Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rask frysing ved hjelp av sandwichfrysingsenhet for god ultrastrukturell bevaring av biologiske prøver i elektronmikroskopi

Published: July 19, 2021 doi: 10.3791/62431
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Medical Mycology Research Center, Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

Summary

Her viser vi hvordan du bruker sandwichfryseapparatet til rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, animalske og menneskelige vev og virus. Vi viser også hvordan du lager prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing.

Abstract

Kjemisk fiksering har blitt brukt til å observere ultrastruktur av celler og vev. Denne metoden bevarer imidlertid ikke ultrastrukturen til celler tilstrekkelig; artefakter og utvinning av celleinnhold observeres vanligvis. Rask frysing er et bedre alternativ for bevaring av cellestruktur. Sandwichfrysing av levende gjær eller bakterier etterfulgt av fryseerstatning har blitt brukt til å observere den utsøkte naturlige ultrastrukturen til celler. Nylig har sandwichfrysing av glutaraldehydfaste dyrkede celler eller humant vev også blitt brukt til å avsløre ultrastruktur av celler og vev.

Disse studiene har så langt blitt utført med en håndlaget sandwich fryseenhet, og søknader til studier i andre laboratorier har vært begrenset. En ny sandwich fryseenhet har nylig blitt fabrikkert og er nå kommersielt tilgjengelig. Det nåværende papiret viser hvordan du bruker sandwichfrysingsenheten for rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, dyre- og menneskevev og virus. Også vist er forberedelsen av prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing og prosedyrer for fryse-substitusjon, harpiksinnbygging, trimming av blokker, kutting av ultratynne seksjoner, gjenoppretting av seksjoner, farging og belegg av rutenett med støttefilmer.

Introduction

Elektronmikroskopi er et kraftig verktøy for å studere celle ultrastruktur. Kjemisk fiksering med konvensjonelle dehydreringsprosedyrer har blitt brukt til å observere ultrastruktur av celler og vev. Denne metoden bevarer imidlertid ikke tilstrekkelig ultrastruktur av celler, og artefakter og utvinning av celleinnhold observeres vanligvis. Rask frysing og fryse-substitusjon av celler og vev er bedre alternativer for bevaring av cellestruktur.

Tre hovedmetoder har blitt brukt for fryseceller raskt1: 1) frysing utføres ved å kaste prøver inn i et avkjølt kryogen, som propan, og ble brukt siden tidlig på 1950-tallet2; 2) kaldmetall blokkfrysing utføres ved raskt å smelle celler og vev på en metallblokk avkjølt med flytende nitrogen eller flytende helium3,4; og 3) høytrykksfrysing gjøres ved å fryse celler og vev med flytende nitrogen under høyt trykk5,6,7.

Sandwichfrysing er en type dypfrysing utført ved å smøre tynne biologiske materialer mellom to kobberskiver og raskt fryse dem ved å stupe i flytende propan8,9,10. I denne metoden avkjøles svært tynne prøver (noen få mikrometer tykke) raskt med kryogen ved hjelp av et metall som har god termisk ledningsevne fra begge sider. Dermed fjerner denne metoden effektivt varme fra prøvene, noe som gjør det mulig å fryse celler uten iskrystallskader. Sandwichfrysing, etterfulgt av fryse-substitusjon av levende gjær og bakterieceller, avslører den naturlige ultrastrukturen til cellene10,11,12,13,14,15,16.

Nylig har denne metoden vist seg å være nyttig for å bevare klare cellebilder av glutaraldehydfaste mikroorganismer17,18,19,20,21,22,23,24, dyrkede celler25,26,27og menneskelige celler og vev1,28 . Selv om disse studiene har blitt utført ved hjelp av en håndlaget sandwich fryseenhet29, og søknader til andre studier i andre laboratorier har vært begrenset, en ny sandwich fryseenhet (SFD) har blitt fabrikkert28 og er nå kommersielt tilgjengelig.

Det nåværende dokumentet viser hvordan du bruker SFD for rask frysing av biologiske prøver, inkludert bakterier, gjær, dyrkede celler, isolerte celler, animalske og menneskelige vev og virus. Også vist er forberedelsen av prøver for ultratynne seksjonering etter rask frysing, samt prosedyrer for fryse-substitusjon, harpiksinnbygging, trimming av blokker, kutting av ultratynne seksjoner, gjenoppretting av seksjoner, farging og tildekking av rutenett med støttefilmer.

Protocol

MERK: Studiens protokoll for menneskelige prøver ble godkjent av Biomedical Research Ethics Committee ved Graduate School of Medicine, Chiba University (3085). Osmium tetroxide er et farlig kjemikalie; den skal håndteres med hansker i avtrekkshetten. Figur 1 viser sandwichfryseenheten og de nødvendige verktøyene28. Figur 2 viser materialene som er nødvendige for å utføre sandwichfrysende eksperimenter. Hetteglassene i glass er fylt med aceton som inneholder osmiumteroksid og oppbevares ved -80 °C til bruk (figur 2B). Kobberskiver er 3 mm i diameter, uten hull, har en bokstav på den ene siden og er kommersielt tilgjengelige (Figur 2C).

1. Rask frysing av cellesuspensjoner for fryseerstatning

MERK: Hele prosedyren er vist i figur 3.

  1. Celler
    1. Bruk cellesuspensjoner av bakterier, gjær (figur 2A), dyrkede celler og isolerte celler for smørbrødfrysing.
      MERK: Både levende og glutaraldehydfaste celler kan brukes28.
  2. Fremstilling av flytende propan
    MERK: Bruk kryoginier og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. Siden propan er eksplosiv, bør det tas hensyn til ikke å bruke branner i samme rom, og vinduer skal holdes åpne.
    1. Fyll den flytende nitrogenbeholderen til SFD med flytende nitrogen (Figur 4A). Fyll den flytende propanbeholderen med flytende propan ved å introdusere propangass ved hjelp av en fin dyse (Figur 4B,C). Akselerer størkningen av propan ved hjelp av en avkjølt metallstang (Figur 1 og Figur 4D,E).
  3. Forberedelse av kobberskiver
    1. Plasser kobberskiver på et glideglass med ikke-bokstavsiden opp (Figur 2D) og behandle med glødeutladning ved 10 Pa, 400 volt, 1 mA i 30 s (Figur 4F,G) for å gjøre diskoverflaten hydrofil ved hjelp av et ionsprutapparat30.
  4. Sandwiching og dykkfrysing av cellefjæringen
    1. Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør på 2 ml (figur 5A) og sentrifuge ved 2900 × g i 10 s ved romtemperatur (Figur 5B,C). Fjern supernatanten, og suspender pelletsen for å få en tykk suspensjon (se diskusjon).
    2. Plasser en liten mengde av celleopphenget (~0,02 μL) på en kobberskive (Figur 5D-F), dekk den med en annen kobberskive (Figur 5G), og plukk opp diskene med pinsett (Figur 5H).
      MERK: For å måle ~0,02 μL av cellefjæringen, observere 0,1 μL dråper av suspensjonen under stereomikroskopet og dele dem i dråper som er 1/5th av dette volumet.
    3. Lag en brønn i midten av den faste propanen med den tynne metallstangen (Figur 5I). Sett pinsettene i en SFD og frys dem raskt ved å trykke på injeksjonsknappen på apparatet (Figur 5J,K).
      MERK: Det bør tas hensyn til ikke å tørke prøvene og ikke legge de to diskene helt over hverandre (ellers ville det bli svært vanskelig å løsne dem i neste trinn).
  5. Sandwiching og dykkfrysing av dyr og menneskelig vev
    1. Bruk dyre- og menneskevev (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) festet i 2,5 % glutaraldehyd-0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) (Figur 6A, B). Skjær dem i 0,1- til 0,2 mm tykke seksjoner med et barberblad under et stereomikroskop (Figur 6C,D).
      1. Plasser en liten dråpe (~0,02 μL) glutaraldehydoppløsning på en kobberskive (Figur 6E, F). Bruk deretter pinsett til å plassere et stykke vev i glutaraldehyden på kobberskiven (Figur 6G,H) og dekk det med en annen kobberskive (Figur 6I-K).
      2. Frys diskene raskt med vevet i SFDs smeltepropan, som beskrevet i avsnitt 1.4 (Figur 5J,K).
        MERK: Siden glutaraldehyd er et farlig kjemikalie, bør det håndteres med hansker i avtrekkshetten. Vev bør ikke vaskes med buffere når de plasseres på en kobberskive, men holdes gjennomvåt i glutaraldehydoppløsning fordi glutaraldehyd har en antifrysende effekt1.
  6. Fryseerstatning med osmiumaceton
    1. Overfør diskene til flytende nitrogen i et arbeidsbad (Figur 7A, B). Bruk et par pinsett avkjølt i flytende nitrogen, løsne diskene fra hverandre for å eksponere prøven (Figur 7C-E).
    2. Plasser diskene med cellene i et hetteglass med glass (figur 7F) som er fylt med 1 ml aceton som inneholder 2 % osmiumtreetroksid (figur 2B) som er plassert i flytende nitrogen og størknet (Figur 4H).
    3. Overfør diskene til en dypfryser og hold dem ved -80 °C i 2-4 dager for fryseerstatning av cellene (figur 3). Bløtlegg de brukte pinsettene i vann ved romtemperatur for å varme dem (Figur 7G) for frysing av følgende prøver.
      MERK: Pinsett for håndtering av prøven skal være varm (romtemperatur) fordi kalde pinsett kan fryse prøven før rask frysing, noe som fører til dannelse av iskrystaller.
  7. Prøveoppvarming og innebygging
    1. Ta prøvene gradvis til romtemperatur (2 t ved -20 °C, 2 t ved 4 °C og 15 minutter ved romtemperatur, figur 3 og figur 8A), og overfør diskene til 2 ml plastrør som er fylt med 1 ml aceton (figur 3 og figur 8B,C).
    2. Forbered epoksyharpiks ved å blande reagensene i en engangs plastbeholder ved hjelp av en rører (Figur 8D-F).
    3. Bytt aceton i trinn 1.7.1 suksessivt med 30% harpiks (i aceton), 60% harpiks og 90% harpiks ved romtemperatur i 1 time hver. Bytt deretter 90% harpiks med 100% harpiks ved 37 °C over natten. Til slutt bygger du inn prøvene i 100 % harpiks (Figur 8G-J) i silisiuminnbyggingsformen og polymeriserer dem ved 60 °C i 24 timer (figur 3).
      MERK: Prøvene skal forbli festet til kobberskivene gjennom hele prosedyren (for å gjøre seksjonering enklere). Bruk av et roterende eller ristende apparat anbefales ikke under innbyggingsprosessen fordi de bidrar lite til penetrasjon av harpiksen i cellen. Videre får vibrasjonen fra apparatet noen ganger prøvene til å løsne fra kobberskivene. Inkubasjon ved 37 °C over natten ville akselerere inntrengningen av harpiksen i cellen på grunn av termisk energi (harpiksen ville ikke polymerisere fordi den ikke inneholder noen akselerator).
  8. Trimming av prøveblokker
    1. Ta ut de polymeriserte blokkene fra silisiuminnbyggingsformene (Figur 9A). Skriv prøvenummeret på blokken (Figur 9B).
    2. Fjern kobberskivene fra blokken med et barberblad (Figur 9C,D) og trim prøvene som er innebygd på blokkoverflaten til 0,7 mm x 0,7 mm ved hjelp av et ultralydtrimmeblad (Figur 9E) og barberblader (Figur 9F-H) under et stereomikroskop31.
    3. Sett blokken i en prøveholder av en ultramikrotomi (Figur 9I) og skjær ansiktet på blokken jevnt med en diamantkniv (Figur 9J,K).
  9. Skjære ultratynne seksjoner
    1. Fjern blokken fra ultramikrotomet (Figur 10A)31, sett den i et stereomikroskop og trim den videre til 0,2 mm x 0,3 mm med et barberblad (Figur 10B,C).
    2. Påfør neopren på gitteret for å gjøre dem selvklebende (Figur 10D). Sett blokken tilbake på ultramikrotomet, dekk til ultramikrotomet med et plastdeksel (Figur 10E)31, og kutt 50-70 nm tykke seksjoner (Figur 10F-H).
    3. Hent delene ved hjelp av en løkke (Figur 10I), monter dem på 300 eller 400 kobbergitter i nettet som behandles med neopren, og tørk dem (Figur 10J).
  10. Farging av seksjoner og observasjon under elektronmikroskopet
    1. Sett gitteret med seksjoner i sporet på det halve silikonrøret (Figur 11A)31, og suge i uranylacetatoppløsning og blysitrat i 3 min hver for farging (Figur 11B-E)32.
    2. For gjær og soppprøver, plasser gitteret på et filterpapir (4 mm x 4 mm), plukk dem opp med pinsett, og dekk dem med plasmapolymerisert naftalenfilm33 på overflaten av vannet (Figur 11F,G). Sett gitteret inn i et elektronmikroskop og observer ved 100 kV (Figur 11H,I).

2. Rask frysing av virus og makromolekyler

  1. Fremstilling av flytende etan
    MERK: Bruk kryoginier og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. Siden etan er eksplosivt, bør det tas hensyn til ikke å bruke branner i samme rom, og vinduer skal holdes åpne. Etan brukes fordi det fordamper i elektronmikroskopet mens propan ikke gjør det.
    1. Fyll den flytende nitrogenbeholderen til SFD med flytende nitrogen. Fyll den flytende etanbeholderen med flytende etan ved å introdusere etangass gjennom en fin dyse.
  2. Forberedelse og rask frysing av mikronett og prøver
    1. Lag begge ansiktene på mikronettene hydrofile ved å behandle dem med glødeutladning (10 Pa, 400 V, 1 mA) ved hjelp av et ion sputterapparat30.
    2. Sett mikrogridet i SFD og påfør 2 μL av viruset eller makromolekylær suspensjon (1 mg protein/ml) på mikronettene. Fjern overflødig væske ved hjelp av filterpapir og frys mikronettet raskt ved å trykke på apparatets injeksjonsknapp.
  3. Innstilling av det frosne mikronettet i en kryooverføringsholder og observasjon under elektronmikroskopet
    1. Overfør de frosne mikronettene i flytende nitrogen, sett i en kryooverføringsholder avkjølt ved flytende nitrogentemperatur på forhånd, og observer under et elektronmikroskop ved lav temperatur34.

Representative Results

Levende celler av mikroorganismer i suspensjon ble samlet inn ved sentrifugering, smurt mellom to kobberskiver, raskt frosset med SFD, fryseerstatning, innebygd i epoksyharpiks, ultrathin-seksjonert, farget og observert under et elektronmikroskop ved å følge prosedyrene beskrevet ovenfor. Figur 12 viser ultratynne deler av Escherichia coli (bakterier, figur 12A,B)16 og Saccharomyces cerevisiae (gjær, figur 12C)15. Legg merke til at bildene er veldig klare og viser naturlig morfologi.

Glutaraldehydfaste cellesuspensjoner av dyrkede celler og isolerte dyreceller ble samlet og raskt frosset med SFD, frysesubstitutt og observert under et elektronmikroskop ved å følge prosedyrene beskrevet ovenfor. Figur 13 viser ultratynne deler av dyrkede celler (Figur 13A-C)1,28 og isolerte celler fra bukhulen i musen ( Figur13D)28. Figur 14 viser ultratynne deler av menneskelig hud (Figur 14A-D) og frakk(figur 14E)1. Legg merke til at bildene også er veldig klare og viser naturlig morfologi. Figur 15 viser hepatitt B-viruskjernepartikler som raskt fryses med SFD og observeres ved kryo-elektronmikroskopi34. Som med de andre cellene er bildene veldig klare og viser naturlig morfologi.

Figure 1
Figur 1: Sandwich fryseenhet28 og nødvendige verktøy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Materialer som er nødvendige for å utføre sandwichfrysingsforsøk. (A) Prøve: Lett mikrograf av Saccharomyces cerevisiae (gjær). Skalastang = 10 μm. (B) Hetteglass (10 ml) som inneholder 1 ml aceton med 2% osmium tetroksid. (C) Kobberskiver som viser en overflate uten bokstav (venstre) og en overflate med en bokstav (høyre). Skalastang = 3 mm. Skanner elektronmikroskopi. (D) Kobberskiver uten bokstavside opp ble plassert på en glasssklie med dobbeltsidig tape (*). Skalastang = 3 mm. (E) En dobbeltkantet barberhøvel og en ødelagt dobbeltkantet barberhøvel for kutting av animalske og menneskelige vev, en enkantet barberhøvel for trimningsblokker og strimlet brett for kutting av dyr og menneskelig vev. (F) Pinsett med ekstrudert polystyrenskum for å beskytte fingrene mot kulde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Prøvepreparering av cellesuspensjoner ved hjelp av sandwichfrysingsmetoden. Forkortelser: r.t. = romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tilberedning av flytende propan, kobberskiver og fikseringsmiddel. (A) Flytende nitrogen (pil) ble hellet i den flytende nitrogenbeholderen til sandwichfryseapparatet. Propangassble introdusert i en flytende propanbeholder gjennom en fin dyse. (C) Flytende propan (pil). (D) En metallstang (pil) ble brukt til å avkjøle flytende propan for å akselerere størkning av flytende propan. (E) Størknet propan (pil). (F) Ion sputterapparat (pil) for å lage kobberskiver hydrofile med glødutladning. (G) Glødutladning. (H) Hetteglass av glass plassert i flytende nitrogen i et arbeidsbad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Rask frysing av cellefjæring (gjær) ved hjelp av sandwichfryseapparatet. (A) Overføring av gjærkultur inn i sentrifugerøret. (B) Mikrosentrifuge. (C) Pellet av Saccharomyces cerevisiae i sentrifugerøret (pil). (D) Overføre prøven med en mikropipette fra sentrifugerøret. (E) Plasser prøven på kobberskiven. (F) En liten dråpe av en prøve på kobberskiven (pil). (G) Dekker prøven med en annen kobberskive. (H) Plukke de to diskene opp med pinsett. (I) Gjør en brønn i den faste propanen ved hjelp av den tynne metallstangen. (J) Dypfrysing av prøven ved å trykke på injeksjonsknappen. (K) Frysingen er fullført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Klargjøre et eksemplar av humant vev (hud). (A, B) Menneskelig hudvev festet i glutaraldehyd i en Petri-tallerken. Skalastang = 5 mm. (C, D) Vev (pil) ble skiver ved hjelp av to dobbeltkantede barberhøvler på et makulert brett. (E, F) En liten dråpe glutaraldehydoppløsning (pil) ble plassert på en kobberskive. (G, H) Et stykke hudvev ble plassert på kobberskiven ved hjelp av pinsett. (I) En annen disk ble brukt til å dekke kobberskiven med hudvevet. (J) De sandwichede diskene ble plukket opp med pinsett. (K) De sandwichede diskene ble forsiktig holdt med pinsett. Legg merke til gapet mellom pinsettspissene (pilen) som opprettholdes for å unngå å knuse vevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Overføre prøven til flytende nitrogen og løsne diskene. (A) Overføre diskene (pilen) til flytende nitrogen i et arbeidsbad. (B) Disker i flytende nitrogen (pil). (C) Pinsett ble plassert i flytende nitrogen for å avkjøle dem i arbeidsbadet. (D, E) Løsne kobberskivene (pilene) ved hjelp av pinsett. (F) Overføre disken (pilen) til hetteglasset med pinsett. (G) Oppvarming av pinsettene i vann for frysing av neste prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Prøveoppvarming og innbygging. (A) Prøver i hetteglass i glass ved romtemperatur. (B) Overføre diskene (pilen) til et 2 ml plastrør med pinsett. (C) Kobberskiver (pil) i aceton i et plastrør. (D) Måling av harpikser med et injeksjonsrør (pil). (E) Overføre harpiksen til en engangskopp (pil). (F) Blanding av harpiksen ved hjelp av en rører. (G) En liten mengde harpiks ble plassert i hullene i silikoninnbyggingsformen. (H) Overflødig harpiks i gitteret ble fjernet med filterpapir. (I, J) Kobberskiver med prøver ble plassert i bunnen av hullene i innbyggingsformen med prøvesiden opp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Trimming av prøveblokken. (A) Ta ut polymeriserte blokker fra innbyggingsformene. (B) Eksemplarnummeret ble skrevet på blokken. (C, D) Kobberskiven ble fjernet fra blokken med en barberhøvel. Skalastang for (D) = 1 mm. (E-G) Prøven ble trimmet med et ultralyd skjæreblad og et barberblad. Skalastang for (G) = 1 mm. (H) Høy forstørrelse av (G). Et individuelt lyspunkt er en celle. Celler ble innebygd i ett enkelt lag10. Skalastang = 10 μm. (I-K) Overflaten på blokken ble kuttet glatt med en diamant trimkniv. Skalastang for (K) = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Skjæring av ultratynne seksjoner. (A) Prøveblokken ble fjernet fra mikrotom31. (B, C) Prøven ble videre trimmet med et barberblad. Skalastang for (C) = 0,5 mm. (D) Neopren ble brukt på gitter for å få dem til å feste seg. (E) Ultramikrotomet var dekket av plast for å unngå luftstrøm under ultratynn seksjonering. (F) Diamantknivbåten var fylt med vann. (G, H) Ultrathin seksjoner ble kuttet til en tykkelse på 70 nm. Skalastang for (H) = 1 mm. (I, J) Seksjonene ble hentet ved hjelp av en løkke og deretter tørket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Fargesnitt. (A) Gitteret ble plassert i sporet på det halve silikonrøret. (B) De ble gjennomvåt i uranylacetat for farging. (C) Det brukte uranylacetatet ble samlet på selvforsegling av voksaktig film. (D) Gitteret ble vasket med en vannstråle og (E) deretter gjennomvåt i blysitrat. (F) Plasmapolymerisert naftalenfilm ble fløtet på vann og (G) brukes til å dekke et rutenett plassert på 4 mm x 4 mm filterpapir. (H) Gitteret ble plassert i en prøveholder og (I) observert i et elektronmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: Ultratynne deler av Escherichia coli (bakterier, A, B) og Saccharomyces cerevisiae (gjær, C). (A) Legg merke til at prøvene er innebygd tett og homogent og ikke viser noen deformasjon. (B, C) Membranstrukturer viser klar og jevn morfologi, og ribosomer er klare nok til at hver partikkel kan listes opp16. (C) Gjærkjerner og vakuoler viser en ekte sirkelform, som kan være deres naturlige morfologi. Matrisen av mitokondriene viser et elektrontett utseende, som kan være karakteristisk for levende celler som er løst ved rask frysing. Skalastenger = 1 μm. Forkortelser: Faktisk vekt = cellevegg; ER = endoplasmic retikulum; NM = kjernefysisk membran; NP = kjerneporer; OM = ytre membran; PM = plasmamembraner; R = ribosomer; N = kjerne; M = mitokondrier. (B) reproduseres fra Yamada et al.16 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Ultratynne seksjoner. (A-C) K562 dyrkede celler. (D) En isolert mastcelle fra musen. (A) Legg merke til at prøvene er innebygd tett og homogent og ikke viser noen deformasjon. Skalastang = 20 μm. (B-D) Ved høy forstørrelse observeres kjerne, kjerne, kjernemembran, kjerneporer, endoplasmatiske retikulum, mitokondrier, ribosomer og granulater tydelig. Skalastenger = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Forkortelser: N = kjerne; Nu = kjerne; NM = kjernefysisk membran, NP = kjerneporer; ER = endoplasmic retikulum; M = mitokondrier; R = ribosomer; G = granulater; D = dele celler. (A) gjengis fra Yamaguchi et al.1 med tillatelse. (B-D) reproduseres fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 14
Figur 14: Ultratynne seksjoner. (A-D) menneskelig hud og (E) buffy frakk. (A-E) Legg merke til at vev og cellebilder er klare og naturlige og viser god kontrast, selv om seksjonene er veldig tynne (50 nm). Matrisen til mitokondriene viser et tett utseende, som ligner på tette mitokondriematriser av raskt frosne levende celler (D). Skalastenger = 10 μm (A, E), 200 nm (B-D). Forkortelser: D = desmosomer; ER = endoplasmic retikulum; K = keratinocytt; KF = keratinfibre; M = mitokondrier; N = kjerne; NM = kjernefysisk membran; P = blodplate; R = ribosomer; W = hvite blodlegemer. Gjengitt fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 15
Figur 15: Hepatitt B-viruskjernepartikler (HBV) fryses raskt med flytende etan ved hjelp av sandwichfryseenheten og observeres ved kryo-elektronmikroskopi. Sfæriske hule partikler er HBV-kjernepartikler. Skalastang = 100 nm. Forkortelser: HBV = hepatitt B-virus; I = is. Gjengitt fra Yamaguchi et al.28 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Følgende diskusjon er basert på mer enn 120 sandwich frysefrysende substitusjonsforsøk på mer enn 1000 prøver og mer enn 70 dypfrysing-kryo-elektronmikroskopieksperimenter på mer enn 75 prøver utført over 36 år.

Suksessrate for god frysing ved smørbrødfrysing
Graden av suksess for å oppnå god frysing avhenger av prøvene. Saccharomyces cerevisiae (gjær) celler dyrket i YPD medium (1% gjær ekstrakt, 2% peptone, 2% dextrose) ga nesten 100% suksess for god frysing uten iskrystalldannelse10,11,15,35,36. Andre gjærarter, inkludert Shizosaccharomyces37,38,39,Cryptococcus14,40,41,42,43,44,45, Exophiala13,41,46,47,48, 49, Fusarium50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57og Trichosporon, viste også god frysing. Bakterier, inkludert Mycobacterium58,59 og E. coli16, viste også god frysing. Dyrkede celler og isolerte dyreceller viste god frysing for både levende og glutaraldehydfaste celler1,25,26,27,60. Glutaraldehydfast dyr og humant vev skivet til 0,1 til 0,2 mm tykkelse viste også god frysing mesteparten av tiden1,28.

Forhold for god frysing
Bruk bare celler i riktig vekststadium og -tilstand. Celler i kultur bør være i eksponentiell fase. Påfør svært små mengder cellesuspensjoner av konsentrerte prøver (for S. cerevisiae, ~ 0,02 μL 3-5 × 109 celler / ml) på kobberskiven. Glutaraldehydfaste skiver av dyr eller humant vev bør også være svært små (helst 0, 3 mm x 0, 3 mm x 0, 1 mm). Fordi kutting av 0,1 mm tykke vevsskiver er vanskelig, skjær mange vev og velg tynne og halv gjennomsiktige skiver. Arbeid raskt, men forsiktig, og ikke la prøvene tørke ut. Ved å plukke opp stablede kobberskiver med pinsett, ikke trykk diskene for hardt for å unngå å knuse cellene og vevene. Prøvelasting er det viktigste trinnet for vellykket frysing, og forholdene som kreves er de samme som betingelsene for god frysing for høytrykksfrysing. Lesere bør referere til den utmerkede anmeldelsen av McDonald61.

Andre applikasjoner
Dette dokumentet presenterer elektronmikrografer av en bakterie, gjær, dyrkede celler, isolerte dyreceller, humant vev og viruspartikler. Vi observerte god frysing av glutaraldehydfaste marine alger. Imidlertid ble cellestrukturene til levende ferskvannsgrønne alger ødelagt av iskrystalldannelse. Blanding av celler med 20% bovint serumalbumin (BSA) sørget for at ultrastrukturen var godt bevart uten iskrystallskader. Bruken av 20% BSA var også gunstig for å bevare ultrastruktur av stilkceller av en sopp. Eksperimenter på frysing av planteceller og vev ved å bruke 20% BSA pågår. Selv om skanning av elektronmikroskopi av sandwichfrysing-fryse-erstattede prøver ikke er forsøkt, observasjon av godt bevarte cellestrukturer har blitt rapportert tidligere9.

Merknader om sandwichfrysingsmetoden
Den nær-til-innfødte ultrastruktur av celler observeres best ved rask frysing og fryse-substitusjon av levende celler. Iskrystalldannelse med SFD kan unngås ved å begrense tykkelsen på cellene til ≤30 μm1. Å fikse vev med glutaraldehyd gir ofte bedre bevaring av cellestrukturen for å observere suspensjonskulturerte celler fordi glutaraldehydfiksering gjør cellestrukturen stivere og forhindrer mulige ultrastrukturelle endringer under innsamling og sentrifugering av levende celler1. Glutaraldehydfiksering gjør det også mulig å forlenge frysedybden til så mye som 0,2 mm1, tilsvarende det som oppnås ved høytrykksfrysingsmetoden (HPF). Derfor kan HPF-maskinen erstattes med SFD for dyp frysing av dyr og menneskelig vev.

Fordi glutaraldehydfast vev kan lagres i mer enn 2 år28, kan sandwichfrysing utføres i henhold til brukerens bekvemmelighet. Å fikse vev med glutaraldehyd letter også vevsseksjon fordi vevet blir stivere med fiksering. I motsetning til HPF-maskinen kan SFD brukes til rask frysing av virus for kryo-elektronmikroskopi og for bakterier og eukaryote celler. Sammenlignet med HPF-maskinen er SFD dessuten liten, bærbar, billigere og kan anskaffes av flere laboratorier. Vi håper at disse funksjonene i SFD hjelper flere laboratorier med å nå sine forskningsmål28.

Funksjoner av den naturlige morfologien til celler
Cellestrukturer er i sin naturlige tilstand hvis de viser følgende utseende: Membranstrukturer av den ytre membranen (Figur 12A, B), plasmamembran ( Figur12B,C; Figur 13A-D; og Figur 14E), kjernefysisk konvolutt (Figur 12C, Figur 13B-Dog Figur 14D-E), mitokondrier ( Figur12C, Figur 13Cog Figur 14D) og vakuoler ( figur12C) viser jevne konturer. Kjernen og vakuolene er nesten sirkulære (Figur 12C). Ribosomer viser et klart elektrontett utseende med en diameter på ~ 20 nm (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D). Cytoplasma er elektron-lucent (Figur 12B,C; Figur 13C; og figur 14D).

Effekt av glutaraldehydfiksering på cellemorfologi
Glutaraldehydfiksering ble utført for animalsk eller menneskelig vev før sandwichfrysing for å oppnå iskrystallfri ultrastruktur. Mikrografene oppnådd ved denne metoden viser utsøkt klare bilder som ligner de som oppnås ved rask frysing av levende vev (Figur 14)1. Studiene på gjærceller, dyphavsmikroorganismer og dyrkede celler viser at deformasjonen av ultrastruktur hovedsakelig skyldes osmium tetroksidfiksering og dehydrering ved etanol ved romtemperatur1,17,18,28. Small rapporterte også at selv om glutaraldehydfiksering ikke ødelegger organiseringen av aktin i dyrkede fibroblaster, osmium tetroxide fiksering og dehydrering ved aceton eller etanol ved romtemperatur ødelegge actin organisasjon62.

Derfor bør en detaljert studie om effekten av glutaraldehydfiksering på cellemorfologi utføres. Ohno utviklet en in vivo kryofixasjonsmetode der levende vev raskt fryses uten å stoppe blodtilførselen63. Vevet ble frysesubstituttet og innebygd i epoksyharpiks, og ultratynne seksjoner ble observert. De elektronmikroskopiske bildene viste den nærmeste til innfødte ultrastruktur av levende vev sammenlignet med de som ble oppnådd ved kjemisk fiksering-konvensjonell dehydrering og ved rask frysing av friske uløste vev. Derfor kan det være interessant å sammenligne ultrastruktur oppnådd ved glutaraldehydfikseringsfrysing (den nåværende metoden) og de ved in vivo kryofixation-fryse substitusjon for å undersøke effekten av glutaraldehydfiksering.

Hensynet til miljøet og økt eksperimentell effektivitet
Vi bruker 2 ml plastrør til utskifting av harpiksen. En ml fortynnet harpiks er nok for hvert substitusjonstrinn. De brukte plastrørene kan kastes etter hvert eksperiment. Dette kan spare tid og krefter for vasking av hetteglass av glass når de brukes til harpikserstatning. I tillegg kan uranylacetatoppløsning brukes gjentatte ganger til seksjonsfarging32. Etter farging av seksjonene kan uranylacetatoppløsningen lagres og brukes på nytt. Siden uranylacetat er et radioaktivt stoff, bidrar gjenbruken til å unngå generering av avfall og bidrar til beskyttelse av miljøet.

Plasmapolymerisert naftalenfilm
Plasmapolymerisert naftalenfilm er en tredimensjonalt polymerisert karbonfilm laget av naftalengass ved plasmapolymerisering under glødutslipp33. Filmen er motstandsdyktig mot elektronbombardement og kjemikalier, veldig rent, gjennomsiktig mot elektroner, og har en flat overflate og amorf struktur. Dermed er den plasmapolymeriserte naftalenfilmen, som er kommersielt tilgjengelig, utmerket og anbefales som støttefilm.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sandwich Freezing Device Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan MW-SFD-01 with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath
10 mL glass vials - Scintillation counter vials for fixative
Acetone -
Osmium tetroxide Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3004 0.1 g
Deep freezer Sanyo Co. Ltd., Osaka MDF-C8V1
Copper disk Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Slide glass -
Double-sided adhesive tape -
Single-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FAS-10
Double-edged razor blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Feather, FA-10
Shredded board Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 428
Tweezers Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo - Several pairs
Tweezers with polystyrene foam - One pair
Glutaraldehyde Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 3052
Liquid nitrogen -
Propane gas - Cryogen
Ion sputter apparatus Hitachi high technologies, Tokyo Hitachi E102
Micropipette - For 1 mL, 200 μL, and 2 μL
Microcentrifuge Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo Capsulefuge, PMC-060
Stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. - SMZ 645
LED illumination for stereomicroscope Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. SM-LW 61 Ji
Disposable plastic container - 50 mL and 200 mL
Ethane gas - Cryogen
2 mL Eppendorf tubes - For embedding
Disposable plastic syringes - 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL
Magnetic stirrer -
Epoxy resin Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 340 Quetol 812 set
Silicon embedding mold Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 4217 7 mm in diameter, 13 mm deep
Incubater - For 37 °C and 60 °C
Trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Tilting mechanism equipped, Refer to this paper
LED illumination for trimming stage Sunmag Co. Ltd., Tokyo - Refer to this paper
Ultrasonic Trimming Blade Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 5240 EM-240, Refer to this paper
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna Ultracut S
Grids Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2633, 2634 300 mesh, 400 mesh
0.5% Neoprene W solution Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 605
Perfect Loop Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 2351 Fot retrieving sections
Half Tube for section staining Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo 463 Refer to this pape
Super Support Film Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo 647
Syringe filter Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo DISMIC-03CP Cellulose acetate, 0.45 μm
Transmission electron microscope JEOL Co. Ltd., Tokyo JEM-1400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, In Japanese 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235 (2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614 (2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893 (2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109 (2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699 (2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

Tags

Biologi utgave 173 elektronmikroskopi fryseerstatning glutaraldehydfast vev høytrykksfrysing isinnbygging levende celler dyppfrysing rask frysing prøvepreparering sandwichfrysingsenhet ultrastruktur ultratynne seksjoner
Rask frysing ved hjelp av sandwichfrysingsenhet for god ultrastrukturell bevaring av biologiske prøver i elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi,… More

Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Uematsu, K., Taguchi, M., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62431, doi:10.3791/62431 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter