगों को सीमित कर दिया गया है, एक नया सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस(एसएफडी) 28 बनाया गया है और अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।

वर्तमान पेपर से पता चलता है कि बैक्टीरिया, खमीर, सुसंस्कृत कोशिकाओं, अलग-अलग कोशिकाओं, जानवरों और मानव ऊतकों और वायरस सहित जैविक नमूनों की तेजी से ठंड के लिए एसएफडी का उपयोग कैसे किया जाए। इसके अलावा तेजी से ठंड के बाद अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के लिए नमूनों की तैयारी, साथ ही फ्रीज-प्रतिस्थापन, राल एम्बेडिंग, ब्लॉकों की ट्रिमिंग, अल्ट्राथिन वर्गों की कटाई, वर्गों की वसूली, धुंधला, और समर्थन फिल्मों के साथ ग्रिड को कवर करने के लिए प्रक्रियाओं को भी दिखाया गया है।

Protocol

नोट: मानव नमूनों के लिए अध्ययन के प्रोटोकॉल को ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, चिबा विश्वविद्यालय (3085) की बायोमेडिकल रिसर्च एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड एक खतरनाक रसायन है; यह धुएं हुड में दस्ताने पहने हुए संभाला जाना चाहिए. चित्रा 1 सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस और आवश्यक उपकरण28से पता चलता है। चित्रा 2 सैंडविच-फ्रीजिंग प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक सामग्री को दर्शाता है। कांच की शीशियों को ऑस्मियम टेट्रोक्साइड युक्त एसीटोन से भरा जाता है और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाताहै (चित्रा 2 बी)। कॉपर डिस्क व्यास में 3 मिमी हैं, जिसमें कोई छेद नहीं है, एक तरफ एक अक्षर है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं(चित्रा 2 सी)।

1. फ्रीज प्रतिस्थापन के लिए सेल निलंबन की तेजी से ठंड

नोट:: पूरी प्रक्रिया चित्र 3में दिखाया गया है।

  1. कोशिकाएँ
    1. सैंडविच ठंड के लिए बैक्टीरिया, खमीर(चित्रा 2 ए),सुसंस्कृत कोशिकाओं और अलग-थलग कोशिकाओं के सेल निलंबन का उपयोग करें।
      नोट: दोनों जीवित और glutaraldehyde-निश्चित कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है28.
  2. तरल प्रोपेन की तैयारी
    नोट: तरल नाइट्रोजन को संभालते समय क्रायोग्लव्स और चश्मे का उपयोग करें। चूंकि प्रोपेन विस्फोटक है, इसलिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि एक ही कमरे में आग का उपयोग न करें, और खिड़कियों को खुला रखा जाना चाहिए।
    1. SFD के तरल नाइट्रोजन कंटेनर को तरल नाइट्रोजन के साथ भरें(चित्र4A)। एक ठीक नोजल(चित्रा 4B,C)का उपयोग करके प्रोपेन गैस पेश करके तरल प्रोपेन के साथ तरल प्रोपेन कंटेनर को भरें। एक ठंडा धातु पट्टी(चित्रा 1 और चित्रा 4 डी,ई)का उपयोग करके प्रोपेन के ठोसीकरण में तेजी लाएं।
  3. कॉपर डिस्क की तैयारी
    1. नो-लेटर-साइड अप(चित्रा 2 डी)के साथ स्लाइड ग्लास पर तांबे की डिस्क रखें और 10 पीए, 400 वोल्ट, 30 एस के लिए 1 एमए(चित्रा 4 एफ,जी)पर चमक निर्वहन के साथ इलाज करें ताकि एक आयन स्पुटर उपकरण30का उपयोग करके डिस्क सतह हाइड्रोफिलिक बनाई जा सके।
  4. सैंडविचिंग और डुबकी-सेल निलंबन की ठंड
    1. सेल निलंबन को 2-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब(चित्रा 5 ए)में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए 2,900 × जी पर सेंट्रीफ्यूज करें(चित्रा 5 बी,सी)। supernatant निकालें, और एक मोटी निलंबन प्राप्त करने के लिए गोली निलंबित (चर्चा देखें)।
    2. कॉपर डिस्क(चित्रा 5D-F)पर सेल निलंबन (~ 0.02 μL) की एक छोटी राशि रखें, इसे एक और तांबे की डिस्क(चित्रा 5 G)के साथ कवर करें, और चिमटी(चित्रा 5H)के साथ डिस्क उठाएं।
      नोट: सेल निलंबन के ~ 0.02 μL को मापने के लिए, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत निलंबन की 0.1 μL बूंदों का निरीक्षण करें और उन्हें उन बूंदों में विभाजित करें जो इस मात्रा का1/5 th हैं।
    3. पतली धातु पट्टी के साथ ठोस प्रोपेन के केंद्र में एक अच्छी तरह से बनाओ(चित्रा 5I)। एक SFD में चिमटी सेट करें और तेजी से उपकरण के इंजेक्शन बटन(चित्रा 5J,कश्मीर)धक्का देकर उन्हें फ्रीज।
      नोट: नमूनों को सुखाने के लिए ध्यान नहीं रखा जाना चाहिए और दो डिस्क को पूरी तरह से एक दूसरे पर नहीं रखना चाहिए (अन्यथा, उन्हें अलग करना अगले चरण में बहुत मुश्किल हो जाएगा)।
  5. सैंडविचिंग और जानवरों और मानव ऊतकों की डुबकी-ठंड
    1. पशु और मानव ऊतकों का उपयोग करें (~ 0.5 मिमी x 0.5 मिमी x 1.5 मिमी) 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड-0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.4)(चित्रा 6 ए,बी)में तय किया गया है। उन्हें एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 6सी, डी)के तहत एक रेजर ब्लेड के साथ 0.1- से0.2-मिमी मोटी वर्गों में स्लाइस करें।
      1. एक तांबे की डिस्क(चित्रा 6E,F)पर ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान की एक छोटी सी बूंद (~ 0.02 μL) रखें। फिर, तांबे की डिस्क(चित्रा 6 जी,एच)पर ग्लूटाराल्डिहाइड में ऊतक का एक टुकड़ा रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें और इसे एक और तांबे की डिस्क(चित्रा 6I-K)के साथ कवर करें।
      2. SFD के पिघलने वाले प्रोपेन में ऊतकों के साथ डिस्क को तेजी से फ्रीज करें, जैसा कि अनुभाग 1.4(चित्रा 5J,K) में वर्णितहै।
        नोट: चूंकि ग्लूटाराल्डिहाइड एक खतरनाक रसायन है, इसलिए इसे धुएं के हुड में दस्ताने पहनकर संभाला जाना चाहिए। तांबे की डिस्क पर रखे जाने पर ऊतकों को बफर के साथ धोया नहीं जाना चाहिए, लेकिन ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान में भिगोया जाना चाहिए क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड का एंटी-फ्रीजिंग प्रभावहोता है।
  6. ऑस्मियम एसीटोन के साथ फ्रीज-प्रतिस्थापन
    1. एक कामकाजी स्नान में तरल नाइट्रोजन में डिस्क को स्थानांतरित करें(चित्रा 7 ए,बी)। तरल नाइट्रोजन में ठंडा चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, नमूने को उजागर करने के लिए डिस्क को एक दूसरे से अलग करें(चित्रा 7 सी-ई)।
    2. कोशिकाओं के साथ डिस्क को कांच की शीशी(चित्रा 7 एफ)में रखें जो 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड युक्त एसीटोन के 1 मिलीलीटर से भरा होता है(चित्रा 2 बी)जिसे तरल नाइट्रोजन में रखा गया है और ठोस किया गया है(चित्र4एच)।
    3. डिस्क को डीप-फ्रीजर में स्थानांतरित करें और उन्हें कोशिकाओं के फ्रीज-प्रतिस्थापन के लिए 2-4 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें(चित्रा 3)। निम्नलिखित नमूनों की ठंड के लिए उन्हें गर्म करने के लिए कमरे के तापमान पर पानी में इस्तेमाल किए गए चिमटी भिगोएं(चित्रा 7 जी)।
      नोट: नमूने को संभालने के लिए चिमटी गर्म (कमरे का तापमान) होनी चाहिए क्योंकि ठंडे चिमटी तेजी से ठंड से पहले नमूने को फ्रीज कर सकते हैं, जिससे बर्फ के क्रिस्टल का गठन होता है।
  7. नमूना वार्मिंग और एम्बेडिंग
    1. धीरे-धीरे नमूनों को कमरे के तापमान पर लाएं (-20 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट, चित्रा 3 और चित्रा 8 ए),और डिस्क को 2-एमएल प्लास्टिक ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो एसीटोन के 1 एमएल से भरे हुए हैं(चित्रा 3 और चित्रा 8 बी,सी)।
    2. एक हलचल(चित्रा 8 डी-एफ)का उपयोग करके एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक कंटेनर में अभिकर्मकों को मिलाकर एपॉक्सी राल तैयार करें।
    3. चरण 1.7.1 में एसीटोन को क्रमिक रूप से 30% राल (एसीटोन में), 60% राल, और 1 घंटे प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर 90% राल के साथ एक्सचेंज करें। फिर, रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100% राल के साथ 90% राल का आदान-प्रदान करें। अंत में, सिलिकॉन एम्बेडिंग मोल्ड में 100% राल(चित्रा 8 G-J)में नमूनों को एम्बेड करें, और उन्हें 24 घंटे(चित्रा 3)के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पॉलिमराइज़ करें।
      नोट:: नमूनों को पूरी प्रक्रिया में कॉपर डिस्क से जुड़ा रहना चाहिए (सेक्शनिंग को आसान बनाने के लिए)। एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान एक घूर्णन या मिलाते हुए उपकरण के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि वे सेल में राल के प्रवेश में बहुत कम योगदान देते हैं। इसके अलावा, उपकरण से कंपन कभी-कभी नमूनों को तांबे की डिस्क से अलग करने का कारण बनता है। इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थर्मल ऊर्जा के कारण सेल में राल के प्रवेश में तेजी लाएगा (राल polymerize नहीं होगा क्योंकि इसमें कोई त्वरक नहीं होता है)।
  8. नमूना ब्लॉकों की ट्रिमिंग
    1. सिलिकॉन एम्बेडिंग मोल्ड्स से पॉलिमराइज्ड ब्लॉकों को बाहर निकालें(चित्रा 9 ए)। ब्लॉक पर नमूना संख्या लिखें(चित्र9B)।
    2. एक रेजर ब्लेड (चित्रा 9C, D) के साथ ब्लॉक से तांबे की डिस्क को हटा दें और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप 31 के तहत एक अल्ट्रासोनिक ट्रिमिंग ब्लेड ( चित्रा 9E ) और रेजर ब्लेड ( चित्रा9F-H) का उपयोग करके ब्लॉक की सतह पर एम्बेडेड नमूनों को0.7 मिमी x 0.7मिमी तक ट्रिम करें।
    3. एक ultramicrotome(चित्रा 9I)के एक नमूना धारक में ब्लॉक सेट करें और एक हीरे ट्रिमिंग चाकू(चित्रा 9J,K)के साथ आसानी से ब्लॉक के चेहरे को काटें।
  9. अल्ट्राथिन वर्गों को काटना
    1. अल्ट्रामाइक्रोटोम(चित्रा 10A)31से ब्लॉक को निकालें, इसे एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में सेट करें, और इसे रेजर ब्लेड(चित्रा 10B,C)के साथ 0.2 मिमी x 0.3 मिमी तक ट्रिम करें।
    2. ग्रिड पर neoprene लागू करने के लिए उन्हें चिपकने वाला बनाने के लिए(चित्रा 10D). अल्ट्रामाइक्रोटोम पर ब्लॉक को वापस सेट करें, अल्ट्रामाइक्रोटोम को प्लास्टिक कवर(चित्रा 10ई)31के साथ कवर करें, और 50-70-एनएम-मोटी वर्गों(चित्रा 10 एफ-एच)को काट दें।
    3. एक लूप(चित्रा 10I)का उपयोग करके वर्गों को पुनः प्राप्त करें, उन्हें 300 या 400 मेष तांबे के ग्रिड पर माउंट करें, जो neoprene के साथ इलाज किया जाता है, और उन्हें सूखा(चित्रा 10J)।
  10. इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के तहत अनुभागों और अवलोकन का धुंधला होना
    1. आधे सिलिकॉन ट्यूब (चित्र 11A)31के खांचे में अनुभागों के साथ ग्रिड सेट करें , और uranyl एसीटेट समाधान में भिगोएं और प्रत्येक धुंधला करने के लिए 3 मिनट के लिए सीसा साइट्रेट (चित्र 11B- E)32.
    2. खमीर और कवक नमूनों के लिए, ग्रिड को एक फिल्टर पेपर (4 मिमी x 4 मिमी) पर रखें, उन्हें चिमटी के साथ उठाएं, और उन्हें पानी की सतह पर प्लाज्मा-पॉलिमराइज्ड नेप्थलीन फिल्म33 के साथ कवर करें(चित्रा 11 एफ,जी)। ग्रिड को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में डालें और 100 kV(चित्र11H,I)पर निरीक्षण करें।

2. वायरस और macromolecules की तेजी से ठंड

  1. तरल एथेन की तैयारी
    नोट: तरल नाइट्रोजन को संभालते समय क्रायोग्लव्स और चश्मे का उपयोग करें। चूंकि एथेन विस्फोटक है, इसलिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि एक ही कमरे में आग का उपयोग न करें, और खिड़कियों को खुला रखा जाना चाहिए। इथेन का उपयोग इसलिए किया जाता है क्योंकि यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में वाष्पित हो जाता है जबकि प्रोपेन नहीं करता है।
    1. तरल नाइट्रोजन के साथ SFD के तरल नाइट्रोजन कंटेनर भरें। एक महीन नोजल के माध्यम से इथेन गैस पेश करके तरल इथेन कंटेनर को तरल इथेन कंटेनर को तरल इथेन के साथ भरें।
  2. तैयारी और microgrids और नमूनों की तेजी से ठंड
    1. एक आयन sputter उपकरण30का उपयोग कर चमक निर्वहन (10 Pa, 400 V, 1 mA) के साथ इलाज करके microgrids हाइड्रोफिलिक के दोनों चेहरों बनाओ।
    2. SFD में माइक्रोग्रिड सेट करें और माइक्रोग्रिड पर वायरस या मैक्रोमोलेक्यूलर सस्पेंशन (1 मिलीग्राम प्रोटीन / एमएल) के 2 μL लागू करें। फिल्टर पेपर का उपयोग करके अतिरिक्त तरल निकालें और उपकरण के इंजेक्शन बटन को धक्का देकर माइक्रोग्रिड को तेजी से फ्रीज करें।
  3. एक क्रायो-ट्रांसफर धारक में जमे हुए माइक्रोग्रिड की सेटिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन
    1. तरल नाइट्रोजन में जमे हुए माइक्रोग्रिड्स को स्थानांतरित करें, पहले से तरल नाइट्रोजन तापमान पर ठंडा किए गए क्रायो-ट्रांसफर होल्डर में सेट करें, और कम तापमान34पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें।

Representative Results

निलंबन में सूक्ष्मजीवों की जीवित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था, दो तांबे की डिस्क के बीच सैंडविच किया गया था, एसएफडी के साथ तेजी से जमे हुए, फ्रीज-प्रतिस्थापित, एपॉक्सी राल में एम्बेडेड, अल्ट्राथिन-सेक्शन्ड, दाग, और ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। चित्रा 12 Escherichia कोलाई (बैक्टीरिया, चित्रा 12A,बी)16 और Saccharomyces cerevisiae (खमीर, चित्रा 12C) 15के अल्ट्राथिन वर्गों से पता चलता है। ध्यान दें कि छवियां बहुत स्पष्ट हैं और प्राकृतिक आकृति विज्ञान दिखाती हैं।

सुसंस्कृत कोशिकाओं और अलग-अलग पशु कोशिकाओं के ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड सेल निलंबन एकत्र किए गए थे और एसएफडी के साथ तेजी से जमे हुए थे, फ्रीज-प्रतिस्थापित किए गए थे, और ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया था। चित्र 13 में सुसंस्कृत कोशिकाओं के अतिथिन खंडों को दर्शाया गया है (चित्र 13A-C) 1,28 और माउस उदर गुहा से पृथक कोशिकाओं (चित्र 13D)28. चित्र 14 मानव त्वचा के अल्ट्राथिन वर्गों को दर्शाता है (चित्र 14A-D) और बफी कोट ( चित्र14E)1. ध्यान दें कि छवियां भी बहुत स्पष्ट हैं और प्राकृतिक आकृति विज्ञान दिखाती हैं। चित्रा 15 हेपेटाइटिस बी वायरस कोर कणों को तेजी से SFD के साथ जमे हुए और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी34द्वारा मनाया गया दिखाता है। अन्य कोशिकाओं के साथ, छवियां बहुत स्पष्ट हैं और प्राकृतिक आकृति विज्ञान दिखाती हैं।

Figure 1
चित्र 1:सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस28 और आवश्यक उपकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:सैंडविच फ्रीजिंग प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक सामग्री। (ए)नमूना: Saccharomyces cerevisiae (खमीर) का हल्का माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 10 μm.(B)ग्लास शीशियों (10 mL) जिसमें 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के साथ एसीटोन का 1 mL होता है। (C)कॉपर डिस्क एक अक्षर (बाएं) के बिना एक सतह और एक अक्षर (दाएं) के साथ एक सतह दिखा रही है। स्केल बार = 3 मिमी। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. (डी)नो-लेटर-साइड अप के साथ कॉपर डिस्क को डबल-साइड चिपकने वाले टेप (*) के साथ एक ग्लास स्लाइड पर रखा गया था। स्केल बार = 3 मिमी(ई)एक डबल-धार रेजर और जानवरों और मानव ऊतकों को टुकड़ा करने के लिए एक टूटी हुई दोधारी रेजर, ट्रिमिंग ब्लॉकों के लिए एक एकल धार वाला रेजर, और जानवरों और मानव ऊतकों को टुकड़ा करने के लिए कटा हुआ बोर्ड। (एफ)ठंड से उंगलियों की रक्षा करने के लिए extruded polystyrene फोम के साथ चिमटी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3:सैंडविच फ्रीजिंग विधि का उपयोग करके सेल निलंबन का नमूना तैयारी। संक्षिप्त रूप: r.t. = कमरे का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4:तरल प्रोपेन, कॉपर डिस्क, और फिक्सेटिव की तैयारी। (ए)तरल नाइट्रोजन (तीर) सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस के तरल नाइट्रोजन कंटेनर में डाला गया था। (बी)प्रोपेन गैस को एक ठीक नोजल के माध्यम से एक तरल प्रोपेन कंटेनर में पेश किया गया था। (सी) तरल प्रोपेन (तीर). (डी)तरल प्रोपेन के ठोसीकरण में तेजी लाने के लिए तरल प्रोपेन को ठंडा करने के लिए एक धातु बार (तीर) का उपयोग किया गया था। (ई) ठोस प्रोपेन (तीर)। (एफ)आयन sputter उपकरण (तीर) चमक निर्वहन के साथ कॉपर डिस्क हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए. (जी)चमक निर्वहन. (एच)कांच की शीशियों को एक कामकाजी स्नान में तरल नाइट्रोजन में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5:सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग करके सेल सस्पेंशन (खमीर) की तेजी से ठंड। (ए)सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में खमीर संस्कृति का स्थानांतरण। (बी)माइक्रोसेंट्रीफ्यूज। (सी)सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (तीर) में Saccharomyces cerevisiae की गोली। (डी)सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से एक माइक्रोपिपेट के साथ नमूने को स्थानांतरित करना। (ई) तांबे की डिस्क पर नमूने को रखना। (एफ) तांबे की डिस्क (तीर) पर एक नमूने की एक छोटी सी बूंद। (जी)एक और तांबे की डिस्क के साथ नमूने को कवर करना। (एच)चिमटी के साथ दो डिस्क उठाना। (I)पतली धातु पट्टी का उपयोग करके ठोस प्रोपेन में एक अच्छी तरह से बनाना। (जे)इंजेक्शन बटन को धक्का देकर नमूने की डुबकी-ठंड। (K)ठंड पूरी हो गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6:मानव ऊतकों (त्वचा) का एक नमूना तैयार करना। (A, B) एक पेट्री डिश में ग्लूटाराल्डिहाइड में मानव त्वचा ऊतक तय किया गया। स्केल बार = 5 मिमी(सी, डी)ऊतक (तीर) को एक कटा हुआ बोर्ड पर दो डबल-धार वाले रेजर का उपयोग करके कटा हुआ था। (E, F) ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान (तीर) की एक छोटी सी बूंद तांबे की डिस्क पर रखी गई थी। (G, H) त्वचा के ऊतकों का एक टुकड़ा चिमटी का उपयोग करके तांबे की डिस्क पर रखा गया था। (I)त्वचा के ऊतकों के साथ तांबे की डिस्क को कवर करने के लिए एक और डिस्क का उपयोग किया गया था। (जे)सैंडविच डिस्क चिमटी के साथ उठाया गया था। सैंडविचडिस्क को धीरे से चिमटी के साथ आयोजित किया गया था। चिमटी युक्तियों (तीर) के बीच के अंतर को ध्यान में रखें जो ऊतकों को कुचलने से बचने के लिए बनाए रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7:नमूने को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करना और डिस्क को अलग करना। (ए)एक कामकाजी स्नान में डिस्क (तीर) को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करना। (बी)तरल नाइट्रोजन (तीर) में डिस्क। (सी)चिमटी को तरल नाइट्रोजन में रखा गया था ताकि उन्हें काम के स्नान में ठंडा किया जा सके। (D, E) चिमटी का उपयोग कर तांबे की डिस्क (तीर) को अलग करना। (एफ)चिमटी के साथ कांच की शीशी में डिस्क (तीर) को स्थानांतरित करना। (जी)अगले नमूने को ठंडा करने के लिए पानी में चिमटी को गर्म करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8:नमूना वार्मिंग और एम्बेडिंग( ए)कमरे के तापमान पर कांच की शीशियों में नमूने। (बी)चिमटी के साथ एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में डिस्क (तीर) को स्थानांतरित करना। (C) एक प्लास्टिक ट्यूब में एसीटोन में कॉपर डिस्क (तीर)। (डी)एक इंजेक्शन ट्यूब (तीर) के साथ रेजिन को मापने। (ई)राल को डिस्पोजेबल कप (तीर) में स्थानांतरित करना। (एफ)एक हलचल का उपयोग करके राल मिश्रण. (जी)राल की एक छोटी राशि सिलिकॉन एम्बेडिंग मोल्ड के छेद में रखा गया था। (एच)ग्रिड में अतिरिक्त राल फिल्टर कागज के साथ हटा दिया गया था। (I, J) नमूनों के साथ तांबे की डिस्क को नमूना पक्ष के साथ एम्बेडिंग मोल्ड के छेद के तल में रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9:नमूना ब्लॉक को ट्रिम करना। (ए)एम्बेडिंग मोल्ड्स से पॉलिमराइज्ड ब्लॉकों को बाहर निकालना। (बी)नमूना संख्या ब्लॉक पर लिखी गई थी। (C, D) कॉपर डिस्क को उस्तरा के साथ ब्लॉक से हटा दिया गया था। (डी)= 1 मिमी(ई-जी)के लिए स्केल बार नमूना एक अल्ट्रासोनिक काटने ब्लेड और एक रेजर ब्लेड के साथ छंटनी की गई थी। (G)= 1 mm के लिए स्केल बार (H) (G) का उच्च आवर्धन । एक व्यक्तिगत उज्ज्वल स्थान एक सेल है। कोशिकाओं को एक ही परत10में एम्बेडेड किया गया था। स्केल बार = 10 μm.(I-K)ब्लॉक की सतह को हीरे की ट्रिमिंग चाकू के साथ चिकनी काट दिया गया था। (K) = 1 मिमी के लिए स्केल बार। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: अल्ट्राथिन अनुभागों को काटना। (A) माइक्रोटोम31से नमूना ब्लॉक को हटा दिया गया था. (B, C) नमूने को आगे एक रेजर ब्लेड के साथ छंटनी की गई थी। (सी)= 0.5 मिमी(डी)नियोप्रेन के लिए स्केल बार ग्रिड पर लागू किया गया था ताकि उन्हें छड़ी किया जा सके। (ई)अल्ट्राथिन सेक्शनिंग के दौरान एयरफ्लो से बचने के लिए अल्ट्रामाइक्रोटोम को प्लास्टिक के साथ कवर किया गया था। (च)हीरे की चाकू की नाव पानी से भरी हुई थी। (G, H) अल्ट्राथिन वर्गों को 70 एनएम की मोटाई में काट दिया गया था। (H)= 1 mm के लिए स्केल बार (I, J) अनुभागों को एक लूप का उपयोग करके पुनर्प्राप्त किया गया था और फिर सुखाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11:धुंधला वर्गों. (A)ग्रिड को आधे सिलिकॉन ट्यूब के नाली में रखा गया था। (बी)वे धुंधला करने के लिए यूरेनिल एसीटेट में भिगोए गए थे। (सी)इस्तेमाल किया uranyl एसीटेट स्व सील मोमी फिल्म पर एकत्र किया गया था. (डी)ग्रिड को पानी के जेट से धोया गया था और(ई)फिर सीसा साइट्रेट में भिगोया गया था। प्लाज्मा-पॉलिमराइज्ड नेप्थलीन फिल्म को पानी पर तैराया गया था और(जी)4 मिमी x 4 मिमी फिल्टर पेपर पर रखे गए ग्रिड को कवर करने के लिए उपयोग किया जाता था। (एच)ग्रिड को एक नमूना धारक में रखा गया था और(I)एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: Escherichia कोलाई (बैक्टीरिया, ए, बी) और Saccharomyces cerevisiae (खमीर, सी) के Ultrathin वर्गों. (ए)ध्यान दें कि नमूने घनी और सजातीय रूप से एम्बेडेड होते हैं और कोई विरूपण नहीं दिखाते हैं। (B, C) झिल्ली संरचनाएं स्पष्ट और चिकनी आकृति विज्ञान दिखाती हैं, और राइबोसोम पर्याप्त रूप से स्पष्ट हैं कि प्रत्येक कण की गणना की जा सकतीहै। (सी)खमीर नाभिक और रिक्तिकाएं एक सच्चे सर्कल आकार को दिखाती हैं, जो उनकी प्राकृतिक आकृति विज्ञान हो सकती है। माइटोकॉन्ड्रिया का मैट्रिक्स एक इलेक्ट्रॉन-घने उपस्थिति को दर्शाता है, जो जीवित कोशिकाओं की एक विशेषता हो सकती है जो तेजी से ठंड से तय होती है। स्केल सलाखों = 1 μm. संक्षिप्त रूप: CW = सेल दीवार; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एनएम = परमाणु झिल्ली; NP = परमाणु छिद्र; OM = बाहरी झिल्ली; पीएम = प्लाज्मा झिल्ली; आर = राइबोसोम; N = नाभिक; एम = माइटोकॉन्ड्रिया। (बी)अनुमति के साथ यामादा एट अल16 से पुन: पेश किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्रा 13:Ultrathin अनुभागों ( A-C) K562 सुसंस्कृत कोशिकाओं. (d)माउस से एक अलग मस्तूल कोशिका. (ए)ध्यान दें कि नमूने घनी और सजातीय रूप से एम्बेडेड होते हैं और कोई विरूपण नहीं दिखाते हैं। स्केल बार = 20 μm.(B-D)उच्च आवर्धन पर, नाभिक, न्यूक्लियोलस, परमाणु झिल्ली, परमाणु छिद्र, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, माइटोकॉन्ड्रिया, राइबोसोम और दानों को स्पष्ट रूप से देखा जाता है। स्केल सलाखों = 2 μm(B),500 nm(C),2 μm(D). संक्षेप: N = नाभिक; Nu = न्यूक्लियोलस; NM = परमाणु झिल्ली, NP = परमाणु छिद्र; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एम = माइटोकॉन्ड्रिया; आर = राइबोसोम; G = granules; D = विभाजित कोशिकाओं। (ए)अनुमति के साथ यामागुची एट अल1 से पुन: पेश किया जाता है। (बी-डी)अनुमति के साथ यामागुची एट अल28 से पुनरुत्पादित कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 14
चित्रा 14:Ultrathin वर्गों ( A-D) मानव त्वचा और(ई)buffy कोट. (A-E) ध्यान दें कि ऊतक और सेल छवियां स्पष्ट और प्राकृतिक हैं और अच्छे विपरीत दिखाती हैं, हालांकि अनुभाग बहुत पतले (50 एनएम) हैं। माइटोकॉन्ड्रिया का मैट्रिक्स एक घनी उपस्थिति दिखाता है, जो तेजी से जमे हुए जीवित कोशिकाओं(डी)के घने माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के समान है। स्केल सलाखों = 10 μm(A, E),200 nm(B-D) संक्षेप: D = desmosomes; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; K = केराटिनोसाइट; केएफ = केराटिन फाइबर; एम = माइटोकॉन्ड्रिया; N = नाभिक; एनएम = परमाणु झिल्ली; पी = प्लेटलेट; आर = राइबोसोम; W = सफेद रक्त कोशिकाएं। यामागुची एट अल.28 से अनुमति के साथ reproduced. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 15
चित्रा 15:हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) कोर कणों को सैंडविच फ्रीजिंग डिवाइस का उपयोग करके तरल एथेन के साथ तेजी से जमे हुए और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है। गोलाकार खोखले कण एचबीवी कोर कण हैं। स्केल बार = 100 एनएम। संक्षेप: एचबीवी = हेपेटाइटिस बी वायरस; I = बर्फ। यामागुची एट अल.28 से अनुमति के साथ reproduced. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

निम्नलिखित चर्चा 1,000 से अधिक नमूनों पर 120 से अधिक सैंडविच फ्रीजिंग-फ्रीज प्रतिस्थापन प्रयोगों और 36 वर्षों में किए गए 75 से अधिक नमूनों पर 70 से अधिक डुबकी-फ्रीजिंग-क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगों पर आधारित है।

सैंडविच ठंड द्वारा अच्छी ठंड के लिए सफलता की दर
अच्छी ठंड प्राप्त करने में सफलता की दर नमूनों पर निर्भर करती है। Saccharomyces cerevisiae (खमीर) YPD माध्यम (1% खमीर निकालने, 2% पेप्टोन, 2% dextrose) में सुसंस्कृत कोशिकाओं ने बर्फ क्रिस्टल गठन के बिना अच्छी ठंड के लिए लगभग100% सफलता दी 10,11,15,35,36। अन्य खमीर प्रजातियों, Shizosaccharomyces37, 38,39,Cryptococcus14 , 40,41,42,43,44,45, एक्सोफिला13, 41,46 , 47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57, और Trichosporon , भी अच्छा ठंड दिखाया. माइकोबैक्टीरियम58, 59 और ई कोलाई16सहित बैक्टीरिया ने भी अच्छी ठंड दिखाई। सुसंस्कृत कोशिकाओं और पृथक पशु कोशिकाओं ने जीवित और ग्लूटाराल्डिहाइड-स्थिर कोशिकाओं1, 25 , 26,27,60दोनों के लिए अच्छी ठंड दिखाई . ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड जानवरों और मानव ऊतकों को 0.1 से 0.2 मिमी मोटाई तक कटा हुआ भी अधिकांश समय1,28में अच्छी ठंड दिखाई दी।

अच्छी ठंड के लिए शर्तें
उचित विकास चरण और स्थिति में केवल कोशिकाओं का उपयोग करें। संस्कृति में कोशिकाओं को घातीय चरण में होना चाहिए। तांबे की डिस्क पर केंद्रित नमूनों के सेल निलंबन की बहुत कम मात्रा में लागू करें (S. cerevisiaeके लिए, ~ 0.02 μL के 3-5 ×10 9 कोशिकाओं / mL) का। पशु या मानव ऊतकों के ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड स्लाइस भी बहुत छोटे होने चाहिए (अधिमानतः 0.3 मिमी x 0.3 मिमी x 0.1 मिमी)। क्योंकि 0.1-मिमी मोटी ऊतक स्लाइस काटना मुश्किल है, कई ऊतकों को स्लाइस करें और पतले और आधे पारदर्शी स्लाइस का चयन करें। जल्दी से लेकिन ध्यान से काम करें, और नमूनों को सूखने न दें। चिमटी के साथ स्टैक्ड कॉपर डिस्क को चुनने में, कोशिकाओं और ऊतकों को कुचलने से बचने के लिए डिस्क को बहुत मुश्किल से न दबाएं। नमूना लोडिंग सफल ठंड के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है, और आवश्यक स्थितियां उच्च दबाव वाली ठंड के लिए अच्छी ठंड के लिए शर्तों के समान हैं। पाठकों को मैकडॉनल्ड्स61द्वारा उत्कृष्ट समीक्षा का उल्लेख करना चाहिए।

अन्य अनुप्रयोग
यह पेपर एक जीवाणु, खमीर, सुसंस्कृत कोशिकाओं, अलग-थलग पशु कोशिकाओं, मानव ऊतकों और वायरस कणों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ प्रस्तुत करता है। हमने ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड समुद्री शैवाल की अच्छी ठंड देखी। हालांकि, जीवित मीठे पानी के हरे शैवाल की कोशिका संरचनाओं को बर्फ क्रिस्टल गठन द्वारा नष्ट कर दिया गया था। 20% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ कोशिकाओं को मिलाने से यह सुनिश्चित हुआ कि अल्ट्रास्ट्रक्चर को बर्फ-क्रिस्टल क्षति के साथ अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था। 20% बीएसए का उपयोग मशरूम के डंठल कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करने के लिए भी फायदेमंद था। 20% बीएसए लागू करके पौधों की कोशिकाओं और ऊतकों की ठंड पर प्रयोग चल रहे हैं। हालांकि सैंडविच फ्रीजिंग-फ्रीज-प्रतिस्थापित नमूनों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का प्रयास नहीं किया गया है, अच्छी तरह से संरक्षित सेल संरचनाओं के अवलोकन को पहले9की सूचना दी गई है।

सैंडविच फ्रीजिंग विधि पर नोट्स
कोशिकाओं के क्लोज-टू-देशी अल्ट्रास्ट्रक्चर को जीवित कोशिकाओं के तेजी से ठंड और फ्रीज-प्रतिस्थापन द्वारा सबसे अच्छा देखा जाता है। SFD के साथ बर्फ क्रिस्टल गठन को कोशिकाओं की मोटाई को ≤30 μm1तक सीमित करके टाला जा सकता है। ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ ऊतकों को ठीक करने से अक्सर निलंबन-सुसंस्कृत कोशिकाओं को देखने के लिए सेल संरचना का बेहतर संरक्षण होता है क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण सेल संरचना को अधिक कठोर बनाता है और जीवित कोशिकाओं के संग्रह और सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान संभावित अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों को रोकताहै। ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण भी ठंड की गहराई के विस्तार को 0.2 मिमी1तक की अनुमति देता है, जो उच्च दबाव ठंड (एचपीएफ) विधि द्वारा प्राप्त किए गए समान है। इसलिए, एचपीएफ मशीन को जानवरों और मानव ऊतकों की गहरी ठंड के लिए एसएफडी के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

क्योंकि ग्लूटाराल्डिहाइड-फिक्स्ड ऊतकों को 2 साल 28 से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकताहै,सैंडविच फ्रीजिंग को उपयोगकर्ता की सुविधा के अनुसार किया जा सकता है। ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ ऊतकों को ठीक करना भी ऊतक सेक्शनिंग की सुविधा देता है क्योंकि ऊतक निर्धारण के साथ अधिक कठोर हो जाते हैं। एचपीएफ मशीन के विपरीत, एसएफडी का उपयोग क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए और बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक कोशिकाओं के लिए वायरस की तेजी से ठंड के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, एचपीएफ मशीन की तुलना में, एसएफडी छोटा, पोर्टेबल, कम महंगा है, और अधिक प्रयोगशालाओं द्वारा अधिग्रहित किया जा सकता है। हम आशा करते हैं कि SFD की ये विशेषताएं अधिक प्रयोगशालाओं को अपने अनुसंधान लक्ष्यों को प्राप्त करने में मददकरती हैं।

कोशिकाओं की प्राकृतिक आकृति विज्ञान की विशेषताएं
कोशिका संरचनाएं अपनी प्राकृतिक अवस्था में होती हैं यदि वे निम्नलिखित उपस्थिति दिखाते हैं: बाहरी झिल्ली की झिल्ली संरचनाएं(चित्र12ए,बी),प्लाज्मा झिल्ली(चित्र12 बी,सी; चित्र 13A-D; और चित्रा 14E),नाभिकीय लिफाफा(चित्रा 12C, चित्रा 13B-D,और चित्रा 14D-E),माइटोकॉन्ड्रिया(चित्रा 12C,चित्रा 13C,और चित्रा 14D),और रिक्तिकाएं(चित्रा 12C) चिकनीरूपरेखा दिखाती हैं। नाभिक और रिक्तिकाएं लगभग वृत्ताकार होती हैं(चित्र 12C)। राइबोसोम ~ 20 एनएम के व्यास के साथ एक स्पष्ट इलेक्ट्रॉन-घने उपस्थिति दिखाते हैं(चित्रा 12 बी,सी; चित्रा 13C; और चित्रा 14D)। साइटोप्लाज्म इलेक्ट्रॉन-ल्यूसेंट है(चित्र 12 बी,सी; चित्रा 13C; और चित्रा 14D)।

कोशिका आकृति विज्ञान पर ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण का प्रभाव
ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण बर्फ-क्रिस्टल-मुक्त अल्ट्रास्ट्रक्चर प्राप्त करने के लिए सैंडविच फ्रीजिंग से पहले जानवरों या मानव ऊतकों के लिए किया गया था। इस विधि द्वारा प्राप्त माइक्रोग्राफ में जीवित ऊतकों के तेजी से जमने से प्राप्त सूक्ष्म चित्रों के समान उत्कृष्ट रूप से स्पष्ट चित्र दर्शाए गए हैं (चित्र 14)1. खमीर कोशिकाओं, गहरे समुद्र के सूक्ष्मजीवों और सुसंस्कृत कोशिकाओं पर अध्ययन से पता चलता है कि अल्ट्रास्ट्रक्चर का विरूपण मुख्य रूप से कमरे केतापमान1, 17, 18,28पर इथेनॉल द्वारा ऑस्मियम टेट्रोक्साइड निर्धारण और निर्जलीकरण के कारण होता है। छोटे ने यह भी बताया कि हालांकि ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट्स में एक्टिन के संगठन को नष्ट नहीं करता है, ऑस्मियम टेट्रोऑक्साइड निर्धारण और कमरे के तापमान पर एसीटोन या इथेनॉल द्वारा निर्जलीकरण एक्टिन संगठन62को नष्ट कर देता है।

इसलिए, सेल आकृति विज्ञान पर ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के प्रभावों पर एक विस्तृत अध्ययन किया जाना चाहिए। ओहनो ने एक इन विवो क्रायोफिक्सेशन विधि विकसित की जिसमें जीवित ऊतक रक्त की आपूर्तिको रोकनेके बिना तेजी से जमे हुए होते हैं। ऊतकों को फ्रीज-प्रतिस्थापित किया गया था और एपॉक्सी राल में एम्बेडेड किया गया था, और अल्ट्राथिन वर्गों को देखा गया था। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियों ने रासायनिक निर्धारण-पारंपरिक निर्जलीकरण द्वारा प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में जीवित ऊतकों की निकटतम-से-देशी अल्ट्रास्ट्रक्चर और ताजा अनिर्धारित ऊतकों की तेजी से ठंड से पता चला। इसलिए, ग्लूटाराल्डिहाइड फिक्सेशन-फ्रीज प्रतिस्थापन (वर्तमान विधि) द्वारा प्राप्त अल्ट्रास्ट्रक्चर की तुलना करना दिलचस्प हो सकता है और ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के प्रभावों की जांच करने के लिए विवो क्रायोफिक्सेशन-फ्रीज प्रतिस्थापन में उन लोगों की तुलना करना दिलचस्प हो सकता है।

पर्यावरण के लिए विचार और प्रयोगात्मक दक्षता में वृद्धि
हम राल के प्रतिस्थापन के लिए 2 एमएल प्लास्टिक ट्यूबों का उपयोग करते हैं। पतला राल का एक एमएल प्रत्येक प्रतिस्थापन चरण के लिए पर्याप्त है। उपयोग किए गए प्लास्टिक ट्यूबों को प्रत्येक प्रयोग के बाद छोड़ दिया जा सकता है। यह कांच की शीशियों को धोने के लिए समय और प्रयास बचा सकता है जब वे राल प्रतिस्थापन के लिए उपयोग किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, यूरेनिल एसीटेट समाधान का उपयोगअनुभाग धुंधला 32के लिए बार-बार किया जा सकता है। वर्गों को धुंधला करने के बाद, यूरेनिल एसीटेट समाधान को बचाया जा सकता है और फिर से उपयोग किया जा सकता है। चूंकि यूरेनिल एसीटेट एक रेडियोधर्मी पदार्थ है, इसलिए इसका पुन: उपयोग अपशिष्ट के उत्पादन से बचने में मदद करता है और पर्यावरण की सुरक्षा में योगदान देता है।

प्लाज्मा-बहुलकित नेप्थलीन फिल्म
प्लाज्मा-बहुलकित नेप्थलीन फिल्म एक त्रि-आयामी बहुलक कार्बन फिल्म है जो चमक निर्वहन33के तहत प्लाज्मा-पोलीमराइजेशन द्वारा नेफ्थलीन गैस से बनाई गई है। फिल्म इलेक्ट्रॉन बमबारी और रसायनों के खिलाफ लचीला है, इलेक्ट्रॉनों के खिलाफ बहुत साफ, पारदर्शी है, और इसमें एक सपाट सतह और अनाकार संरचना है। इस प्रकार, प्लाज्मा-पॉलिमराइज्ड नेप्थलीन फिल्म, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, उत्कृष्ट है और एक समर्थन फिल्म के रूप में अनुशंसित है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials - Scintillation counter vials for fixative
Acetone -
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Slide glass -
Double-sided adhesive tape -
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Several pairs
Tweezers with polystyrene foam - One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen -
Propane gas - Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette - For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container - 50 mL and 200 mL
Ethane gas - Cryogen
2 mL Eppendorf tubes - For embedding
Disposable plastic syringes - 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer -
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater - For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Super Support Film Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo 647
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400

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References

  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, In Japanese 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

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Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).

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